未熟儿视网膜病和相关视网膜疾病的治疗方法

专利名称：：未熟儿视网膜病和相关视网膜疾病的治疗方法
技术领域：
：本发明涉及治疗一见网膜疾病的方法。更具体地，本发明涉及通过向患有或存在发展所述疾病的风险的哺乳动物的眼睛施用谱系(lineage)阴性造血干细胞来治疗未熟儿视网膜病和相关的视网膜疾病的方法。
背景技术：
：视网膜的血管疾病，包括糖尿病性视网膜病、渗出性年龄相关的黄斑变性(ARMD)、未熟儿视网膜病(ROP)和血管闭塞，是视觉缺陷和失明的主要原因。这组疾病是密集的研究的焦点，目的是鉴定帮助防止或改变病理性眼新血管形成的新的治疗方式。例如，ARMD影响了65岁以上的1200-1500万美国人，作为脉络膜(视网膜下)新血管形成的之间影响，引起他们中10-15%的视觉损失。65岁以下的美国人的视觉损失的主要原因是糖尿病；在美国，160万个体患有糖尿病，每年有40,000患有疾病的眼科并发症，通常是视网膜新血管形成的结果。虽然激光凝结术已经在高风险糖尿病患者的亚群中防止严重的视觉损失方面起到效果，总体上视网膜病的10年发病率基本上维持不变。对于由于ARMD或炎症性眼病，例如眼组织胞浆菌病而患有脉络膜新血管形成的患者，除了少数例外的，光凝结术在防止视觉损失方面是无效的。虽然近年来发展的无损的光动力学治疗有希望暂时降低患有先前不可治疗的脉络膜新血管形成的患者中的个体损失，与45.9%的安慰剂治疗的组相比，每3-4个月治疗的患者仅61.4%具有改善的或稳定的视力。年龄相关的黄斑变性和糖尿病性视网膜病是工业化国家中视觉损失的主要原因，这也是异常的视网膜新血管形成的结果。由于视网膜由界线分明的神经元层、神经胶质层和血管元件层组成，相对小的紊乱，例如在血管增殖或水胂中可见的那些，可以引起视觉功能的重大损失。遗传性的视网膜退化，例如色素性视网膜炎(RP)也与血管异常，例如小动脉狭窄和血管萎缩有关。虽然在鉴定促进和促进血管生成的因子方面取得了显著的进展，当前没有可用的治疗来特异性地治疗眼血管疾病。视网膜的遗传性退化影响了多达3500分之一的个体，其特征是渐进性的夜盲、视野损失、视神经萎缩、小动脉衰减、改变的血管通透性和常常发展到完全失明的中央视力损失(Heckenlivdy，J.R.，editor,1988;/e〃'wz7w尸zgwew/YM'(2，Philadelphia:JBLippincottCo.)。这些疾病的分子成因分析已经鉴定了超过110个不同基因中的突变，仅解释了已知的受影响个体中相对小的百分比(Humphries等人，1992，Scw"c'e256:804-808;Farrar等人.2002,EMBOJ.21:857-864.)。这些突变中的许多与光传导机制的酶和结构成分相关，包括视紫红质、cGMP磷酸二酯酶、rA外周蛋白和RPE65。尽管有这些观察结果，仍然没有有效的治疗来减緩或逆转这些视网膜退行性疾病的发展。当将野生型基因递送给具有特定突变的动物中的光受体或视网膜色素上皮(RPE)时，基因治疗中的新近的发展已经在小鼠的(Ali等人.2000,淑G匿L25:306-310)和rd表型中(Takahashi等人.1999，J.F,ra/.73:7812-7816)和在狗的RPE65表型中(Acland等人.2001，AW.28:92-95)产生了成功逆转。血管生成是新的血管形成的过程。响应于特定的化学信号，毛细管从现有的血管发芽，最终生长到有机体所需的大小。起初，排列成血管的内皮细胞在与现有相关垂直的方向上分裂，形成实心的芽。邻近的内皮细胞然后形成大的空泡，细胞重排，从而液泡自身端对端地定向，最终合并形成新毛细管的管腔(管形成)。血管生成由许多条件刺激，例如响应于伤口，在脊推动物有机体例如哺乳动物中实际上伴随这所有的组织生长。血管生成也在某些疾病状态，例如糖尿病性视网膜病和某些癌症中起到作用。例如，肿瘤的生长需要血管生长来向生长的肿瘤组织提供氧气和营养物。通过用刺激血管生成过程的化学信号来干扰，可以延滞或抑制血管生成。例如，血管生成性内皮细胞产生蛋白酶来消化围绕血管的基底膜，因而为新毛细管清除了路径。这些蛋白酶、或它们的形成的抑制可以防止新血管形成。同样地，内皮细胞增殖响应于化学信号。特别重要的增殖信号包括血管内皮生长因子(VEGF)和成纤维细胞生长因子(FGF)蛋白质家族。VEGF已经被证明涉及某些肿瘤的血管新生。对这些增殖信号传导过程的干扰也可以抑制血管生成。一些因子涉及血管生成。酸性和碱性成纤维细胞生长因子分子都是内皮细胞和其他细胞类型的促分裂素。对于血管内皮细胞高度选择性的促分裂素是血管内皮生长因子(VEGF)。在正常的成年人中，血管生成受到紧密调节，限于伤口愈合、妊娠和子宫周期。血管生成通过特定的血管生成分子，例如碱性和酸性成纤维细胞生长因子(FGF)、VEGF、血管生成素、转化生长因子(TGF)、肿瘤坏死因子-cc(TNF-a)和血小板衍生的生长因子(PDGF)来打开。血管生成可以通过抑制性分子例如干扰素-a、凝血栓蛋白-1、制管张素和内皮抑制素来抑制。这是控制通常静息的毛细血管系统的这些天然发生的刺激物和抑制物的平衡。当这种平衡被扰乱时，如在某些疾病状态中，毛细血管内皮细胞被诱导增殖、迁移并最终分化。血管生成在各种疾病包括癌症和眼新血管形成中起着重要作用。各种肺瘤的持续的生长和转移也已经显示取决于响应于胂瘤衍生的血管生成因子的新的宿主血管向肺瘤中的生长。如在大多数眼病中发现为显性的，发生了响应于各种刺激的新血管增殖，所述失明包括增殖性糖尿病性视网膜病、ARMD、rubeoticglaucoma、间质性角膜炎和未熟儿视网膜病。在这些疾病中，组织损伤可能刺激引起毛细管增殖的血管生成因子的释放。VEGF在虹膜新血管形成和新血管性视网膜病中起到重要作用。虽然报道清楚地显示了眼内VEGF水平和缺血性视网膜眼新血管形成之间的相关性，FGF可能起到了作用。已知碱性和酸性FGF存在于正常的成年人视网膜中，即使可检测的水平与新血管形成没有一致性地相关。这可能是主要由于FGF与细胞外基质的带点成分非常紧密地结合，可能是不容易在可以通过标准的眼内液体分析检测的游离可扩散形式下获得的。在血管生成响应中的最后的通用途径包括介导增殖性血管内皮细胞和细胞外基质之间的信息交换的整联蛋白。这种类型的粘附受体，称为整联蛋白，在所有细胞上被表达为具有oc和(3亚基的杂二聚物。一种这样的整联蛋白，ocvp3,是这个家族的最混杂的成员，容许内皮细胞与各种细胞外基质成分相互作用。这个整联蛋白的肽和抗体拮抗剂通过选择性地诱导增殖性血管内皮细胞的细胞凋亡来抑制血管生成。存在着血管生成的两种细胞因子依赖性途径，可以根据它们对不同的血管细胞整联蛋白ccv|33和av(35的依赖性来定义。具体地，碱性FGF和VEGF诱导的血管生成分别取决于整联蛋白cxv|33和cxJ35,因为在兔角膜和鸡胚绒毛尿嚢膜(CAM)模型中每种整联蛋白的抗体拮抗剂选择性地阻断这些血管生成途径之一。阻断所有av整联蛋白的肽拮抗剂抑制FGF-和VEGF-刺激的血管生成。虽然正常人眼睛血管不展示任何一种整联蛋白，avp3和av|35整联蛋白选择性在来自患有活动性新血管性眼病的患者的组织中的血管上展示。虽然在来自患有ARMD的患者的组织中仅一致地观察到ccv|33,av(33和cxv(35都存在于来自患有增殖性糖尿病性视网膜病的患者的组织中。全身性施用的整联蛋白的肽拮抗剂在视网膜血管发生的小鼠模型中阻断了新血管形成。通过在各种动物物种，例如小猫、猎兔犬小狗、大鼠和小鼠中氧诱导的视网膜病(OIR)模型的开发，测试用于视网膜新血管疾病的潜在治疗以及被大大地便利化了。在这些模型的每一种中，将新生的动物暴露于高氧(或暴露于交替的高氧和氧不足)例促使视网膜血管发育的退化或延迟，在它们回到正常的含氧水平之后产生异常的血管生成。这些模型反映了在未熟儿视网膜病(ROP)期间发生的事件，未熟儿—见网膜病是一种可以影响早产儿的涉及病理性新血管形成的状况。在过去的十年间，OIR的小鼠模型成为研究与氧诱导的视网膜病相关的异常血管生成的最常用的模型。在这个模型中血管异常的模式稍微不同于在ROP中观察的；在小鼠中，在暴露于高氧之后中央的、后部的视网膜变为无血管的，而在人类婴儿中外周部是无血管的。尽管如此，这是用于研究氧不足诱导的视网膜病的疾病机制和可能的治疗的公认的模型，血管改变是非常一致的、可重现的和可计量的。近年来，这个模型的使用已经扩展到缺血性视网膜并和相关的抗血管生成介入的一般研究中，现在它在基础和应用研究环境中广泛地使用。用于在小鼠OIR模型中定量增殖性新血管响应的历史上常见的方法是基于对从视网膜伸出到玻璃体("前内界膜(ILM)核，，)的新血管相关的细胞数目计数。这通常在靠近视盘的区域(但不是包括)中在径向横截面上进行。该方法是极度耗费劳力的、费时的，并且充满困难，包括需要从玻璃体的玻璃体血管的细胞中区分出异常血管的细胞。因为，一般地，仅评估每到第30个连续剖面，大部分的组织没有被定量，潜在地引入了大的采样误差。此外，由于整个眼睛被立即切片，它阻碍了这个模型的另一个重要参数的同一眼的评估，即，血管闭塞的程度和视网膜血管的再形成的速率，其在异常新血管簇形成之后发生。这个参数最好在视网膜的完整视网膜固定制品中评定。多年来，已知的是在正常的成年人循环和骨髓中存在干细胞的群体。这些细胞的不同亚群可以沿着造血谱系阳性(Lin+)或谱系阴性(Lin—)系统分化。此外，i普系阴性造血干细胞(HSC)群体近来显示了含有能够在体外和体内形成血管的内皮祖细胞(EPC)(参见Asahara等人.1997,Sc',e"ce275:964-7)。这些细胞可以参与正常的和病理的出生后血管生成(参见Lyden等人.2001tVw.Met/.7，1194-201;Kalka等人.2000，尸亂淑/.爿cat/.Scz.U.S.A.97:3422-7;和Kocher等人.2001，M/t7:430-6)以及分化成各种非内皮细胞类型，包括肝细胞(参见Lagasse等人.2000，iVa,.6:1229-34)、小胶质细胞(参见Priller等人.2002M^/.7:1356-61)、cardiomyocytes(参见Orlic等人.2001,尸厂oc.iVa,/.」cadSc/.U.S.A.98:10344-9)和上皮细胞(参见Lyden等人.2001,M/,.M^/.7:1194-1201)。虽然这些细胞已经在几个血管生成的实验模型中使用，EPC靶向新血管的机制是未知的，没有鉴定出能有效提高促进特定血管系统的细胞的策略。来自骨髓的造血干细胞是当前仅有的通常用于治疗应用的干细胞类型。骨髓HSC已经在移植中使用超过40年。当前，收获纯化的干细胞的改进的方法正在被研究，来开发用于白血病、淋巴瘤和遗传性血液失调的治疗的疗法。干细胞在人类中的临床应用已经被研究，用于在有限数量的人类患者中治疗糖尿病和进展的肾脏癌症。发明概述本发明提供了用于治疗未熟儿视网膜病(ROP)和相关的视网膜疾病的方法。所述方法包括向患有或存在风险发展出未熟儿视网膜病或相关视网膜疾病的哺乳动物的视网膜施用一定量的来自血管营养谱系阴性造血千细胞群体的细胞，有效促进视网膜的损伤区域的有益的生理学血管再形成和改善由所述疾病引起的对视网膜的损害。优选的，所述哺乳动物是人类患者。在一个优选的实施方式中，所述谱系阴性造血干细胞群体是包含造血干细胞和内皮祖细胞的谱系阴性造血干细胞群体(即，Lm-HSC)。在另一个优选的实施方式中，所述谱系阴性造血干细胞群体是分离的骨髓样骨髓(MLBM)细胞群体，其中大部分细胞是谱系阴性的，并且表达CD44抗原以及CDllb抗原。作为选择，用于新生儿的治疗，适合的语系阴性造血干细胞群体可以从脐带静脉血分离。优选的，施用给所述哺乳动物的细胞对于要治疗的个体哺乳动物是自体的。所述细胞优选的通过眼球内注射来施用。在优选的实施方式中，在疾病的早期将所述细胞施用给患有未熟儿视网膜病(ROP)的哺乳动物，例如人类婴儿。在另一个优选的实施方式中，在所述疾病的症状发作之前或婴儿暴露于高氧之前，作为预防性试剂，将所述细胞施用给存在发展ROP或相关视网膜状况的风险的哺乳动物。ROP的氧诱导的视网膜病(OIR)模型的结果表明，在患有视网膜疾病的哺乳动物的视网膜中，当前的治疗方法促进了治愈和血管再生。此外，由于所述细胞的神经营养性效果，所述方法促进了碎见觉神经元的再生。有益地，本发明的来自i普系阴性造血干细胞群体的细胞被4参入到视网膜的血管系统中并分化成内皮细胞，而同时掺入到神经元网络中并改善神经元细胞，例如视网膜中的视锥细胞的退化。分离的谱系阴性造血干细胞细胞群体包括当眼内注射到眼中时选择性地耙向活化的视网膜星形细胞，并且稳定地掺入到眼的新血管系统和神经元网络中的细胞。在又一个优选的实施方式中，使用治疗有用的基因转染来自谱系阴性造血干细胞群体的细胞。例如，所述细胞可以使用可操作地编码神经营养试剂等的多核苷酸转染，所述神经营养试剂等通过基于细胞的基因治疗形式选择性地靶向新血管系统并进一步促进有益的血管再形成和神经元发育。