视网膜变性疾病的治疗方法
【专利摘要】该方法包括施用具有干细胞或祖细胞性能的细胞到视网膜，和所述细胞和视网膜细胞的细胞融合介导的视网膜细胞的重编，所述重编是通过Wnt/β-连环蛋白信号通路的激活介导。
【专利说明】视网膜变性疾病的治疗方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及对于眼科疾病的细胞疗法或者再生疗法的领域。特别地，本发明提供了将细胞(所述细胞具有干细胞或祖细胞的性能)施用到视网膜并介导所述细胞与所述视网膜细胞的细胞融合重编视网膜细胞以治疗视网膜变性疾病的方法，所述视网膜细胞例如视网膜的神经元或视网膜的胶质细胞，所述重编由fct/β-连环蛋白信号通路的激活来介导。
【背景技术】
[0002]视网膜是在眼睛后部的专门化的光敏组织，其包含光感受器细胞(视柱细胞和视锥细胞)和连接到神经网络的用于处理视觉信息的神经元。视柱细胞在低照度的条件下发挥功能，而视锥细胞负责彩色视觉和所有那些需要高分辨率的视觉工作(例如阅读)。视柱细胞主要位于远离视网膜周边的眼睛中心的位置。发现的浓度最高的视锥细胞是视网膜中心黄斑，其是对于视敏度是必需的。为了支持它的代谢功能，视网膜依赖于邻近的视网膜色素上皮细胞(RPE)。
[0003]视网膜变性是由视网膜或视网膜色素上皮(RPE)细胞的进行性的和最后的凋亡所引起的退化。视网膜变性有几个原因，包括动脉或静脉阻塞、糖尿病性视网膜病变、早熟性新生儿晶体后纤维组织形成/视网膜病变、或(通常遗传的)疾病。这些可以以许多不同的方式存在，例如视力下降、夜盲、视网膜脱落、光敏感、管状视野和外周视野受损甚至全部视野受损。在许多不同的视网膜疾病的形式中发现了视网膜变性，包括色素性视网膜炎、年龄相关性黄斑变性(AMD)、糖尿病性视网膜病变、白内障和青光眼。
[0004]色素性视网膜炎(RP)是最常见的视网膜变性，个体的发病率为大约1/3000到1/5000，在全世界影响大约150万的人口。RP是遗传性视网膜疾病的异种家族，其特征在于感光体的进行性退化以及随后的RPE的退化。它是最常见的遗传性视网膜变性，特征在于色素主要地沉积在视网膜周边和相对少量在视网膜中心。典型的表现形式呈现在青年期和成年早期之间，很可能导致损坏性的视力丧失。在大多数的RP案例中，光感受器视柱细胞的原发性变性，伴随视锥细胞的继发性变性。RP是一种长期的疾病，其通常经过几十年发展，最初呈现为夜盲，随后在生活中呈现为在日常情况中的视觉损伤。目前，没有治疗能停止视网膜变性的发展或恢复视力。具有少数治疗选择例如避光和/或利用弱视力帮助减缓RP的发展。某些从业者也将维生素A作为一种可能的治疗选择来减缓RP的发展。
[0005]已经广泛地研究了对于视网膜变性的有效治疗。基于干细胞治疗的领域对于视网膜变性疾病的治疗具有巨大的潜力，因为在动物模型中的许多研究表明干细胞具有再生损失的光感受器和视网膜神经元并改善视力的能力。迄今为止，这些细胞包括视网膜祖细胞、胚胎干细胞、 来自骨髓的干细胞和诱导的多潜能干细胞。
[0006]视网膜祖细胞(RPC)衍生自胎儿的或新生儿的视网膜，包括未成熟的细胞群，其在胚胎发育期间负责产生所有视网膜细胞。在体外，RPC能够增殖和生成新的神经元并分化为视网膜支持细胞，并且在体内可以移植进所有的视网膜层和产生各种视网膜细胞类型的形态特征(MacLaren等，2006, Nature444:203-7)。这些结果支持这样一种假设:RPC移植是一种对于视网膜变性疾病的潜在的治疗。