使用本发明的方法的眼治疗的特别的益处是在用来自谱系阴性造血干细胞群体的细胞眼内治疗的眼中观察到的血管营养和神经营养援救效果。在用来自本发明的细胞群体的细胞治疗的眼中，^L网膜神经元和光受体，特别是锥体被保存了，可以维持一些视觉功能的测量。优选的，要通过本发明的方法治疗的患病视网膜包括活化的星形干细胞群体的眼早期治疗，或者使用激光来刺激活化的星形细胞的局部增殖。附图的简要说明在附图中附图1描绘了发展小鼠视网膜的示意图，(a)原发丛的发育，(b)视网膜血管形成的第二阶段。GCL,神经节细胞层；IPL,内部丛层；INL，内核层；OPL,外部丛层；ONL,外核层；RPE，视网膜色素上皮细胞；ON,视神经；P，外周部。画面(c)描绘了骨髓衍生的Lin+HSC和LirfHSC分离的细胞的流动细胞计特征。顶部^f亍非抗体标记的细胞的点绘图分布，其中Rl是指阳性PE染色的可计量的门面积；R2代表GFP阳性；中间行Lin-HSC(C57B/6),和底端行Lin+HSC(C57B/6)细胞，每种细胞使用PE结合的、针对Sca漏l、c-kit、Flk-1/KDR、CD31的抗体标记。Tie-2数据获自Tie-2-GFP小鼠。百分比表示总Lin—HSC或Lm+HSC群体中阳性标记的细胞的百分比。附图2描绘了Lin-HSC向发育的小鼠视网膜中的嫁接，(a)四天后(P6)眼内注射的eGFP+Lm—HSC细胞在视网膜上粘附并分化，(b)Lin-HSC(B6.129S7-G加sa26小鼠，用p-gal抗体染色)自己建立，优于用胶原IV抗体染色的血管系统(星号代表血管系统的尖端)，(c)大多数Lm+HSC细胞(eGFP+)在注射(P6)后四天不能分化，(d)注射(P6)后四天的肠系膜的eGFP+鼠EC(e)注射到成年小鼠眼中的Lin-HSC(eGFP+)，(f)在GFAP-GFP转基因小鼠中归巢到并沿着先存的星形细胞模板分化的eGFP+Lin—HSC(箭头)的低放大图，(g)在Lin-细胞(eGFP)和底下的星形细胞(箭头)之间的联系的更高放大图，(h)未注射的GFAP-GFP转基因对照，(i)注射(P6)后四天，左图捕获了整个固Z的视;膜中的Lin—HSC活性;、右图指明了视网膜中Lirr细胞的位置(箭头)(顶部是玻璃体侧面，底部是巩膜侧面)，(J)使用oc-CD31-PE和cc-GFP-alexa488抗体的双标记。注射后七天，注射的Lin-HSCs(eGFP,红色)掺入到血管系统(CD31)中。箭头指出了掺入区域，(k)eGFP+Lin-HSC细胞在注射后十四天(P17)形成血管。(1和m)罗丹明-葡聚糖的心脏内注射表明血管在原发的(1)和深部丛(m)中都是完整的和功能性的。附图3显示了eGFP+Lin—HSC细胞靶向通过在成年人视网膜中激光(a)和机械(b)诱导的损伤(星号指示损害位点)诱导的神经胶质增生(由表达GFAP的星形细胞标明，远端左侧图像)。远端右侧图像是更高的放大率，表明了Lin-HSC和星形细胞的紧密相关。测径规=20nM附图4显示了Lin—HSC细胞援救视网膜退化小鼠的血管系统。(a-d)在注射后27天(P33)用胶原IV染色的视网膜；(a)和(b),用Lin+HSC细胞(BALB/c)注射的视网膜显示了在血管系统中与正常的FVB小鼠没有差异；(c)和(d)用Lm-HSC(BALB/c)注射的视网膜展现了类似于野生型小鼠的丰富血管网络；(a)和(c)，用DAPI染色的完整视网膜的冷冻切片(顶部是玻璃体侧面，底部是巩膜侧面)；(b)和(d),完整数量的视网膜的深部丛；(e)说明在注射Lin-HSC细胞的视网膜中形成的深部血管丛的血管分布提高的柱形图(n=6)。深部视网膜血管新生的程度通过计算每个图像内血管的总长度来确定。比较Lin-HSC、Lin+HSC或对照物、视网膜的血管/高倍视野的平均总长度(微米数)，(f)比较用来自小鼠的LmHSC(R，右眼)或Lin+HSC(L,左眼)细胞注射后深部血管丛的长度。显示了六只独立小鼠的结果(每种颜色代表独立的小鼠)，(g)和(h)当注射到P15眼中时Lm-HSC细胞也(BALB/c)援救了ra^t/血管系统。显示了Lin-HSC(G)或Lin+HSC(H)细胞注射的视网膜的中间和深部血管丛(注射液后一个月)。附图5描绘了小鼠视网膜组织的显微照片(a)视网膜完整固定物的深层(W/W小鼠)，用eGFP+Lin—HSC注射后五天(Pll)可见(灰色)，(b)和(c)在P6接受了BALB/cLin—细胞(b)或Lin+HSC细胞(c)注射的Tie-2-GFP(n//rJ)小鼠的P60视网膜血管系统。在(b)和(c)的左侧画面仅内源的内皮细胞(GFP染色的)是可见的。(b)和(c)的中间画面用CD31抗体染色；箭头指明用CD31而不是GFP染色的血管，(b)和(c)的右侧画面显示了同时用GFP和CD31染色。(d)LiifHSC注射的(左侧画面)和对照视网膜(右侧画面)的oc-SMA染色。附图6显示了T2-TrpRS转染的LirTHSC抑制小鼠视网膜血管系统的发育，(a)人类TrpRS、T^TrpRS和在氨基末端具有Igk信号序列的T2-TrpRS的示意图，(b)T2-TrpRS转染的Lm—HSC注射的视网膜体内表达T2-TrpRS蛋白质。(1)在E.coli中产生的重组T2-TrpRS;(2)在E.coli中产生的重组T2-TrpRS;(3)在E.coli中产生的重组T2-TrpRS;(4)对照一见网膜；(5)Lin—HSC+pSecTag2A(^又载体)注射的视网膜；(6)Lin-HSC+PKLel35(pSecTag中的Igk-T2-TrpRS)注射的^L网膜，(a)内源的TrpRS。(b)重组T2-TrpRS。(c)LiiTHSC注射的视网膜的T2-TrpRS,(c-f)注射后七天，注射的视网膜的代表性的原发(表面的)和继发(深部的)丛；(c)和(d)用空质粒转染的Lin-HSC注射的眼正常发育；(e)和(f)大部分T2-TrpRS转染的Lin-HSC注射的眼展现了深部丛的抑制作用；(c)和(e)原发(表面的)丛；(d)和(f)继发(深部的)丛)。在(f)中观察的血管的模糊轮廓是在(e)中显示的原发网络血管的"透背"图像。附图7显示了编码His6-标记的T2-TrpRS的DNA序列，SEQIDNO:1。附图8显示了编码His6-标记的T2-TrpRS的氨基酸序列，SEQIDNO:2。附图9说明了来自小鼠的视网膜的显微照片和视网膜电图(ERG)，所述小鼠的眼用LinHSC和Lm+HSC(对照)注射。附图10描绘了统计学标绘图，其显示用Lin—HSC处理的n/々t/小鼠眼的中间(Int.)和深部血管层的神经元援救(y轴)和血管援救(x轴)之间的相关性。附图11描述了统计学标绘图，其显示了在用Lin+HSC处理的W/raf小鼠眼的神经元援救(y轴)和血管援救(x轴)之间没有相关性。附图12是血管长度(y轴)的柱形图，在注射后1个月(1M)、2个月(2M)和6个月(6M)的时点用Lin-HSC处理的raf/W小鼠眼(黑色柱)和未处理的W/W小鼠眼(亮色柱)的任意相关单位中。附图13包括在注射后1个月(1M)、2个月(2M)和6个月(6M)的小鼠的外部神经层(ONR)中核数目的三个柱形图，表明了相对于用Lin+HSC处理的对照眼(亮色柱)的用Lin—HSC处理的眼(黑色柱)的核数目的显著提高。附图14描绘了在单个的W/k/小鼠中外部神经层中核数目的标绘图，在1个月(1M)、2个月(2M)和6个月(6M)的时点(注射后)相对于左眼(L，用Lm+HSC处理的对照眼)比较右眼(R，用Lin—HSC处理)。附图15描绘了在W//^//(C3H/HeJ，左侧画面)或野生型小鼠(C57BL/6,右侧画面)中视网膜的血管系统和神经细胞改变。显示了同一个视网膜的完整固定的视网膜(红色胶原IV,绿色CD31)和切片(红色DAPI,绿色CD31)中的中间(上画面)或深部(中间画面)血管丛的视网膜血管系统。(GCL:神经节细胞层，INL:内核层，ONL:外核层)。附图16显示了LmHSC注射援救了n/〃/Y//小鼠中的神经细胞退化。(A、B和C)在P30(A)、P60(B)和P180(C)的LinliSC注射的眼(右侧画面)和对侧的对照细胞(CD31—)注射的眼(左侧画面)的中间(Int.)或深部丛的视网膜血管系统和切片。(D)，在P30(左侧，n=10)、P60(中间，n=10)和P180(右侧、n=6)在Lm—HSC注射的或对照细胞(CD31-)注射的视网膜中的血管系统的平均总长度(+或-标准平均误差)。中间(Int.)和深部血管丛的数据单独地显示(Y轴血管系统的相对长度)。(E)，在P30(左侧，n=10)、P60(中间，n=10)或P180(右侧，n=6)的对照细胞(CD3r)或Lin-HSC注射的视网膜中ONL中细胞核的平均数量(Y轴ONL中细胞核的相对数量)。(F)，在Lm-HSC或对照细胞注射的视网膜的P30(左侧)、P60(中间)和P180(右侧)在ONL(Y轴)中血管系统长度(X轴)和细胞核数量之间的线性相关。附图17显示了通过Lin—HSC注射援救的视网膜功能。使用电视网膜图(ERG)记录来测量Lin-HSC或对照细胞(CD31-)注射的视网膜的功能。(A和B)，在注射后2个月援救的和非援救的视网膜的代表性实例。显示了同一动物的Lm-HSC注射的右眼(a)和CD31-对照细胞注射的左眼(B)的视网膜切片(绿色CD31染色的血管系统，红色DAPI染色的核)。(C)，在(A)和(B)中显示的同一动物的ERG结果。附图18显示了人类骨髓细胞的群体可以援救小鼠中的退化性视网膜(A-C)。这种援救也可以在另一个视网膜退化模型，W/0(D-K)中观察到。A,用绿色染料标记的人类Lm-HSC(hLm—HSC)可以在眼内注射到C3SnSmn.CB17-/V/WcSCID小鼠中之后分化成视网膜血管细胞。(B和C),在注射后].5个月在hLin-HSC注射的眼(B)或对侧的对照眼(C)中的^L网膜血管系统(左侧画面上部中间丛，下部深部丛)和神经细胞(右侧画面)。(D-K),通过Lin—HSC的/y//0小鼠援救(在P6注射)。显示了在P21(D:Lm—HSC，H:对照细胞)、P30(E:Lin—HSC,I:对照细胞)、P60(F:Lin—HSC，J:对照细胞)和P105(G:Lm-HSC,K:对照细胞)的代表性性视网膜(在每个时点处理的和对照眼来自同一动物)。用CD31(绿色)和月交原IV(红色)对视网膜血管系统染色(每个画面中的上部图像是中间丛；每个画面中的中间图像是深部丛)。每个画面中的下部图像显示了从同一视网膜制成的横切片(红色DAPI,绿色CD31)。附图19表明了在用LiifHSC处理之后在援救的外核层细胞中晶状体蛋白aA被增量调节，而在用对照细胞的对侧眼中没有。左侧画面在援救的视网膜中的IgG对照，中间画面援救的视网膜中的晶状体蛋白ocA，右侧画面在非援救的视网膜中的晶状体蛋白ocA。附图20包括在用本发明的Lm-HSC处理的鼠视网膜中增量调节的基因的表格。(A)在用鼠Lin-HSC处理的小鼠视网膜中表达被增加3倍的基因。(B)在用鼠LirfHSC处理的小鼠视网膜中增量调节的晶状体蛋白基因。(C)在用人类Lin-HSC处理的小鼠视网膜中表达被增加2倍的基因。(D)在用人类Lin-HSC处理的小鼠视网膜中表达被增量调节的神经营养因子或生长因子的基因。附图21说明了在CD133阳性(CD133+)和CD133阴性(CD133—)人类Lin-HSC群体上CD31和整联蛋白oc6表面抗原的分布。左侧画面显示了流式细胞计散布图。中央的和右侧画面是显示在所述细胞群体上的特异性抗体表达水平的直方图。Y轴代表事件的数目，X轴显示了信号的强度。在所列的(对照)直方图的右侧的填充的直方图代表提高的荧光信号和在背景水平上的抗体表达。附图22说明了在出生后P0到P30在正常氧水平(氧正常)中产生的野生型C57/B16小鼠中的出生后视网膜发育。附图23说明了在P7和P12之间的高氧水平(氧过多；75%氧)，随后P12-P17的氧正常中产生的C57/B16小鼠中的氧诱导的视网膜病模型。附图24说明了在氧-的视网膜病(OIR)模型中通过用Lin-HSC群体治疗的血管援救。附图25显示了在Lm-HSC眼内注射之后在小鼠外核层(ONL)中援救的光受体主要是锥体。在野生型小鼠视网膜中小百分比的光受体是锥体(上部画面)，这通过红色/绿色锥体视蛋白的表达证明了(A)，而ONL的大多数细胞对于rod特异性视紫红质是阳性的(B)。视网膜血管系统使用预免疫血清自体发荧光(C)，但是核层对于用rod或锥体特异性视蛋白染色是完全阴性的。^//W小鼠视网膜(下部画面)具有减少的内核层和几乎完全萎缩的ONL，两者对于锥体(D)或rod(画面G)视蛋白都是阴性的。对照，CD31—HSC处理的眼与未注射的W/W视网膜一致，对于锥体(E)或rod(H)一见蛋白没有任何染色。Lin-HSC处理的对侧眼展现了显著降低的，但清楚呈现的主要由锥体组成的ONL，由对于锥体红色/绿色视蛋白的阳性免疫反应性证明(F)。还观察到少量的rod(1)。附图26显示了谱系阴性和谱系阳性干细胞群体的流式细胞计特征的散布图(分布为上左和下左图)，显示了表达CD44抗原的细胞的百分比(红色的数据点)；以及CD31阴性和CD31阳性细胞群体(分别为上右和下右图)，显示了表达CD44抗原的细胞的百分比(红色的数据点)。附图27显示了来自表达显著性水平的CD44抗原的谱系阴性细胞群体(图的左侧组)和不表达显著水平CD44抗原的骨髓细胞亚群(图的右侧组)的流式细胞计特征散布图，说明了表达各种其他的细胞表面抗原的细力包的相对百分比。附图28显示了与用CD441。细胞眼内注射的小鼠的视网膜相比，用来自优选分离的MLBM细胞群体的细胞眼内注射的小鼠(左侧画面)的视网膜的显微照相图像。附图29显示了用来自MLBM细胞群体(CD44hi)的细胞和用CD441。细胞注射的眼的视网膜的显微照相图像。附图30显示了柱形图，说明了MLBM细胞群体在未熟儿视网膜病的氧诱导的视网膜病模型中改善病理性血管发生并且促进小鼠视网膜的有益生理性血管再形成的有益效果。上部图表比较了对照视网膜(第一柱)、用CD44'。细胞处理的视网膜(中间柱)和用来自MLBM细胞群体的细胞处理的视网膜(右侧柱)的前—见网膜新血管丛。下部图表比较了对照视网膜(第一柱)、用CD44'。细胞处理的视网膜(中间柱)和用来自MLBM细胞群体的细胞处理的视网膜(右侧柱)的血管闭塞区域。附图31是显微照相图像，表明了一旦来自MLBM细胞群体的细胞掺入到视网膜的血管系统中，细胞表达血管内皮生长因子(VEGF)，如在图像的下部中细胞的绿色染色所表明的。附图32描述了显微照相图像，表明来自本发明的CDllb—MLBM细胞群体的细胞选择性地耙向视网膜的血管系统。附图33描绘了显微照相图像，表明CD44-CDllb+骨髓细胞不选择性地耙向视网膜的血管系统。附图33描绘了显微照相图像，表明CD44-CDllb+骨髓细胞不选择性地靶向视网膜的血管系统。附图34显示了TrpRS的T2片段(SEQIDNO:3)和其T2-TrpRS-GD变体(SEQIDNO:4)的氨基酸残基序列。附图35显示了mmi-TrpRS的氨基酸残基序列(SEQIDNO:5)。附图36显示了Tl-TrpRS的氨基酸残基序列(SEQIDNO:6)。优选实施方式的详细说明骨髓包括能够发育成各种血细胞类型，例如B细胞、T细胞、粒细月包、血小板和红血球的造血干细胞。谱系表面抗原是一组细胞表面蛋白质，其是成熟的血细胞谱系的标志，包括CD2、CD3、CDll、CDlla、Mac-l(CDllb:CD18)、CD14、CD16、CD19、CD24、CD33、CD36、CD38、CD45、CD45RA、鼠Ly-6G、鼠TER國119、CD56、CD64、CD68、CD86(B7.2)、CD66b、人类白细胞抗原DR(HLA-DR)和CD235a(GlycophorinA)。在它们的细胞表面不表达显著性水平的"谱系表面抗原"(Lin)的分离的造血干细胞在此被称为"谱系阴性"或"Lin—"造血干细胞，即，LinliSC。人类造血干细胞通常表达其他表面抗原，例如CD31、CD34、CD117(c-kit)和/或CD133。鼠的造血干细胞通常表达其他表面抗原例如CD34、CD117(c-kit)、Thy-l和/或Sca-l。骨髓细胞包括表达CD44抗原(即，透明质酸受体)和CDllb(整联蛋白ocM)的细胞亚群。在CD44和CDllb表达细胞中富集的骨髓细胞的骨髓样群体可以通过用针对CD44抗原的抗体(抗-CD44)和/或针对CDllb抗原的抗体(抗-CDllb)处理骨髓细胞，然后选择与所述抗体免疫反应的细胞来从骨髓中分离。然后可以通过本领域公知的方法来从细胞上除去抗体。例如，通过流式细胞计，使用结合于或包被在珠子上的抗体，随后过滤，或本领域公知的其他分离方法，可以挑选细胞。大多数挑选的细胞是谱系阴性的，并且表达CD44抗原和CDUb抗原，无论在分离中使用哪种抗体。纟田的i仑述参见StemCells:ScientificProgressandFutureDirections,areportpreparedbytheNationalInstitutesofHealth,OfficeofSciencePolicy,June2001,AppendixE:StemCellMarkers,通过引用合并在此达到相关的程度)。从骨髓的大约75%的谱系阴性造血干细胞也是CD44阳性的。在优选的实施方式中，大多数来自MLBM细胞群体的细胞是谱系阴性造血干细胞(即，CD44+Lin—HSC)。如在此和附随的权利要求中使用的，用语"成年"是指骨髓和骨髓细胞，包括出生后分离的，即，来自青少年和成年个体的骨髓，与来自胚胎的相对。因而，术语"成年哺乳动物"是指青少年(出生后的)和完全成熟的哺乳动物，与胚胎或出生前的个体相对。含有内皮祖细胞(EPC)的LiiVHSC群体在本发明的方法中是特别有用的。分离的Lin-HSC群体优选的包括哺乳动物细胞，其中至少约20%的细胞表达表面抗原CD31,所述CD31通常在内皮细胞上呈现。在其他实施方式中，至少约50%的所述细胞表达CD31，更优选的至少约65%,最优选的至少约75%。优选的至少约50%的本发明的Lin-HSC群体的细胞优选地表达整联蛋白oc6抗原。在另一个优选的鼠Lin-HSC群体中，至少约50。/。的细胞表达CD31抗原，至少约50%的细胞表达CD117(c-kit)抗原。优选的，至少约75%的Lin-HSC细胞表达表面抗原CD31,更优选的为约81%的所述细胞。在另一个优选的鼠的实施方式，至少约65%的所述细胞表达表面抗原CD31，更优选的为约70%的所述细胞。本发明的特别优选的实施方式是LirTHSC的群体，其中约50%到约85%的细胞表达表面抗原CD31并且约70%到约75%的细胞表达表面抗原CD117.在优选的人类Lin-HSC群体中，细胞是CD133阴性的，至少约50%的细胞表达CD31表面抗原，至少约50%的细胞表达整联蛋白a6抗原。又一个优选的实施方式是人类Lin-HSC群体，其中细胞是CD133阳性的，其中少于约30%的细胞表达CD31表面抗原，少于约30%的细胞表达整l关蛋白a6抗原。当眼内注射到分离出所述细胞的哺乳动物物种，例如小鼠或人类的眼中时，本发明的分离的Lin-HSC群体选择性地靶向星形细胞并且掺入到视网膜的新血管系统中。当眼内注射到分离出所述细胞的哺乳动物物种，例如小鼠或人类的眼中时，分离的MLBM细胞群体也选择性地耙向星形细胞并且掺入到视网膜的新血管系统中。所述分离的MLBM细胞群体包括分化成内皮细胞并且在视网膜内产生血管结构的细胞。特别地，MLBM细胞群体对于治疗视网膜新血管和视网膜血管退行性疾病，以及对于视网膜血管损伤的修复是有用的。MLBM细胞群体还促进视网膜中的神经元援救，并促进抗细胞凋亡基因的增量调节。本发明的MLBM细胞群体对于治疗新生哺乳动物，例如患有氧诱导的—见网膜病或未熟儿浮见网膜病的哺乳动物的眼中的视网膜缺陷是特别有用的。作为选择，对于新生儿的治疗，分离自脐带静脉血的血管营养性i普系阴性造血干细胞群体可以代替骨髓衍生的干细胞群体来使用。本发明提供了在哺乳动物中治疗未熟儿视网膜病和相关疾病，例如氧诱导的视网膜病的方法。所述方法包括向患有或存在风险发展出未熟儿视网膜病或相关视网膜疾病的哺乳动物的视网膜施用一定量的来自血管营养性谱系阴性造血干细胞群体的细胞，有效促进视网膜的损伤部分的有益的生理学血管再形成。优选的，所述哺乳动物是人类患者。在一个优选的实施方式中，所述谱系阴性造血干细胞群体是包括如上文描述的内皮祖细胞的Lin—HSC群体，例如骨髓衍生的群体。在另一个优选的实施方式中，所述谱系阴性造血千细胞群体是分离的骨髓样骨髓(MLBM)衍生的细胞群体，其中大部分细胞是谱系阴性的，并且表达CD44抗原以及CDllb抗原。优选的，施用给所述哺乳动物的细胞对于要治疗的个体哺乳动物是自体的。所述细胞优选的通过眼球内注射来施用。在优选的实施方式中，在疾病的早期将所述细胞施用给患有未熟儿视网膜病(ROP)的哺乳动物，例如人类婴儿。在另一个优选的实施方式中，在暴露于高氧之前或在疾病的症状发作之前，作为预防性试剂，将所述细胞施用给存在发展ROP或相关视网膜状况的风险的哺乳动物。注射到眼中的来自语系阴性造血干细胞群体的细胞数量足以延滞眼的疾病状态。例如，注射的细胞的数量对于修复眼的视网膜损伤、稳定视网膜的新血管系统、成熟视网膜的新血管系统以及防止或修复血管渗漏和血管出血是有效的。本发明的来自谱系阴性造血干细胞群体的细胞可以用治疗有用的基因转染，例如编码抗血管生成蛋白的基因用于眼睛的基于细胞的基因治疗和编码神经营养试剂的基因来增强神经元援救效果。基因。在一个优i的实施方式中，转染的细胞包括一种基因，其可操作地编码抗血管生成肽，包括蛋白或蛋白片段，例如TrpRS的抗血管生成(即，血管静止)片段，例如TrpRS的Tl和T2片段，其在自有的共同待决U.S.专利申请系列号NO.10/080,839中详细描述，其公开内容通过引用合并在此。本发明的编码抗血管生成肽的转染的细胞对于视网膜疾病，包括异常的血管发育，例如糖尿病性视网膜病和类似疾病的治疗是有用的。优选的，所述细胞群体是人类细胞的群体。在另一个优选的实施方式中，转染的细胞包括可操作编码神经营养试剂的基因，所述神经营养试剂例如神经生长因子、神经营养素-3、神经营养素-4、神经营养素-5、纤毛神经营养因子、视网膜色素上皮衍生的神经营养因子、胰岛素样生长因子、胶质细胞系衍生的神经营养因子、脑衍生的神经营养因子，等等。这种神经营养细胞对于促进视网膜神经元退行性疾病例如青光眼和色素性视网膜炎中的神经元援救，在对于视网膜神经损伤的治疗，等等中是有用的。纤毛神经营养因子的植入已经报道了对于色素性视网膜炎的治疗是有用的(参见Kirby等人.2001，tUo/T7zw3(2):241-8;Farrar等人.2002,EA^(9Jowr憩/21:857-864)。脑衍生的神经营养因子据报道调节了受损的视网膜神经节中的生长相关的基因(参见Fournier,W1997,147:561-572)。胶质细胞系衍生的神经营养因子据报道延迟了色素性视网膜炎中的光受体退化(参见McGee等人2001,Mo/7Tz^4(6):622-9)。优选的，来自谱系阴性造血千细胞群体的至少约lxl()s个细胞通过眼内注射施用到患有视网膜退行性疾病的哺乳动物眼中。要注射的细胞数量可以取决于视网膜退化的严重度，哺乳动物的年龄和对于视网膜疾病治疗领域的普通技术人员显而易见的其他因素。来自i普系阴性造血干细胞群体的细胞可以根据负责治疗的临床医师确定的，以单次剂量或在一定时期内通过多次剂量来施用。ROP的OIR模型的结果表明，使用本发明的方法的治疗的特别的益处是在用来自谱系阴性造血干细胞群体的细胞眼内治疗的眼中观察到的血管营养和神经营养性援救效果。在用来自本发明的谱系阴性造血干细胞群体的细胞治疗的眼中，视网膜神经元和光受体，特别是锥体被保存了，可以维持一些视觉功能的测量。使用血管生成抑制物的治疗不会阻断谱系阴性造血干细胞群体的治疗效果。巨噬细胞样像与援救的血管一同被观察到，表明在免疫细胞和谱系阴性骨髓细胞之间在所述谱系阴性细胞的血管营养活性方面的可能的联系。然而，在P7和P17注射针对CD18的抗体来降低血管的巨噬细胞外渗不会阻断错系阴性造血干细胞的援救效果。在又一个优选的实施方式中，在疾病的发作之前或在其早期注射细胞来保护视网膜免于损伤，如果未治疗所述眼，所述损伤将接下来发生。在要治疗的哺乳动物已知处于发展未熟儿视网膜病、氧诱导的视网膜病或其他网膜疾病的风险中时，这种预防性治疗是特别可取的。在当前的方法中预防性治疗是特別有效的，因为谱系阴性细胞群体在眼中的存在实际上降低了对视网膜的血管损害的严重度，可以在损伤发生前延緩疾病，与仅仅促进从损伤的恢复是相对的。例如，在OIR模型中，在高氧暴露之前在P3和P7用Lin-HSC注射的小鼠，与在高氧暴露之后注射的小鼠相比，具有较少的视网膜损伤和更快的恢复。此外，在高氧暴露期间处理的小鼠也展现了加速的恢复。鼠的视网膜血管的发育眼血管生成的模型。小鼠眼提供了用于哺乳动物视网膜血管的发育，例如人类视网膜血管发育的公认的模型。在鼠视网膜血管系统发育期间，缺血驱动的视网膜血管发育与星形细胞紧密相关。这种神经胶质元件在三个月的人类胎儿或新生的啮齿动物中从视觉芽沿着神经节细胞层并且散布放射地迁移到视网膜上。随着鼠视网膜血管系统的发育，内皮细胞利用这种已经安置的星形细胞模板来确定视网膜血管图型(参见附图1(a和b))。附图1(a和b)描绘了发育中的小鼠视网膜的示意图。画面(a)描绘了在星形细胞模板(亮线)上叠加的原发丛(在图形的左上的暗线)的发育，而(b)描绘了视网膜血管形成的第二阶段。