[0007]胚胎干细胞(ESC)衍生自囊胚级胚胎的内细胞团，具有自我再生能力并能够分化为所有成体细胞类型，包括小鼠和人类中的光感受器祖细胞、光感受器或RPE(Lamba等，2006，PNAS USA103:12769-74;Osakada 等，2008，Nat Biotechnol26:215 - 224)。Lamba等表明将衍生自人类ESC的视网膜细胞移植进入成年CrxfA)小鼠的视网膜下腔促进了源自hESC的视网膜细胞分化成有功能的光感受器，该措施改善了这些动物对光的反应(Lamba等，2009, Cell Stem Cell4:73-9)。虽然在视网膜替代疗法中ESC是有前景的，但仍要考虑伦理学问题和免疫排斥问题，且业已证明ESC与畸胎瘤形成有关。
[0008]骨髓含有至少两种不同的干细胞群:间质干细胞(MSC)和造血干细胞(HSC)。在体外使用激活素A、牛磺酸和表皮生长因子，可以诱导MSC成为表达光感受器谱系-特异性标记的细胞(Kicic等，2003，J Neurosci23:7742-9)。此外，体内动物模型证明在皇家外科医学院(RCS)大鼠中，把MSC注射入视网膜下腔可以减缓视网膜细胞变性，整合入视网膜，并分化为光感受器(Kicic 等,2003, J Neurosci23:7742-9; Inoue 等,2007, Exp EyeRes85:234-41)。
[0009]Otani等报道称在rdl和rdlO小鼠中玻璃体内注入谱系_阴性的(LirT)造血干细胞(HSC)可以挽救视网膜变性(Otani 等，2004，J Clin Investll4:755-7;US2008/031772l;US2010/0303768)。然而，几乎仅仅视锥细胞形成了移植的视网膜，视网膜电流图响应严重异常，与未治疗的动物相当。限制在于:玻璃体内注入LirT的HSC仅仅在早期、产后发育阶段整合入视网膜，而不是在成年小鼠中，仅仅在新生的小鼠或在成年小鼠中的外伤诱导模型中观察到了革巴向激活的 星形细胞(Otani等,2002, Nat Med8:1004-10; Otani等,2004, JClin Investll4:755-7; Sasahara 等，2004，Am J Pathol 172:1693-703)。
[0010]衍生自成体组织的诱导的多潜能干细胞(iPS)是多能性的ESC样细胞，其是通过四个转录因子:0ct3/4、Sox2、Klf4和c_Myc逆转录病毒的转导，在体外重编自末端分化的体细胞。据报道人类iPS具有类似ESC的潜力来模仿正常视网膜发生(Meyer等，2009, PNAS USA106:16698-703)。然而，主要问题包括减少病毒整合的风险和为了产生多潜能干细胞使得致癌基因表达的风险。这些限制可以使用可替代的方法获得iPS来克月艮，例如信号通路的激活，包括Wnt/ β -连环蛋白、MAPK/ERK、TGF- β和ΡΙ3Κ/ΑΚΤ信号通路(W02009/101084; Sanges & Cosma, 2010，Int J Dev Biol54:1575-87)。
[0011]因此，需要提供一种用于治疗视网膜变性疾病的有效的方法。
[0012]发明简述
[0013]发明人现在已经发现可以通过将细胞移植到受试者的视网膜而实现视网膜再生，所述细胞具有干细胞或祖细胞的性能，所述细胞与视网膜细胞融合，例如视网膜神经元，如视柱细胞等等，或视网膜胶质细胞，如MUller细胞，来形成杂交细胞，其重新激活神经元的前体标记，增殖，去分化并最终分化为目的末端分化后的视网膜神经元，如感光细胞、神经节细胞等等，其可以使损伤的视网膜组织再生。fct/β-连环蛋白信号通路的激活对诱导所述杂交细胞的去分化并最终再分化为目的视网膜神经元是至关重要的。在一个实施例中，Wnt/ β -连环蛋白信号通路的激活至少是部分地通过植入细胞来提供的(所述细胞用fct/β -连环蛋白信号通路激活剂，或用fct/β -连环蛋白信号通路阻断剂的抑制剂，和/或使Wnt/ β -连环蛋白信号通路激活剂过表达来处理),而在另一个实施例中,Wnt/ β -连环蛋白信号通路的激活仅仅由向待治疗的受试者施用fct/ β -连环蛋白信号通路激活剂，或Wnt/β -连环蛋白信号通路阻断剂的抑制剂来提供，或作为如例如视网膜变性疾病(例如色素性视网膜炎)中发生的视网膜损伤或伤害的结果来提供。