在附图1中，GCL代表神经节细胞层；IPL代表内部丛层；INL代表内核层；OPL代表外部丛层；ONL代表外核层；RPE代表视网膜色素上皮细胞；ON代表视神经；P代表外周部。出生时，视网膜的血管系统实际上是不存在的。到出生后14天(P14),视网膜发育了复杂的原发(表面的)和继发(深部的)的视网膜血管层，与视力的发展一致。起初，轮辐样视乳头周血管在先存的星形细胞网络上朝向外周部放射地生长，通过毛细管丛形成变得逐渐地互连。这些血管作为单层在神经纤维内生长直到PIO(附图l(a))。在P7-P8之间，侧面分支开始从这些原发丛发芽并且穿透进入视网膜到达外网织层，在此它们形成继发的、或深部的视网膜丛。到P21,整个网络经历了扩大的改变，第三的、或中间的丛在内核层的内表面形成(附图1(b))。由于几个理由，新生小鼠视网膜血管生成模型对于研究HSC在眼血管生成期间的作用是有用的。在这个生理学相关的模型中，在内源血管出现之前存在大的星形细胞模板，允许评估在新血管过程期间细胞-细胞靶向的作用。此外，这种一致性和重现性的新生浮见网膜的血管过程已知是缺氧驱动的，在这点上与其中已知缺血起到作用的许多视网膜疾病具有相似点。从骨髓富集内皮祖细胞(EPC)虽然细胞表面标志表达已经在HSC的制品中发现的EPC群体上被广泛地评估，唯一地鉴定EPC的标志仍未充分地确定。为了富集EPC,造血系统标志物阳性细胞(Lin+),即，B淋巴细胞(CD45)、T淋巴细胞(CD3)、粒细胞(Ly-6G)、单核细胞(CD11)和红血球(TER-119)从小鼠的骨髓单核细胞中耗尽。使用Sca-1来进一步富集EPC。在相同数量的LiifSca-l+细胞或Lin-细胞的眼内注射之后获得的结果比较，在两个组之间没有检测到差异。实际上，当仅注射Lin-Sca-r细胞时，观察到对发育中的血管的更大的掺入。根据功能性分析，用EPC富集Lin-HSC群体。此外，Lin+HSC群体在功能上与LiiVHSC群体表现得完全不同。还评估了通常用于鉴定每个级分的EPC的表位(根据以前在体外表征研究中报道的)。虽然这些标志物都不专有地与Lin-级分相关，与Lin+HSC级分相比，它们在Lm-HSC中都提高了约70到约1800%(附图1(c))。附图1,画面(c)说明了骨髓衍生的Lin+HSC和Lm—HSC分离的细胞的流动细胞计特征。画面(c)的上行显示了无抗体标记的细胞的造血干细胞点绘分布。Rl定义了阳性PE染色的可测量的门面积；R2代表GFP阳性。Lm-HSC的点绘图在中间行显示，Lm+HSC的点绘图在底端行显示。用针对Sca-l、c-kit、Flk-1/KDR、CD31的PE结合的抗体标记C57B/6细胞。Tie-2数据获自Tie-2-GFP小鼠。在点绘图的边角的百分比表示总LirT或Lin+HSC群体中阳性标记的细胞的百分比。有趣地，公认的EPC标志物如Flk-1/KDR、Tie-2和Sca-1贫乏地表达，因而没有用于进一步的分级。通过(a)从成年哺乳动物提取骨髓；(b)从所述骨髓分离大量的单核细胞；(c)用生物素结合的、针对一种或多种谱系表面抗原的谱系组抗体标记所述单核细胞，所述谱系表面抗原优选的是选自由CD2、CD3、CD4、CDll、CDlla、Mac-l、CD14、CD16、CD19、CD24、CD33、CD36、CD38、CD45、Ly-6G(鼠的)、TER-119(鼠的)、CD45RA、CD56、CD64、CD68、CD86(B7.2)、CD66b、人白细月包抗原DR(HLA-DR)和CD235a(GlycophormA)构成的组的谱系表面抗原；(d)从所述大量单核细胞中除去对于所述一种或多种谱系表面抗原是阳性的单核细胞；以及(e)从中回收谱系阴性造血干细胞的群体，可以分离LiiTHSC。当Lm-HSC是从成年人类骨髓分离时，优选的，用生物素结合的、针对谱系表面抗原CD2、CD3、CD4、CDlla、Mac-l、CD14、CD16、CD19、CD33、CD38、CD45RA、CD64、CD68、CD86(B7.2)和CD235a的谱系表面抗原的谱系组抗体来标记所述单核细胞。当Lin-HSC是从成年鼠骨髓分离时，优选的，用生物素结合的、针对谱系表面抗原CD3、CDll、CD45、Ly-6G和TER-119的谱系组抗体来标记所述单才亥纟田月包。眼内注射的HSCLin-细胞含有靶向星形细胞并掺入到发育中的视网膜血管系统内的EPC为了确定眼内注射的Lin—HSC是否可以靶向视网膜的特定细胞类型、利用星形细胞模板并且参与视网膜血管生成，来自本发明的Lm-HSC组合物的约105个细胞或从成年小鼠(GFP或LacZ转基因的)的骨髓分离的Lin+HSC细胞(对照，约105个细胞)注射到出生后2天(P2)的小鼠眼中。注射后四天(P6)，来自本发明的Lin—HSC组合物的许多细胞，来自GFP或LacZ转基因小鼠的许多细胞附着到视网膜上，并具有特征性的长形内皮细胞外观(附图2(a))。附图2说明了Lm—细胞向发育中的小鼠视网膜中的嫁接。如附图2画面(a)所示，四天后(P6)眼内注射的eGFP+Lin—HSC在视网膜上附着并分化。在视网膜的许多区域中，表达GFP的细胞按照符合底层星形细胞和类似的血管的图型分布。这些焚光细胞在内源的、发育性血管网络之前被观察到(附图2(b))。相反，仅少量的Lin+HSC(附图2(c))或成年小鼠肠系膜内皮细胞(附图2(d))附着于视网膜表面。为了确定来自注射的Lm-HSC群体的细胞是否也可以附着到具有已经建立的血管的视网膜上，将Lin-HSC组合物注射到成年眼中。有趣地，没有观察到细胞附着到视网膜并掺入建立的、正常的视网膜血管(附图2(e))。这表明，本发明的Lin-HSC组合物不破坏正常发育的血管系统，将不会在正常发育的视网膜中启动异常的血管新生。为了确定在注射的Lin—HSC组合物和视网膜星形细胞之间的关系，使用转基因小鼠，其表达神经胶质纤丝酸性蛋白(GFAP，星形细胞的标志物)和启动子驱动的绿色荧光蛋白(GFP)。用来自eGFP转基因小鼠的LirTHSC注射的这些GFAP-GFP转基因小鼠的视网膜的检查表明了注射的eGFPEPC与现存星形细胞的共同定位(附图2(f-h)箭头)。eGFP+LirTHSC的步骤被观察到符合底层的星形细胞网络(箭头，附图2(g))。这些眼的检查表明，注射的、标记细胞仅仅附着于星形细胞；在P6小鼠视网膜中，视网膜外周部还没有内源的血管，注射的细胞被观察到在这些尚为血管化的区域中附着于星形细胞。令人惊讶地，在视网膜的更深层中在精确的位置观察到注射的、标记的细胞，在此正常的视网膜的血管将随后发展(附图2(i),箭头)。为了确定注射Lin-HSC是否稳定地掺入发展中的视网膜血管系统，在以后的几个时点检查视网膜的血管。早在P9(注射后七天)，Lin—HSC就掺入到CD31+结构中(附图2(j))。到P16(注射后14天)，细胞已经广泛地掺入到视网膜的血管样结构中(附图2(k))。当在处死动物之前眼内注射罗丹明-葡聚糖时(来鉴定功能性的视网膜血管)，大部分Lm-HSC沿着显箸的血管排列(附图2(j))。观察到两种图型的标记细胞分布(l)在一个图型中，细胞沿着血管在未标记内皮细胞中间散布，以及(2)另一个图型显示了血管完全由标记的细胞组成。注射的细胞还掺入到深部血管丛的血管中(附图2(m))。虽然早先已经报道了LirTHSC衍生的EPC对新血管系统的零星掺入，这是血管网络完全由这些细胞组成的首次报道。这表明，眼内注射的、来自骨髓衍生的LiiTHSC的群体的细胞可以有效地^参入到成形中的^L网膜血管丛的任何层中。当在眼内注射达5或10天之后，非视网膜组织(例如，脑、肝脏、心脏、肺、骨髓)的组织学检查没有显示任何GFP阳性细胞的存在。这表明，Lm-HSC级分内的细胞亚群选择性地乾向视网膜星形细胞并且稳定地掺入发育中的视网膜血管系统。由于这些细胞具有内皮细胞的许多特征(与视网膜星形细胞相关，长形的形态，稳定地掺入明显的血管并且不在血管外的位置出现)，这些细胞代表了在Lin-HSC群体中存在的EPC。被靶向的星形细胞是在许多低氧视网膜病中观察到的相同类型。公知的是，胶质细胞是在DR和其他形式的视网膜损伤中观察到的丛的新血管蕨叶的主要成分。在活性神经胶质增生和缺血诱导的新血管形成的状况下，活化的星形细胞增殖、产生细胞因子并且增量调节GFAP,类似于在许多哺乳动物物种包括人类中在新生儿牙见网膜血管模板形成期间所观察到的。Lin-HSC群体在成年小鼠眼中将如同在新生儿眼中一样靶向活化的星形细胞，将Lin-HSC细胞注射到具有被光凝结(附图3(a))或针尖(附图3(b)损伤的视网膜的成年眼中。在两种模型中，仅在损伤位点周围观察到具有显著GFAP染色的细胞显著的(附图3(a和b))。来自注射的Lin-HSC组合物的细胞定位到损伤位点并保持了与GFAP阳性星形细胞的特异性相关(附图3(a和b))。在这些位点，还观察到Lm-HSC细胞以类似于在深部视网膜血管系统的新生形成期间观察到的水平迁移到视网膜的更深层。未受损的视网膜部分不含有Lin-HSC细胞，与当Lin-HSC被注射到正常的未受损成年视网膜中观察到的向(附图2(e))。这些数据表明，Lin-HSC组合物可以在具有神经胶质增生的受损成年视网膜中以及经历血管新生的新生视网膜中选择性地耙向胶质活化的胶质细胞。眼内注射的LinHSC可以援救和稳定退化的血管系统由于眼内注射的Lin-HSC组合物耙向星形细胞并掺入到正常的一见网膜血管系统中，这些细胞在与神经胶质增生和血管退化相关的缺血性或退化性视网膜疾病中也稳定了退化的血管系统。W/ra小鼠是视网膜退化的模型，其在出生后一个月展现了光受体和视网膜血管层的深度退化。这些小鼠中的视网膜血管系统通常发展直到P16,此时更深的血管丛退化；在大多数小鼠中，深部的和中间丛到P30几乎完全退化。为了确定HSC是否可以援救退化的血管，Lm+或Lm—HSC(来自Balb/c小鼠)在P6目艮内注射到W/厂J小鼠中。到P33,在用Lin+细胞注射后，深部视网膜层的血管几乎完全缺失(附图4(a和b))。相比之下，到P33大多数Lin-HSC注射的视网膜具有几乎正常的视网膜血管系统，具有三个平行的、良好形成的血管层(附图4(a和b))。这种效果的定量表明，在Lm—注射的W/k/眼中深部血管丛的血管平均长度是未处理的或Lin+细胞处理的眼中的几乎三倍(附图4(e))。令人惊讶地，来自成年小鼠(FVB/N)骨髓的Lin-HSC组合物的注射也援救了退化的W/W新生小鼠视网膜血管系统(附图4(f))。小鼠眼中血管系统的退化早在出生后2-3周被观察到。迟至P15注射Lin-HSC在W/W小鼠中也引起了退化的血管系统的部分稳定达至少一个月(附图4(g和h))。注射到较年轻的(例如，P2)W/raM、鼠中的Lin-HSC组合物也掺入到发育中的表面血管系统内。到Pll，观察到这些细胞迁移到深部血管丛的水平并形成与在野生型的外视网膜血管层中观察的相同的图型(附图5(a))。为了更清楚地说明细胞从注射的Lin—HSC组合物掺入到并且稳定W/raM、鼠中退化的视网膜血管系统的方式，来自Balb/c小鼠的Lin-HSC组合物被注射到Tie-2-GFPFVB小鼠眼中。FVB小鼠具有W/W基因型并且由于它们表达融合蛋白Tie-2-GFP,所有的内源血管是荧光的。当来自Lin-HSC组合物的未标记的细胞被注射到新生儿Tie-2-GFPFVB眼中并随后掺入到发育的血管系统中时，在内源的、Tie-2-GFP标记的血管中将有未标记的缺口，其相应于注射的掺入的、未标记的LiifHSC。随后用另一中血管标志物(例如，CD-31)染色则描绘了整个血管，允许确定非内源的内皮细胞是否是血管系统的部分。注射后两个月，在用Lm-HSC组合物注射的眼的视网膜中观察到CD31阳性的、Tie-2-GFP阴性的血管(附图5(b))。有趣地，大部分援救的血管含有Tie-2-GFP阳性细胞(附图5(c))。通过对平滑肌肌动蛋白的染色确定的，外膜细胞的分布没有被Lm-HSC注射改变，无论是否存在血管援救(附图5(d))。这数据清楚地表明，眼内注射的Lin—HSC细胞迁移到视网膜中，参与正常视网膜血管的形成，并且在遗传缺陷的小鼠中稳定内源的退化血管系统。来自Lin-HSC的转染的细胞对视网膜血管生成的抑制作用大部分视网膜血管疾病涉及异常的血管增殖而不是退化。靶向星形细胞的转基因细胞可以用于释放抗血管生成蛋白质并抑制血管生成。来自Lin-HSC组合物的细胞用T2-色氨酰-tRNA合成酶(T2-TrpRS)转染。T2-TrpRS是TrpRS的43kD片段，其强力地抑制视网膜血管生成(附图6(a)和附图34)。在P12,在P2用对照质粒(无T2-TrpRS基因)转染的Lin-HSC组合物注射的眼的视网膜具有正常的原发(附图6(c))和继发(附图6(d))的视网膜血管丛。当T2-TrpRS转染的本发明的Lin-HSC组合物被注射到P2眼中并在10天后评估时，原发网络具有显著的异常(附图6(e))，深部视网膜血管系统的形成被几乎完全地抑制(附图6(f))。