在移植后的哺乳动物中，新生的视网膜神经元完全地再生视网膜，伴随一些功能性视力的挽救。组织学分析表明在移植两个月后，所述再生的视网膜与野生型哺乳动物的视网膜是无法区分的。这些数据表明细胞融合介导的再生是一种在哺乳动物视网膜中非常有效的方式，并且可以通过在所述移植细胞内的Wnt/β-连环蛋白信号通路的激活来触发，而且体内末端的分化视网膜神经元的重编是一种可能的组织再生机制。因此，可以应用这些教导来治疗视网膜变性的疾病。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1.细胞融合对照。(a)实验方案示意图。在HSPCsKFP/&e与LoxP-STOP-LoxP-YFP小鼠(R26Y)的视网膜神经元之间的体内细胞融合导致在视网膜神经元的终止密码子的切除，随后YFP的表达。所产生的杂交体表达RFP和YFP。(b)在视网膜下移植BIO-处理的HSPCs—24小时后，I^Ylrdl视网膜的代表性的荧光性显微照片。YFP阳性的细胞表示衍生自HSPC与I^eYlrdl视网膜细胞的细胞融合的杂交体。(c)靶基因Axin2的RT-PCR分析显示在BIO-处理的HSPC中β-连环蛋白信号激活。(d-e)在视网膜下移植BIO-处理的HSPCscee/efp24小时后，pl0野生型的R26Y视网膜的代表性的荧光性显微照片。没有检测到YFP-阳性的细胞(绿色)。在(e)中用DAPI复染细胞核。虚线示出了视网膜组织的最终的部分。OS:外节；0NL:外核层；INL:内核层。
[0015]图2.在Wnt/β-连环蛋白信号通路激活后，移植的HSPC融合并诱导的rdl小鼠视网膜细胞的去分化。(a-d)在视网膜下移植HSPCgke/kfp24小时之后，R26fdl小鼠视网膜的代表性的荧光性显微照片。随着HSPC (红色)与rdl视网膜细胞的细胞融合，在ONL中检测到了双-阳性的RFP/YFP (红色/绿色)杂交体，也有少量在INL中。这些YFP-阳性的杂交体(YFP，绿色)对于视柱细胞(视紫质；在13中为红色)和MUller (谷氨酰胺合成酶；在c中为红色)标记物也是阳性的，但对于视锥细胞(d)的标记物是非阳性的。(e_g)在P 10R26Yril眼睛中，移植未经BIO-处理(无ΒΙ0)和BIO-处理(BIO)的HSPCs?24小时后，细胞凋亡的感光体(e)和细胞凋亡的杂交体(f)和增殖的(g)杂交体的定量分析。用TUNEL阳性的感光体相对于总的感光体细胞核(e)的百分比或膜联蛋白V (f)或Ki67 (g)阳性的细胞相对于YFP阳性的杂交体细胞的总的百分比来估算数量。(h)在HSPC细胞、视网膜细胞和杂交细胞(如所显示的)中基因表达的实时PCR (如所显示的)。ONL:外核层；INL:内核层。
[0016]图3.去分化的杂交体的增殖和细胞凋亡分析。在PlO时，移植用BIO-处理的HSPCcee (BIO ；a, c)或未经 BIO-处理的 HSPCcee (无 BIO ；b, d)24 小时后，在所分析的 R26Yrdl小鼠的视网膜切片上膜联蛋白V (&，13)和灯67((3，(1)的代表性的免疫荧光染色。在融合后获得的YFP荧光(绿色)定位杂交体。细胞核用DAPI (蓝色)复染。黄色箭头指示细胞凋亡的杂交体(b)或增殖的杂交体(c-d)。
[0017] 图4.在去分化杂交体中，前体标记的表达的免疫荧光分析。在PlO时，移植用BIO-处理的HSPCGKE(B10; a-c)或未经BIO-处理的细胞(无BIO ；d-f)24小时后，来自R26Yril小鼠的视网膜切片中巢蛋白(a, d,红色)、头蛋白(Noggin) (b, e,红色)和0tx2 (c, f,红色)的代表性的免疫荧光染色。在融合后获得的YFP杂交体(绿色)仅仅在BIO-处理(a-c，黄色箭头)后对于这些标记是阳性的。
[0018]图5.在rdl小鼠中，视网膜再生的组织学分析时间进程。(a-h)在plO时，移植未处理的 HSPCsefp7cee (a, c, e, g)或 BIO-处理的(b, d, f, h)HSPCsKFP/CKE5 天(pl5 ;a_d)、10 天(p20 ；e, f)和15天(p25 ；g, h)后，在I^Ylrdl小鼠的视网膜切片中代表性的H&E染色(a、b、e-h)和TUNEL染色(c、d;红色)。(1-ρ)在plO (k-η)时，用未经处理的HSPC (m，n)或BIO-处理(k-1) HSPC未移植(1、j、ο、P)或移植的野生型(i，j )小鼠和rdl小鼠(k-p)代表性的H&E染色，均在p60进行分析。放大倍数:20 X，a-h、j、1、η、P ;5 X，1、k、m、ο。ONL:外核层。
[0019]图6.移植的R26rdl眼睛的组织学分析时间进程。(a-h)在plO移植未经处理的HSPCefp7cee (a, c，e, g)或 BIO-处理的(b, d, f,h) HSPCkf咖后，在 R26Yrdl 小鼠的视网膜切片中代表性的H&E染色(a, b, e-h)和TUNEL染色(c，d ;红色)，在移植后第5天(pl5;a_d)，10天(p20;e, f)和 15 天(p25 ；g, h)分析。(i_p)在 plO (k_n),未移植(i, j, ο, ρ)或移植未经处理的HSPC (m，η)或BIO-处理(k-1) HSPC的野生型(1、j )和rdl小鼠(k-p)的代表性的H&E染色，均在p60进行分析。放大倍数:20X，a-h、j、l、n、p ;5X，1、k、m、o。ONL:外核层；INL:内核层。
[0020]图7.在ρ60的杂交体分化分析。(a-f)没有移植(e)和在plO移植用BIO-处理的HSPC (a-d, f)的R26Yril小鼠的视网膜切片的代表性的免疫荧光染色，在p60进行分析。(a-d)YFP-阳性的杂交体(绿色)是对视紫质(a，红色)是阳性的，但是对于视锥细胞视蛋白(b，红色)，谷氨酰胺合成酶(C，红色)，和⑶31 (d，红色)为阴性。底部图像:红色和绿色的融合，细胞核也用DAPI (蓝色)进行复染。(e-f)视紫质(红色)，Pde6b (洋红)和用DAPI (蓝色)复染的细胞核。(g)野生型(wt)，以及移植未经处理的HSPC (rdlNT)或者用BIO-处理的HSPC (rdlBIO)的R26Yr il小鼠的视网膜中的Pde6b蛋白质表达的蛋白质免疫印迹法，所有分析在P60进行。用抗β_肌动蛋白抗体来标准化总蛋白溶解产物。0NL:外核层；INL:内核层；GCL:神经节细胞层。
[0021]图8.YFP阳性的杂交体表达H)E6B。(a)在plO移植未经处理的HSPCsgke细胞后2个月，来自R26Yril小鼠的视网膜切片中的视紫质(红色)的代表性的免疫荧光染色。既没有检测到YFP杂交体(绿色)，也没有检测到视紫质(红色)阳性的感光体。用DAPI复染细胞核。(b)在plO移植用BIO-处理HSPCs?，并在p60进行分析的R26Yril小鼠的代表性的视网膜切片。YFP阳性的杂交体(绿色)对于视紫质(红色)和Pde6b (洋红)都是阳性的。在融合图像中，用DAPI (蓝色)复染细胞核。0NL:外核层；INL:内核层；GCL:神经节细胞层。