在这些眼中观察到的少数血管被显著地衰减，在血管之间具有大的缺口。分泌T2-TrpRS的LinHSC的抑制作用程度在表1中详述。T2-TrpRS通过Lin-HSC组合物中的细胞在体外产生和分泌，在将这些转染的细胞注射到玻璃体中之后，在视网膜中观察到T2-TrpRS的30kD片段(附图6(b))。这种30kD片段仅在用转染的Lin—HSC注射的视网膜中特异性地观察到，与重组的或体外合成的蛋白质相比表观分子量的降低可能是由于T2-TrpRS的体内加工或降解。这些数据表明，Lin—HSC组合物可以用于通过靶向活化的星形细胞将功能上活性的基因，例如表达血管静止分子的基因释放到视网膜血管系统中。虽然有可能观察到的血管静止效果是由于细胞介导的活性，这是很不可能的，因为用相同的、但未用T2转染的Lm-HSC组合物处理的眼具有正常的—见网膜血管系统。表1.分泌T2-TrpRS的LirVHSC的血管抑制作用<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>眼内注射的Lin-HSC群体定位到视网膜星形细胞上，掺入到血管中，并且在治疗许多视网膜疾病中是有用的。虽然来自注射的HSC组合物的大多数细胞附着于星形细胞模板上，少量的细胞深部迁移到视网膜内，导向到随后将发育深部血管网络的区域。尽管在出生后42天之前在这个区域中没有观察到GFAP阳性细胞，这不能排除已经存在GFAP阴性胶质细胞来提供用于Lm-HSC定位的信号的可能性。早先的研究显示了许多疾病与反应性神经胶质增生相关。特别是，在DR中，胶质细胞和它们的细胞外基质与病理性血管生成相关。由于来自注射的Lin-HSC组合物的细胞特异性地附着于表达GFAP的胶质细胞，无论损伤的类型，本发明的Lin—HSC组合物可以用于靶向视网膜中的前血管生成病变。例如，在缺血性的视网膜病，例如糖尿病中，新血管形成是对缺氧的响应。通过将Lin-HSC组合物靶向到病理性新血管形成的位点，发育中的新血管系统可以被稳定，防止新血管系统的异常，例如出血或水肿(与DR相关的视力损失的原因)，并且可以潜在地减轻最初刺激新血管形成的缺氧。异常的血管可以恢复到标准状态。此外，通过使用转染的Lin-HSC组合物和激光诱导的星形细胞活化，血管静止蛋白，例如T2-TrpRS(附图34中的SEQIDNO:3)、T2-TrpRS-GD(附图34中的SEQIDNO:4)、mini-TrpRS(附图35中的SEQIDNO:5)和Tl-TrpRS(附图36中的SEQIDNO:6)可以被递送到病理性血管生成的位点。优选的TrpRS的血管静止片段包括T2-TrpRS和T2-TrpRS-GD。由于激光凝结通常被用于临床的眼科医学，这种方法对于许多视网膜疾病具有应用性。虽然已经在癌症治疗中探索了这种基于细胞的方法，它们对于眼疾病的用途是更有益的，因为眼球内注射使得向疾病位点直接递送大量细胞成为可台匕s匕。Lm-HSC的神经营养和血管营养援救MACS被用于从如上所述的增强绿色荧光蛋白质(eGFP)、C3H(W/W)、FVB(W//^)小鼠的骨髓分离Lin-HSC。来自这些小鼠的含有EPC的Lin-HSC被眼内注射到P6C3H或FVB小鼠眼中。在注射后各个时点(1个月、2个约和6个月)收集视网膜。在用针对CD31的抗体染色和用DAPI的核染色之后的视网膜组织学之后，通过扫描激光共焦显微镜来分析血管系统。还在各个时点对来自视网膜的mRNA使用微阵列基因表达分析来鉴定潜在地涉及所述效果的基因。到P21,W/>y/小鼠的眼具有感觉神经视网膜和视网膜血管系统的深度退化。在P6用LirfHSC处理的W/k/小鼠的眼维持了正常的碎见网膜血管系统长达6个月；在所有的时点(1M、2M和6M)与对照相比时，深部层和中间层都被显著地改善了(参见，附图12)。此外，我们观察到，相对于作为对照用Lin+HSC处理的眼，用Lm-HSC处理的视网膜也更厚(IM:1.2倍，2M:1.3倍，6M:1.4倍)，并且在外核层中具有更多数量的细胞(1M:2.2倍，2M:3.7倍，6M:5.7倍)。与对照(未处理的或非Lin—HSC处理的)W/W视网膜相比，"援救的"(例如，Lin—HSC)视网膜的大规模基因组分析表明，编码sHSPs(小热激蛋白)和与血管和神经援救相关的特异性生长因子的基因显著增量调节，包括编码附图20，画面A和B中列出的蛋白质的基因。骨髓衍生的Lin—HSC群体显著地以及可再生地诱导正常血管系统的维持，并显著地提高小鼠中的光受体和其他神经元细胞层。这种神经营养的援救有效果小热激蛋白和生长因子的显著增量调节相关，并且提供了对当前不可治疗的视网膜退化失调的治疗方法的预见。^///ra7小鼠视网膜展现了深度的血管和神经元退化小鼠中正常的出生后视网膜血管和神经元发育已经被很好地描述了，类似于在三个月的人类胎儿中观察到的变化(Dorrell等人.2002，Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.43:3500-3510)。W/基因的小鼠纯合体享有人类视网膜退化的许多特征(Frasson等人，1999，A^,.A^t/.5:1183-1187),并且作为在编码PRcGMP磷酸二酯酶的基因中的突变的结果(Bowes等人.1990,Nature347:677-680)展现了伴有严重血管萎缩的快速光受体(PR)损失。为了检查视网膜发育期间的血管系统和其随后的退化，使用针对胶原IV(CIV)、成熟血管系统的细胞外基质(ECM)蛋白和内皮细胞标志物CD31(PECAM-1)的抗体(附图15)。W〃W/(C3H/HeJ)的视网膜通常直到大约出生后8天(P)发育，此时开始了含有光受体的外核层(ONL)的退化。ONL快速地退化，细胞由于细胞凋亡死亡，使得到P20仅保留了单层的核。使用针对CIV和CD31的抗体对完整固定的视网膜的双染色显示了在W〃/y//小鼠中血管退化的细节类似于他人描述的(Blanksetah,1986,J.Comp.Neurol.254:543-553)。原发和深部视网膜血管层看起来正常发育到P12,之后存在着内皮细胞的快速损失，由CD31染色的缺少所证明。CD31阳性内皮细胞处于正常分布直到P12，但之后快速地消失。有趣地，CIV阳性染色在整个检查的时点期间保持存在，表明血管和相关的ECM正常地形成，但仅仅是基质保持到P13之后，此时观察不到CD31卩日性细胞。(附图15,中间画面)。在P21之后中间媒介也退化，但是进展慢于在深部丛中观察到的(附图15,上部画面)。显示了正常小鼠的视网血管和神经细胞层用于同W〃W/小鼠比较(右侧画面，附图15)。在W〃ra7小鼠中骨髓衍生的Lin—HSC的神经保护效果眼内注射的Lin-HSC掺入到所有三个血管丛的内源碎见网膜血管系统中，并防止血管退化。有趣地，注射的细胞实际上从未在外核层中观察到。这些细胞要么掺入到形成中的视网膜血管，或被观察到非常接近于这些血管。在退化即将发生之前，在P6将鼠的Lin-HSC(来自C3H/HeJ)眼内注射到C3H/HeJ(ra7緒)小鼠眼中。到P30,对照细胞(CD3r)重注射的眼展现了典型的表型，即，在每个检查的视网膜中观察到深部血管丛和ONL的几乎完全的退化。用Lin—HSC注射的眼维持了正常外观的中间和深部血管丛。令人惊讶地，与对照细胞注射的眼相比，在Lin-HSC注射的眼的中间核层(INL)和ONL中观察到显著更多的细胞。Lm-HSC的这种援救效果在注射后2个月观察到(附图16(B)),并持续长达注射后6个月(附图16(C))。当比较援救和非援救的眼时，在Lin-HSC注射的眼的中间和深部丛的血管系统中，以及含有神经元细胞的INL和ONL的血管系统中的差异，在所有测量的时点是显著的(附图16(B和C))。通过测量血管系统的总长度(附图16(D))和计数ONL中观察到的DAPI阳性细胞核的数目(附图16(E))来定量这种效果。将单元线性回归分析应用于所有时点的数据。在LirrHSC注射的眼中在P30(p<0.024)和P60(p<0.034)观察到血管援救和神经元(例如，ONL厚度)援救之间的统计学上显著的相关性(附图16(F))。相关性保持很好，而当比较Lm-HSC注射的视网膜与对照细胞注射的视网膜时在P180不是统计学上显著的(p<0.14)(附图16(F))。相比之下，对照细胞注射的视网膜显示了在任何时点血管系统和ONL的保存之间没有显著相关性(附图16(F))。这些数据表明，Lm-HSC的眼内注射在WMy//小鼠的视网膜中产生了相伴的视网膜血管和神经元援救。在ONL中，或在处理视网膜血管内或接近一见网膜血管的任何地方，没有观察到注射的细胞。Lm—HSC注射的W/k/视网膜的功能性援救对注射对照细胞或鼠Lm-HSC2个月后的小鼠进行视网膜电图(ERG)(附图17))。使用ERG记录之后的每个眼进行免疫组织化学和显微分析来确认出现了血管和神经元援救。来自治疗的、援救的和对照非援救眼的代表性ERG记录显示，在援救的眼中，数学减扣的信号(处理的减去未处理的眼)产生了振幅跟…相似的8-10孩i伏的清楚的可检测信号(附图17)。清楚地，来自两只眼的信号都是严重地异常的。然而，从Lin—HSC处理的眼可以记录一致的和可检测的ERG。在所有情况下，来自对照眼的ERG是不可检测的。虽然在援救的眼中信号的振幅显著地低于正常的眼，每当存在组织学上的援救时信号被一致性地观察到，并且处于其他的基于基因的援救研究所报道的数量级上。总的说来，这些结果是用Lin—HSC处理的眼中一定程度的功能性援救的证明。援救的/W/W视网膜细胞类型主要是锥体使用特异于rod或锥体视蛋白的抗体免疫组织化学地分析援救的和未援救的视网膜。在附图17中出现的用于ERG记录的相同的眼用于rod或锥体视蛋白分析。在野生型小鼠视网膜中，存在的光受体的少于约5%是锥体(Soucy等人.1998,Neuron21:481-493)，用附图25(A)中所示红色/绿色锥体视蛋白或附图25(B)中所示rod视紫红质观察到的免疫组织化学染色图型与推体细胞的这种百分比一致。当用预免疫IgG染色野生型视网膜时，除了血管的自体荧光之外，在感觉神经视网膜中的任何地方都没有观察到染色(附图25(C))。出生后两个月，未注射的n/Z^小鼠的视网膜具有实质上萎缩的外核层，其不展现出使用针对红绿锥体视蛋白(附图25(D))或视紫红质(附图25(G))抗体的任何染色。对于锥体(附图25(E))或rod(附图25(H))视蛋白，用对照CD31-HSC注射的眼也没有被阳性地染色。相比之下，用Lin-HSC注射的对侧眼在保留的外核层中具有约3到约8行的核；大多数这些细胞对于锥体视蛋白(附图25(F))是阳性的，具有rod视蛋白的约1-3%的阳性(附图25(I))。显著地，这与通常在正常小鼠视网膜中观察的几乎相反，其是rod占主导的。这些数据表明，Lm-HSC的注射保持了锥体持续延长的时间，通常在这期间它们将退化。人类骨髓(hBM)衍生的Lin—HSC也援救退化中的视网膜从人类骨髓分离的Lm—HSC与鼠的Lin—HSC表现类似。从人类供体收集骨髓，耗尽Lin+HSC,产生人类Lm-HSC的群体(hLm-HSC)。用荧光染料体外标记这些细胞，注射到C3SnSmn.CB17-尸/^cSCID小鼠眼中。以同注射鼠Lin—HSC时观察到的相同方式，注射的hLin-HSC迁移到，并且靶向视网膜血管生成的位点(附图18(A))。除了血管輩巴向之外，人类Lin—HSC还提供了对于W〃W/小鼠的血管和神经元细胞层的健壮的援救效果(附图18(B和C))。这种观察确认了人类人类中靶向视网膜血管系统并且可以防止视网膜退化的细胞的存在。在ra70/ra7(9小鼠中Lin-HSC具有亲血管和神经营养效果虽然WMr//小鼠是最广泛使用的和最好地表征的视网膜退化模型(Chang等人.2002,VisionRes.42:517-525),对于与人类疾病中观察到的普通的、更慢的过程来的不同来说，退化是非常快的。在这个品系中，光受体细胞约P8开始退化，此时视网膜血管系统仍然快速地扩展(附图15)。深部视网膜血管系统的随后的退化甚至在中间丛仍在形成时发生，因而，ra7/W/小鼠的视网膜从不完全地发育，不同于在患有这种疾病的大多数人类中观察到的。具有更慢的退化时间过程并且与人类视网膜退化状况更为紧密地类似的小鼠模型被用于研究Lin-HSC介导的血管援救。在W/0小鼠中，光受体细胞退化在约P21开始，血管退化此后不久开始。由于正常的感觉神经视网膜发育主要在P21完成，观察到退化在视网膜完全分化之后开始，这样比/y/M^/小鼠模型更类似于人类视网膜退化。来自ra70小鼠的Lm—HSC或对照细胞被注射到P6眼中，在变动的时点评估视网膜。在P21,来自注射Lin-HSC,具有所有血管层的完全发育以及INL和ONL的正常发育(附图18(D和H))。在大约P21,视网膜退化开始并随年龄进展。到P30，对照细胞注射的视网膜展现严重的血管和神经元退化(附图18(1)),而注射Lin—HSC的细胞维持了几乎正常的血管层和光受体细胞(附图18(E))。在援救的和非援救的眼之间的差异在以后的时点更为显著(比较附图18(F和G)与18(J和K))。在对照处理的眼中，血管退化的进展通过对CD31和胶原IV的免疫组织化学染色非常清楚地观察到(附图18(I-K))。对照处理的眼对于CD31是几乎完全阴性的，而胶原IV阳性血管"踪迹，，仍然明显，表明发生了血管退化而不是完全的血管形成。相比之下，Lin-HSC处理的眼具有CD31和胶原IV阳性血管，看起来非常类似于正常的、野生型眼(比较附图18(F和I))。在Lin—HSC处理后的^//n/小鼠视网膜的基因表达分析大规模基因组学(微阵列分析)被用于分析援救的和非援救的视网膜来鉴定推定的神经营养援救介体。在用Lin-HSC处理的小鼠视网膜中的基因表达与未注射的视网膜以及用对照细胞(CD3r)注射的视网膜进行比较。这些比较各自进行三份。当前考虑的，基因需要在所有三份中具有比背景水平高至少2倍的表达水平。与对照细胞注射的和未注射的W/raf小鼠视网膜相比，在LirTHSC保护的—见网膜中被增量调节3倍的基因在附图20,画面A和B中示出。通过用每种cRNA复制物的平均表达水平除标准偏差，为表达的基因计算变异系数(GOV)水平。此外，通过将平均和标准偏差(SD)相关来计算表达水平和噪声离散之间的相关性。获得对于每个基因的基因表达水平和标准偏差之间的相关性，容许测定背景水平和可靠的表达水平阈值。总体上，数据很好地处于可接受限度内(Tu等人.2002，尸rac.Ato/./k'ad5"c,.USA99:1403]-14036)。以下分别讨论的基因展现了高于这些临界表达水平的表达水平。还测定了讨论的基因的配对的"t-测验"值。在每种情况下，p-值是合理的(接近或低于0.5),其表明在复制物之间存在相似性以及在不同的测试组之间存在可能的显著差异。许多显著地增量调节的基因，包括MAD和YmgYang-l(YY-1)(Austen等人.1997，Curr.Top.Microbiol.Immunol.224:123-130.)编码了具有有关保护细胞免于细胞凋亡的功能的蛋白质。许多晶状体蛋白基因，其具有与涉及保护细胞免于逆境的已知热激蛋白的序列同源性和类似功能，也通过Lin—HSC处理被增量调节。cc-晶状体蛋白的表达通过免疫组织化学分析被定位在ONL上(附图19)。附图19显示了晶状体蛋白aA在用Lm-HSC处理后援救的外核层细胞中，而不是在用对照细胞处理的对侧眼中被增量调节。左侧画面显示了在4爰救的#见网膜中的IgG染色(对照)。中间画面显示了在援救的视网膜中的ocA。右侧画面显示了在非援救的视网膜中的晶状体蛋白aA。来自用人类Lin-HSC援救的ra7/ra7小鼠视网膜的信使RNA与人类特异性AffymetnxU133A微阵列芯片杂交。在严格的分析之后，在背景之上发现许多基因，其mRNA表达是人类特异性的，并且与鼠Lm—HSC援救的视网膜和人类对照细胞注射的非援救的视网膜相比，在人类Lin-HSC援救的视网膜中显著更高(附图20，画面C)。在原始的和新近分化的CD34+造血干细胞的表面上表达的细胞粘附分子CD6,以及由造血干细胞的另一个基因表达的干扰素oc13,都被微阵列生物信息学技术发现，验证了评估方案。此外，几种生长因子和神经营养因子被人类Lin-HSC援救的小鼠视网膜样品高于背景地表达(附图20，画面D)。用于谱系确认的造血细胞的标志物被用于消极选择含有EPC的骨髓衍生的Lin-HSC群体。虽然充当EPC的骨髓衍生的Lin-HSC的亚群不由通常使用的细胞表面标志物表征，这些细胞在发育或受损的视网膜血管系统中的行为完全不同于Lin+或成年内皮细胞群体所观察到的。这些细胞选择性地靶向视网膜血管生成的位点并且参与明显血管的形成。遗传的视网膜退行性疾病通常与视网膜血管系统的损失相伴。这种疾病的有效治疗需要功能的恢复以及复杂的组织结构的维持。虽然一些近来的研究探索了使用营养因子的基于细胞的递送或干细胞本身，这两者的组合可能是必需的。例如，生长因子疗法来治疗视网膜退化疾病产生了血管的不受调节的过度生长，引起对正常视网膜组织结构的严重破坏。使用神经或视网膜千细胞来治疗视网膜退化性疾病可能恢复神经元功能，。将来自Lm-HSC群体的细胞掺入到小鼠的视网膜血管中稳定了退化的血管系统而不破坏视网膜结构。当细胞注射到P15W/W小鼠中时，也观察到这种^爰救效果。由于血管退化在W/rt/小鼠中在P16开始，这种观察扩展了有效的Lm—HSC治疗的治疗窗口。在用Lm-HSC注射的眼中，视网膜神经元和光受体被保持，视觉功能被维持。当眼内注射到患有视网膜退化性疾病的小鼠种时，成年骨髓衍生的Lin—HSC细胞产生深度的亲血管和神经营养效果。这种援救效果存续直到处理后的6个月，成年骨髓衍生的Lin-HSC细胞产生深度的亲血管和神经营养效果。这种援救效果存续直到处理后的6个月，当在完全的视网膜退化之前注射Lm-HSC时是最有效的(在小鼠中直到出生后16天，小鼠通常在出生后30天展现完全的视网膜退化)。在两种小鼠视网膜退化模型中观察到这种援救，显著地，当接受者是患有视网膜退化的免疫缺陷的啮齿动物(例如，SCID小鼠)或当供体是患有视网膜退化的小鼠时，可以使用成年人类骨髓衍生的HSC实现。虽然几个新近的报导已经描述了在使用野生型基因的基于病毒的基因援救之后在患有视网膜退化的小鼠或犬中的部分表型援救(Ali,等人.2000,NatGenet25:306-310;Takahashi等人.1999，J.Virol.73:7812-7816;Aclanderal.2001,Nat.Genet28:92-95.),本发明是首次通过血管援救实现的一般性基于细胞的治疗效果。因而，在具有超过100个已知的相关突变的一组疾病(例如，色素性视网膜炎)的治疗中这种方法的潜在实用性将比产生单个基因疗法来治疗各种已知的突变更为实用。神经营养援救效果的精确的分子基础仍然是未知的，但仅当存在伴随的血管稳定/援救时被观察到。注射的干细胞的存在本身不足以产生神经营养援救，在外核层中干细胞衍生的神经元的明确缺乏排除了注射的细胞转化成光受体的可能性。微阵列基因表达分析获得的数据展现了已知具有抗细胞凋亡效果的基因的显著增量调节。由于在视网膜退化中观察到的大部神经元死亡是通过细胞凋亡的，这种保护在延长光受体以及对于这些疾病中的视觉功能关键的其他神经元的寿命方面是有很大的治疗效益的。C-myc是通过各种下游的细胞凋亡诱导因子参与细胞凋亡的转录因子。在W//^小鼠中C-myc表达被提高到野生型中的4.5倍，表明与在W〃W/小鼠中观察到的光受体退化的潜在联系。在LiiTHSC保护的视网膜中显著地增量调节(附图20，画面A)的两种基因Madl和YY-1,已知抑制c-myc的活性，因而抑制c-myc诱导的细胞凋亡。Madl的过量表达还显示了抑制caspase-8的Fas诱导的活化，caspase-8是细胞凋亡途径的另一个关键成分。通过防止通常在ra^Y/小鼠中引起退化的细胞凋亡启动，这两种分子的增量调节可能在保护视网膜免于血管和神经退化方面起到了作用。在Lin-HSC保护的视网膜中大大地增量调节的另一组基因包括晶状体蛋白家族的成员(附图20，画面B)。类似于热激蛋白和其他逆境诱导的蛋白，晶状体蛋白可以通过视网膜逆境活化，并且提供了针对细胞凋亡的保护效果。晶状体蛋白ccA的异常低的表达与视网膜营养不良的大鼠模型中光受体损失有关，新近在W/W小鼠的视网膜中的蛋白组分析展现了响应于视网膜退化的晶状体蛋白增量调节的诱导。根据我们的EPC援救的小鼠视网膜的微阵列数据，晶状体蛋白的增量调节看起来在EPC阶段的视网膜神经保护中起到关键作用。例如c-myc、Madl、Yx-l和晶状体-蛋白的基因可能是神经元援救的下游介体。神经营养试剂可以调节抗细胞凋亡基因表达，而我们的用小鼠干细胞援救的视网膜的微阵列分析没有展示诱导已知神经营养因子的提高的水平。在另一方面，使用人类特异性芯片对人类骨髓衍生的干细胞介导的援救的分析确实展现了在多种生长因子基因的表达方面很低的、但是显著的提高。增量调节的基因包括成纤维细胞生长因子家族和otoferlin的几个成员。在otoferlin基因中的突变与由于听觉神经病引起耳聋的遗传性紊乱相关。可能的是，注射的Lin-HSC的otoferlin产生对视网膜神经的保护也起到贡献。历史上，长期假定的是，在患有视网膜退化的患者和动物中观察到的血管变化是继发于光受体死亡的降低的代谢需求的。当前的数据表明，至少对于患有遗传性视网膜退化的小鼠来说，保持正常的血管系统也可以帮助维持外核层的成分。文献中新近的报道证明了组织特异性血管系统具有营养效果的观念，其超出了根据仅提供血管"营养，，所预期的。例如，VEGFR1活化后产生生长因子，所述生长因子对于面对肝损伤时的肝细胞再生和维持是关键的(LeCouter等人.2003,Science299:890-893)。在血管内皮细胞和邻近的肝脏实质细胞之间类似的指示性相互作用被报道涉及肝脏器官发生，远在功能性血管的形成之前。在患有视网膜退化的个体中内源性视网膜血管系统可能不能促进如此显著的援救，但是如果这种血管系统被来自骨髓造血干细胞群体的内皮祖代支撑，它们可能产生对于退化更有抗性的血管系统，并且同时促进视网的神经以及血管的存活。在患有视网膜退化的人类中，延迟完全视网膜退化的发作可以提供数年的额外的视力。用Lm-HSC处理的动物具有ERG的显箸保持，其足以支持视觉。临床上，广泛理解的是，可以存在实质上的光受体和其他神经元损失而仍然保持功能性的视力。在某个点上，临界阈值被跨越，视力丧失。由于几乎所有的人类遗传性视网膜退化是早期的但是緩慢的发作，患有视网膜退化的个体可以被鉴定，并用本发明的自体骨髓干细胞的移植来眼内地治疗以延迟视网膜退化和相伴的^L力损失。为了增强本发明的干细胞的靶向和掺入，活化的星形细胞的存在是期望的(Otani等人，2002,Nat.Med.8:1004-1010);这可以伴随有存在相关的神经胶质增生时的早期治疗，或伴随有使用激光来刺激活化的星形细胞的局部增殖。任选的，可以使用在眼球内注射之前用一种或多种神经营养物质对干细胞的体外转染来增强援救效果。这种方法可以应用于治疗其他的视觉神经退化失调，例如青光眼，其中存在着视网膜神经节细胞退化。来自成年骨髓的Lin-HSC群体含有EPC的群体，其可以通过靶向反应性星形细胞并掺入到建立的模板中来促进血管生成而不破坏视网膜结构。在患有视网膜退化的眼中，Lin-HSC还提供了长期的神经营养援救效果。此外，含有EPC的、遗传修改的自体Lm-HSC组合物可以被移植到缺血性的或异常血管化的眼中，并可以稳定地掺入到新血管和神经层中，并连续地局部释放治疗分子持续很长的时期。这种以生理学有意义的剂量表达药理学试剂的基因的局部递送，代表了治疗当前不可治疗的眼睛疾病的新的范例。例如，在正常小鼠视网膜中的光受体主要是rod,但是在用本发明的Lin-HSC援救之后观察到的外核层主要含有锥体。大多数遗传性人类视网膜退化作为原发rod特异性缺陷的结果发生，锥体的损失被认为是继发于rod功能障碍的，其可能与通过rod表达的某些营养因子的损失有关。实施例实施例1.细胞分离和富集；鼠Lin-HSC群体A和B的制备。一般过程。所有的体内评估根据NIH(NIHGuidefortheCareandUseofLaboratoryAnimals)来进4亍，所有的i平估过一呈由Scripps研究所(TSRI,LaJolla,CA)动物照料和使用委员会(AnimalCareandUseCommittee)批准。骨髓细胞从B6.129S7-Gtrosa26、Tie-2GFP、ACTbEGFP、FVB/NJ(^//W小鼠)或Balb/cBYJ成年小鼠(TheJacksonLaboratory,ME)提取。然后通过使用HISTOPAQUEpolysucrose梯度(Sigma，St.Louis,MO)的密度梯度分离分离单核细胞，用结合生物素的谱系组抗体(CD45、CD3、Ly-6G、CDll、TER-119、Pharmmgen,SanDiego，CA)标记用于小鼠中的LiiV选择使用磁力分离设备(AUTOMACS分选机，MiltenyiBiotech,Auburn,CA)从LinHSC中分离和除去谱系阳性(Lin+)细胞。产生的含有内皮祖细胞的Lin—HSC群体进一步4吏用FACSTMCalibur;泉式细月包i十(BectonDickinson,FranklinLakes,NJ)使用以下抗体来表征PE结合的Sca-l、c-kit、KDR和CD31(Pharmingen，SanDiego,CA)。Tie-2-GFP骨髓细胞被用于Tie-2的表征。为了收获成年小鼠内皮细胞，从ACTbEGFP小鼠外科地除去系膜组织，并放入胶原酶(Worthington,Lakewood，NJ)中来消化组织，随后使用45过滤器过滤。收集流通物并用内皮生长培养基(Clonetics，SanDiego,CA)孵育。通过观察形态上圆形的外观、用CD31mAb(Pharmingen)染色并检查培养物在MATRIGELTM基质(BecktonDickinson,FranklinLakes,NJ)中管样结构的形成，来确认内皮特征。鼠Lm-HSC群体A。从ACTbEGFP小鼠通过如上所述的一般程序提取骨髓细胞。通过FACS流式细胞计对于CD31、c-kit、Sca-l、Flk-1和Tie-2细胞表面抗原标志物来标准Lm—HSC细胞。结果在附图1(c)中示出。约81%的Lin—HSC展现CD31标志物，约70.5%的Lm-HSC展现c-kit标志物，约4%的Lm-HSC展现Sca-l标志物，约2.2%的Lin'HSC展现Flk-1标志物，约0.91%的Lin—HSC细胞展现Tie画2标志物。相比之下，从这些骨髓细胞分离的Lin+HSC具有显著不同的细胞标志物分布型(即，CD31:37.4%;c-kit:20%;Sca-l:2.8%;Flk-:0.05%)。鼠Lin-HSC群体B。从Balb/C、ACTbEGFP和C3H小鼠通过如上所述的一般程序提取骨髓细胞。分析Lin—HSC细胞的细胞表面标志物的存在(Sca-l、Flk-1/KDR、c-kit(CD117)、CD34、CD31和各种整联蛋白otl、a2、oc3、oc4、oc5、oc6、aL、cxM、av、allb、(31、P2、p3、^4、(35和卩7)。结果在表2中示出。表2.Lin-HSC群体B的表征。<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>实施例2.鼠模型中的细胞眼内施用。在小鼠眼睑中用精细刀片产生眼睑裂隙来暴露P2到P6的眼球。然后使用33-规格(Hamilton,Reno,NV)针头的注射器眼内注射本发明的谱系阴性HSC群体A(在约0.5pl到约liul细胞培养介质中约105个细胞)。实施例3.EPC转染。使用FuGENE6转染试剂(Roche，Indianapolis,IN)才艮据厂家的方案用编码TrpRS的片段(SEQIDNO:3)并且包括His6标记的DNA(SEQIDNO:1,附图7)转染鼠Lin-HSC(群体A)。将Lin-HSC细胞(约106个细胞每ml)悬浮在含有干细胞因子(PeproTech,RockyHill,NJ)的opti—MEM⑧介质(Invitrogen，Carlsbad,CA)中。然后添加DNA(约1)ig)和FuGENE试剂(约3pi)混合物，混合物在37。C孵育约18小时。孵育之后，洗涤并收集细胞。这个系统的转染效率通过FACS分析确认为大约17%。通过western印迹来确认T2-TrpRS产生。His6标记的T2-TrpRS的氨基酸序列显示为SEQIDNO:2，附图8。实施例4.免疫组织化学和共焦分析在各个时点收集小鼠视网膜，准备用于完整的固定或冷冻切片。对于完整固定，用4%多聚曱醛固定视网膜，在50%胎儿牛血清(FBS)和20%正常山羊血清中在室温环境下封闭一'J、时。用初级抗体处理一见网膜，用二级抗体检测。使用的初级物是抗胶原IV(Chemicon,Temecula，CA)、抗-(3-gal(Promega，Madison,WI)、抗GFAP(DakoCytomation，Carpenteria,CA)、抗oc-平滑月几肌动蛋白(cc-SMA,DakoCytomatkm)。使用的二级抗体结合到Alexa488或594萸光标志物(MolecularProbes，Eugene,OR)。使用MRC1024共焦显微镜(BIO-RAD，Hercules,CA)采集图像。使用LASERSHARP⑧软件(Bio-Rad)来创造三维图像检查完整固定视网膜中三个不同血管层的发育。由共焦显微术辨别出的、在增强的GFP(eGFP)小鼠和GFAP/wtGFP小鼠之间GFP像素强度中的差异，被利用来产生3维图实施例5.小鼠中的体内视网膜血管生成定量分析。对于T2-TrpRS分析，从小鼠视网膜的三维图像重建原发和深部丛。原发丛被分成两种类型正常发育，或停止的血管发展。深部血管发育的抑制的种类基于包括以下指标的血管抑制作用百分比来分析深部丛形成的完全抑制被标记为"完全的"，正常的血管发育(包括低于25%的抑制作用)被标记为"正常的"，其他的标记为"部分的"。对于W/W小鼠援救数据，每个完整的固定视网膜中四个独立区域的深部丛使用10x透镜来捕获。对每个图像计算血管系统总长度，汇总并在各组之间比较。为了获得精确的信息，将Lm-HSC注射到一只眼中，Lm+HSC注射到同一小鼠的另一只眼中。未注射的对照视网膜采自同窝小鼠。实施例6.成年视网膜损伤鼠模型使用二极管激光器(150mW，1秒，50mm)或通过用27规格针头刺穿小鼠视网膜机械地产生激光和伤疤模型。损伤后五天，使用眼内方法注射细胞。从5天后的小鼠收集眼。实施例7.视网膜再生的神经营养援救成年鼠骨髓衍生的谱系阴性造血干细胞(Lin-HSC)在视网膜退化的小鼠模型中具有血管营养和神经营养性援救效果。用含有约105个本发明的LirTHSC的0.5微升眼内注射10天龄小鼠的右眼，2个月后评估视网膜血管系统的存在和神经层核计数。同一,J、鼠的左眼用相同数量的Lin+HSC注射作为对照，类似地进行评估。如附图9所示，在Lin-HSC处理的眼中，视网膜血管系统看起来几乎是正常的，内核层几乎是正常的，外核层(ONL)具有约3到4层的核。相比之下，对侧的Lin+HSC处理的眼具有显著萎缩的中间视网膜血管层、完全萎缩的外视网膜血管层；内核层是显著萎缩的，外核层完全消失。在小鼠3和小鼠5中显著地说明了这一点。在小鼠l中，不存在援救效果，这在约15%的注射的小鼠中是事实。当用视网膜电图(ERG)评定视觉功能时，当观察到血管和神经元援救时，观察到阳性ERG的恢复(小鼠3和5)。当没有血管或神经元援救时，没有观察到阳性ERG(小鼠1)。在通过本发明的LiiTHSC在W/W小鼠眼的血管和神经营养援救之间的这种相关性通过附图10所示的回归分析图说明了。对于中间血管系统类型(产0.45)和对于深部血管系统(r=0.67),观察到神经元(y轴)和血管(x轴)再生之间的相关性。附图11显示了Lin+HSC的血管和神经元援救之间没有任何统计学上显著的相关性。血管援救进行定量，数据在附图12中呈现。在注射后1个月(1M)、2个月(2M)和6个月(6M)的时点的小鼠I史据在附图12中显示，展现了相对于来自相同小鼠的未处理的眼中的血管长度(亮色柱)，特别是在注射后1个月和2个月，用本发明的Lm-HSC处理的眼中血管长度显著提高(黑色柱)。通过在Lin-HSC或Lm+HSC注射约2个月后，通过计数内核层和外核层中的在，来定量神经营养援救效果。结果在附图13和14中示出。实施例8.人类Lm-HSC群体。从健康成年人类志愿者通过如上所述的一般程序提取骨髓细胞。然后使用HISTOPAQUEpolysucrose梯度(Sigma,St.Louis，MO)通过密度梯度分离来分离单核细胞。为了从人类骨髓单核细胞分离Lm-HSC群体，以下的生物素结合的谱系组抗体被用于磁力分离系统(AUTOMACS分选机，MiltenyiBiotech,Auburn，CA):CD2、CD3、CD4、CDlla、Mac-l、CD14、CD16、CD19、CD33、CD38、CD45RA、CD64、CD68、CD86、CD235a(Pharmingen)。人类Lin-HSC群体根据CD133表达进一步分离成两个亚群。用生物素结合的CD133抗体标记细胞并分离成CD133阳性和CD133阴性亚群。实施例9.在视网膜退化的鼠模型中人类和鼠细胞的眼内施用。C3H/HeJ、C3SnSmn.CB17-7WcSCID和小鼠品系被用作视网膜退化才莫型。C3H/HeJ和C3SnSmn.CB17画尸,UcSCID小鼠(TheJacksonLaboratory,Maine)对于一见网月莫退化1(ra7)突变是纯合的，一种引起早期发作严重视网膜退化的突变。突变位于编码rod光受体cGMP磷酸二酯酶(3亚基的Pde6b基因的外显子7中。这个基因中的突变已经在含有常染色体隐性色素性视网膜炎(RP)的人类患者中发现。C3SnSmn.CB17-尸nWcSCID小鼠对于严重组合免疫缺陷自体突变(尸nWcSCID)也是纯合的，被用于人类细胞转移实验。ra70小鼠中的视网膜退化是由Pde6b基因的外显子13中的突变引起的。这也是具有比ra^/VJ/更晚的发作和更轻的视网膜退化的临床有关的RP模型。所有的体内评估根据NIH实验动物的照料和使用指南(NIHGuidefortheCareandUseofLaboratoryAnimals)来进行,所有过程由Scripps研究所(TSRI,LaJolla,CA)动物照料和使用委员会(AnimalCareandUseCommittee)水匕),。在小鼠眼睑中用精细刀片产生眼睑裂隙来暴露P2到P6的眼球。然后使用33-规格(Hamilton,Reno，NV)针头的注射器眼内注射鼠群体A或人类群体C的谱系阴性HSC细胞(在约0.5iul到约l细胞培养介质中约105个细胞)。为了显现注射的人类细胞，在注射前用染泮+(CelltrackergreenCMFDA,MolecularProbes)才示i己纟田月包。在各个时点收集视网膜，用4%多聚曱醛(PFA)和曱醇固定，随后在50%FBS/20%NGS中在室温下封闭一'h时。为了染色视网膜血管系统，用抗CD31(Pharmingen)和抗胶原I(Chemicon)抗体、随后是Alexa488或594结合的二级抗体(MolecularProbes,Eugene,Oregon)孵育视网膜。使用四径向松弛切口来将视网膜铺平以获得完整固定的制品。使用RadianceMP2100共焦显微镜和LASERSHARP软件(Biorad,Hercules,California)获得中间或深部一见网膜血管丛的血管系统图像(参见Dorrell等人.2002/"veW<9//2/7w/wo/.F"、.Set43:3500-3510)。对于血管系统的定量，从中间或深部血管层的中间部分随机选择四个独立的视野(900|iimx900|Lim)，使用LASERPLX⑧分析软件(Biorad)测量血管系统的总长。在相同的丛中这四个一见野的总长被用于进一步的分析。将扁平固定的视网膜重新包埋用于恒冷切片。将视网膜置于4%PFA中过夜，随后用20%蔗糖孵育。将视网膜包埋在最佳的切削温度化合物(OCT:Tissue-Tek;SakuraFineTech,Torrance,CA)中。恒冷切片(10nm)在含有核染料DAPI(Sigma-Aldrich,St.Louis，Missouri)的PBS中重新水化。在含有^L神经头和整个周围的—见网月莫的单个切片中三个不同区域的(280宽，无偏取样)DAPI标记的核图像通过共焦显微镜来采集。位于一个切片中三个独立视野的ONL中的核数量被计数，加起来用于分析。进行单线性回归分析来检查深部丛中的血管系统长度和ONL中细胞核数目。在黑暗适应过夜之后，通过15pg/gm开他敏和7Mg/gm曱苯噻嗪的腹膜内注射来麻痹小鼠。使用金回路角膜电极以及口腔参照和尾部地电极，从瞳孔扩张(1%硫酸阿托品)之后的每只眼的角膜表面记录视网膜电图(ERG)。用附加在高反射性Ganzfeld圆顶外面的GrassPhoticStimulator(PS33Plus,GrassInstruments,Quincy,MA)产生刺激。记录对在直到光刺激器(0.668cd-s/m2)容许的极限的强度范围上的短波长(Wratten47A;人max=470nm)光闪的rod反应。将响应信号扩大(CP511AC放大器，GrassInstruments)、数字化(PCI-1200,NationalInstruments,Austin,TX)并进行计算机分析。每个小鼠使用/人处理和未处理的眼记录的ERG充当它自己的内部对照。多至100次扫描被平均用于最弱的信号。来自未处理的眼的平均反应数字上减去来自处理的眼的反应，这种信号上的差异被用于标引功能性援救。微阵列分析被用于评估Lm-HSC靶向的视网膜基因表达。P6M/k/小鼠用Lm-或CD31-HSC注射。注射后40天在无RNase介质中分析这些小鼠的视网膜(在注射后的这个时点视网膜血管系统和光受体层的援救是明显的)。通过完整固定来分析每个视网膜的四分之一以确保已经实现了正常的HSC靶向以及血管系统和神经保护。来自成功注射的视网膜的RNA使用TRIzol(LifeTechnologies,Rockville,MD)、苯酚/氯仿RNA分离方案来纯化。RNA与AffymetrixMu74Av2芯片杂交，使用GENESPRING(SihconGenetics,RedwoodCity,CA)软件分析基因表达。纯化人类或小鼠HSC眼内注射到P6小鼠中。在P45,分析视网膜并集中到1)人类HSC注射的援救的小鼠视网膜，2)人类HSC注射的非援救的小鼠视网膜，和3)小鼠HSC注射的援救的小鼠视网膜的部分中，用于DNA纯化和与人类特异性U133AAffymetrix芯片杂交。使用GENESPRING⑧软件来鉴定高于背景表达的并在人类HSC援救的视网膜中更高表达的基因。然后分别地分析这些基因的每一个的探针对表达分布型并与正常人U133A微阵列实验的模型比较，所述实验使用dChip来确定人类物种特异性杂交并消除由于物种间杂交的々支阳性。附图21说明了比较本发明的CD133阳性(CD133+)和CD133阴性(CD133-)人类Lin—HSC群体上CD31和整联蛋白a6表面抗原表达的流式细胞计数据。左侧画面显示了流式细胞计散布图。中央的图。Y轴代表事件的数目:X轴显示了信号的强度。列出的直方图是同种型IgG对照抗体，显示了非特异性背景染色法的水平。实心的直方图显示了在细胞群体上表达的特异性抗体的水平。在所列的(对照)直方图的右侧的填充的直方图代表提高的荧光信号和在背景水平上的抗体表达。比较两种细胞群体之间实心直方图的峰的位置体现了细胞上的蛋白表达的差异。例如，在本发明的CD133+和CD133-细胞上CD31高于背景表达；然而，与CD133-群体中存在的相比，在CD133+细胞群体中存在更多的细胞表达更低水平的CD31。根据这个数据，显然的是CD31表达在两个群体之间变动，a6整联蛋白表达主要限于Lin—群体中的细胞，因而可以充当具有亲血管和神经营养援救功能的细胞的标、志物。当CD133阳性和CD133阴性Lin—HSC亚群眼内注射到新生SCID小鼠的眼中时，对于CD133阴性亚群观察到了对发育的血管系统的最大程度的掺入，所述CD133阴性亚群表达了CD31和整联蛋白cc6表面抗原(参见附图21,底部)。不表达CD31或整联蛋白oc6(附图21,顶部)的CD133阳性亚群看起来耙向外周缺血驱动的新血管形成的位点，但当注射到经历血管生成的中时不会。使用特异于rod或锥体视蛋白的抗体免疫组织化学地分析援救的和未援救的视网膜。在附图17中出现的用于ERG记录的相同的眼用于rod或锥体视蛋白分析。在野生型小鼠视网膜中，存在的光受体的少于约5%是锥体(Soucy等人.1998，iVewro"21:481-493),用附图25(A)中所示红色/绿色锥体视蛋白或附图25(B)中所示rod视紫红质观察到的免疫组织化学染色图型与推体细胞的这种百分比一致。不列颠哥仑比亚大学的RobertMolday博士提供了特异于rod视紫红质(rho4D2)的抗体，如先前描述的使用(Hicks等人.1986,￡>e42:55-71)。特异于锥体红/绿浮见蛋白的兔抗体购自Chemicon(AB5405),根据厂家的说明书使用。实施例10.在氧诱导的视网膜退化的鼠模型中人类和鼠细胞的眼内施用。在氧诱导的视网膜退化(OIR)模型中，出生后P7到P12天的新生野生型C57B16小鼠暴露于氧过多(75%氧)。附图22说明了在P0到P30的C"B16小鼠中的正常出生后血管发育。在PO，仅在视觉芽周围可以观察到发芽的浅表血管。在接下来几天，原发的浅表网络向外周部蔓延，到P10到达远端外周部。在P7和P12之间，继发性(深部)丛发育。到P17,存在扩大的浅表和深部血管网络(附图22，插图)。在接下来几天，随着第三(中间)层的血管的发育而发生改型，直到大约在P21达到成年结构。相比之下，在此处描述的OIR模型中，在P7-P12暴露于75%氧之后，事件的标准顺序被严重地破坏(附图23)。在P3在随后经历OIR的小鼠眼中眼内注射成年鼠的Lin-HSC群体，另一只眼用PBS或CD31阴性细胞注射作为对照。附图24说明了Lin—HSC群体可以逆转在发育的小鼠视网膜中高氧水平的退化效果。在处理的眼中观察到充分发育的浅表和深部的视网膜血管系统，而对照眼显示了基本上没有深部血管的大的无血管区域(附图24)。观察了OIR模型中的大约100只小鼠眼。相比CD31—处理的对照眼的12%以及PBS处理的对照眼的3%,在用Lin-HSC群体处理的58%的眼中观察到正常的血管新生。实施例11.通过CD44选择从鼠骨髓分离骨髓样骨髓细胞。从成年小鼠(TheJacksonLaboratory,ME)提取骨髓细胞。用鼠CD44抗体处理完整的骨髓，使用流式细胞计来从骨髓中分离表达CD44的细胞。从抗体上分离细胞并保存在緩沖溶液中备用。还分离了不显著表达CD44的细胞群体(CD44'。BM)。实施例12.通过CD44选择从鼠骨髓分离骨髓样骨髓细胞。如实施例11描述的，还使用了针对CDllb的抗体代替CD44来正选择骨髓细胞。分离了CD44hi和CDllb+的骨髓样骨髓细胞群体，其具有与实施例11中使用CD44分离的CD44hi群体相似的活性特征。还分离了CD44i。CDllb群体，其发现是无效的。实施例13.MLBM细胞群体的表征。虽然在这方面CD44的作用还不清楚，可能的是，在细胞注射到眼中后，这种受体在富含透明质酸的玻璃体中介导了细胞存活、细胞迁移和/或细胞分化。CD44hi(W，MLBM)和CD44'。的明显群体存在于未分级的小鼠骨髓中。MLBM细胞群体代表了早先的实施例中使用的Lin—群体的76%,而来自骨髓的Lin+和CD31/CD34/CD1lb细胞群体的分别仅约37%和4%表达CD44(附图26)。因而，在这三种群体中观察到的CD44表达与血管营养和神经营养活性之间存在极好的相关性，即，Lm+细胞水最有效的，而CD327CD347CDllb-细胞一致地是最低效力的。使用谱系特异性抗体的板块，大多数CD44"细胞被测定具有强烈的骨髓特征(附图27)。类似地，几乎所有的CD44hi骨髓细胞也是00111)+(附图27)。在实施例12中使用CDllb抗体正选择的MLBM(CD44111CDllb+)得到活性结果，类似于在血管耙向实验中使用CD44抗体选择分离的MLBM所获得的那些。实施例12的MLBM细胞群体以及实施例12中分离的CD441。CDllb—细胞的细胞表面抗原特征在以下的表3中示出。在表3中，更多的加号(+)数量表示相对更高的抗原表达。减号(-)表示没有检测到表达。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>实施例14.MLBM细胞群体的血管营养和神经营养效果。就血管耙向和亲血管和神经营养效果而言，实施例11的MLBM细胞群体保持了Liif细胞的性质，而CD44'。BM细胞显示了很少的活性或没有活性。通过眼内注射来自GFP+MLBM细胞群体的细胞到出生后7天(P7)的小鼠中并在P14分析视网膜，证明了血管靶向活性。在用GSisolectm标记血管之后，观察到GFP+细胞把向视网膜血管系统并呈现血管周围定位，没有掺入的证据。当使用MLBM时这些事件是常见的，但在用CD44'。BM处理的眼中是罕见的或缺乏的(附图28)。实施例11的MLBM细胞群体的亲血管和神经营养活性使用如上所述用于Lin—HSC的视网膜退化的小鼠模型来评估。W//ra7小鼠显示了一见网膜退化性疾病的特征，包括光受体死亡和深部视网膜血管系统的萎缩。如上所述。Lin-HSC骨髓细胞保持了深部视网膜血管系统并部分地援救了光受体。MLBM细胞群体表现了相同的功能(附图28)。氧诱导的视网膜病模型享有未熟儿视网膜病的特征。当用来自MLBM细胞群体的细胞处理眼时，与这个模型相关的病变被显著地降低，在这个模型中来自MLBM细胞群体的细胞的效果类似于如上所述使用Lin-HSC所观察到的。用来自MLBM细胞群体的细胞处理的眼显示了在用于定量这个模型中病变程度的两个参数上的明显降低血管闭塞面积和新血管丛面积。相比之下，用CD44'。BM细胞处理的眼显示了相对用载体对照处理的眼没有改善(附图30)。除了靶向视网膜血管系统之外，来自MLBM细胞群体的细胞分化成巨噬细胞样(F4/80+)细胞，渗透视网膜，并占据与视网膜色素上皮细胞(RPE)紧密相对的位置。这种定位促进了来自MLBM纟田月包群体的细胞的观察的血管和光受体援救效果。此外，一但处于靠近RPE的位置，来自MLBM细胞群体的细胞生产血管内皮生长因子(VEGF),由来自VEGF-GFP小鼠的MLBM细胞群体的细胞的注射来证明，其中绿色荧光蛋白(GFP)在VEGF基因活化时表达(附图31)。因此，来自MLBM细胞群体的细胞似乎处于VEGF"活化"状态。导入的来自MLBM细胞群体的细胞似乎征募了相同类型的内源细胞，因为在RPE区域中观察到GFP+(导入的)和GFP-(内源的)细胞。这种定位已经在野生型小鼠中在正常的视网膜血管发育期间观察到，在W〃/^/小鼠和在氧诱导的视网膜病模型中的援救的视网膜中观察到。对于实施例12的MLBM细胞群体发现了类似的血管靶向结果。附图32显示了到P20，当在P2注射时，实施例12的CD44hiCDllb+细胞(绿色)以类似于实施例1]的CD44-高群体的方式特异性靶向血管系统(红色)。附图33显示了实施例12的CD441。CDllb—不特异性耙向血管系统。本发明的MLBM细胞群体提供了对缺血性视网膜疾病等眼睛疾病的有效的和通用的治疗。细胞容易地从自体的骨髓分离，因而最小化了常常在基于细胞的疗法中观察到的可能的免疫原性。长期(长达六个月)跟踪揭示了在用谱系阴性细胞注射的眼中仅有神经视网膜的偶然的瓣状体和组织学保存。此外，本发明的MLBM细胞群体可以用有用的基因转染用于将功能基因递送到视网膜中。可以进行以上描述的实施方式的各种变体和修改而不背离本发明的新颖特征的精神和范围。不意图、或不应被推断为对于在此描述的具体实施方式有限制。权利要求1.一种治疗患有或存在风险发展出未熟儿视网膜病或相关视网膜疾病的哺乳动物的方法，所述方法包括向所述哺乳动物的视网膜施用一定量的来自血管营养谱系阴性造血干细胞群体的细胞，有效促进视网膜的损伤区域的有益的生理学血管再形成和改善由所述疾病引起的对视网膜的损害。2.权利要求1的方法，其中所述谱系阴性造血干细胞群体包含来自骨髓的造血干细胞和内皮-且细胞。3.权利要求2的方法，其中所述谱系阴性造血干细胞群体通过一种方法产生，所述方法包括从哺乳动物分离骨髓、从所述骨髓除去i普系阳性细胞以及从所述骨髓中回收谱系阴性造血干细胞群体。4.权利要求3的方法，其中通过用至少一种谱系组抗体处理来自所述骨髓的单核细胞，并从所述单核细胞分离与至少一种谱系组抗体免疫反应的细胞，来除去语系阳性细胞。5.权利要求1的方法，其中所述谱系阴性造血干细胞群体是分离的骨髓样骨髓细胞群体，其中大部分细胞是谱系阴性的，并且表达CD44抗原以及CDllb抗原。6.权利要求5的方法，其中分离的骨髓样骨髓细胞群体通过一种方法产生，所述方法包括从哺乳动物分离骨髓并从所述骨髓阳性地选择与抗体免疫反应的细胞，所述抗体选自抗-CD44、抗-CDllb和其组合。7.权利要求1的方法，其中所述谱系阴性造血干细胞群体从脐带静脉血分离。8.权利要求l的方法，其中所述哺乳动物是人类。9.权利要求l的方法，其中所述哺乳动物是嬰儿哺乳动物。10.权利要求1的方法，其中所述嬰儿哺乳动物已经暴露于高氧条件。11.权利要求l的方法，其中所述细胞通过眼球内注射施用。12.权利要求1的方法，其中所述细胞对于要治疗的哺乳动物是自体的。13.权利要求1的方法，其中所述细胞在疾病症状发作之前施用。14.权利要求1的方法，其中所述细胞在所述哺乳动物暴露于高氧条件之前施用。15.权利要求1的方法，其中所述细胞在施用细胞之前用治疗上有用的基因转染。16.权利要求15的方法，其中所述治疗上有用的基因编码Trp-RS的血管静止片段。17.权利要求16的方法，其中所述TrpRS的血管静止片段是T2-TrpRS(SEQIDNO:3)或T2-TrpRS-GD(SEQIDNO:4)。全文摘要本发明提供了用于治疗未熟儿视网膜病(ROP)和相关的视网膜疾病的方法。所述方法包括向患有或存在风险发展出未熟儿视网膜病或相关视网膜疾病的哺乳动物的视网膜施用一定量的来自血管营养谱系阴性造血干细胞群体的细胞，有效促进视网膜的损伤区域的有益的生理学血管再形成和改善由所述疾病引起的对视网膜的损害。优选的，所述哺乳动物是人类患者。在一个优选的实施方式中，所述谱系阴性造血干细胞群体是包含造血干细胞和内皮祖细胞的谱系阴性造血干细胞群体(即，Lin^-HSC)。在另一个优选的实施方式中，所述谱系阴性造血干细胞群体是分离的骨髓样骨髓(MLBM)细胞群体，其中大部分细胞是谱系阴性的，并且表达CD44抗原和CD11b抗原。作为选择，用于新生儿的治疗，谱系阴性造血干细胞群体可以从脐带静脉血分离。文档编号C12N5/0789GK101356268SQ200680013823公开日2009年1月28日申请日期2006年2月24日优先权日2005年2月24日发明者E·巴宁,E·阿吉拉,M·弗里兰德申请人:斯克里普斯研究学院