[0022]图9.体内的损伤-依赖性细胞融合。(A)细胞融合实验方案的示意图。在体内，在红色-标记的SPCCre与LoxP-STOP-LoxP-YFP小鼠(R26Y)的视网膜神经元之间的细胞融合导致切除在视网膜神经元中终止密码子，并随后表达YFP。所产生的杂交体表达YFP，并且也标记为红色。(B，C)用HSPCsKFP/&e移植的R26Y小鼠的NMDA-损伤(B)或健康的视网膜(C)的共聚焦的显微照片。在组织损伤24小时之后处死小鼠。在NMDA损伤(B，NMDA)存在下检测到了衍生自细胞融合的双阳性RFP (红色)和YFP (绿色)杂交体，而在没有损伤的眼睛中(C，无NMDA)未检测到。用DAPI (蓝色)复染细胞核。Onl:外核层；inl:内核层；gcl:神经节细胞层。比例尺:50μπι。(D)在细胞移植24小时后形成的杂交体的定量分析，用在光学区域中定位的YFP-阳性的细胞在总的红色HSPCqwkfp的百分数来表示。分析NMDA-损伤和未-损伤(无NMDA)的眼睛的切片。数据是平均值土标准误差；n=90 (每只眼睛10个不同的视网膜连续切片的三个不同的视网膜区域，分析三只不同的眼睛)。**扑〈0.0Ol0(E-G):视网膜融合细胞部分的免疫组织化学的分析。在NMDA-损伤眼睛中，移植HSPCs&e12小时后检测，YFP杂交体对于神经节(E, Thyl.1,红色),无长突细胞(F,突触结合蛋白(sintaxin),红色)也是阳性的,或者对于Miiller (G, GS,红色)细胞标记是阴性的。黄色箭头表示细胞对于YFP和标记染色都是阳性的。比例尺:10 μ m。
[0023]图10.细胞融合现象的分析。(A)H&E染色(左)和视网膜组织的示意图。(B)NMDA注射之后48小时被处死的R26Y小鼠眼睛的切片的TUNEL染色(绿色)。(C) NMDA处理在R26Y小鼠中没有激活视网膜神经元中YFP的表达(绿色)。(D)对于每个实验至少在3只不同的眼睛中进行细胞移植。然后，每只眼睛总共检测10个连续切片，每个切片检测3个不同的区域。统计单独的切片上在视网膜的3个区域内的YFP-阳性的或GFP-阳性的免疫活性标记阳性的细胞的数目(40X光场)。在相同的区域中，后者数目和总的红色标记(DiD)细胞或RFP阳性的细胞数量之间的比值得出阳性细胞的百分比。在包括视网膜组织的gel和ini区域选择40X视野(红色矩形)。(E)在从用B10_HSPC&e移植的NMDA-损伤的R26Y视网膜分离的总细胞中，进行具有4C含量的DNA的四倍体细胞流式细胞仪分析。当开启RFP阳性的细胞(杂交体)时，检测到了在细胞周期的G2/M期的四倍体细胞的存在(右图表)，而在对照的未融合的RFP HSPCcre (左图表)中没有检测到。(F)视网膜融合部分的统计分析。在HSPCare移植到NMDA-损伤的R26Y眼睛12小时之后，表示YFP杂交体百分比的数量对于检测的神经节、无长突细胞或者MUller视网膜细胞标记也是阳性的。
[0024]图11.ESC 和 RSPC 融合事件分析。(A)将 DiD-ESCsare 和 DiD_RSPCs&e 注入用 NMDA预处理24小时以诱导细胞损伤的小鼠眼睛中，或注入到健康的眼睛(无NMDA)中的代表性样本。在R26Y眼睛中细胞注入24小时后(DiD细胞，红色)，在NMDA-损伤眼睛(NMDA冲检测到了 YFP表达(YFP，绿色)，但是在未损伤眼睛(没有NMDA)中没有检测到YFP表达(YFP，绿色)。用DAPI (蓝色)复染细胞核。比例尺:20μπι。(B) YFP-阳性的细胞用相对于在光学视野定位的移植DiD-ESCta和DiD-RSPCta的总数量的百分比来定量分析。在移植后24小时处死小鼠，分析NMDA-损伤和未-损伤眼睛的切片。数据是平均值土标准误差；η=30(对于每只眼睛，三个不同区域中的10个不同的视网膜连续切片)。P值〈0.001(#*)。(C)对R26Y小鼠注射NMDA (玻璃体内的)和BrdU (腹膜内的)；一天后，注射未标记的ESC (玻璃体内的)并且最后再过24小时后，在处死的小鼠的眼睛切片上进行BrdU染色。在40Χ视野计算总的BrdU阳性的细胞(红色箭头)。YFP阳性的杂交体对于BrdU染色(绿灯箭头)从不显示阳性。数据是平均值土标准误差；η=30。
[0025]图12.融合之后视网膜神经元的重编分析。(A)在用NMDA，或者NMDA和DKKl处理的眼睛，或作为对照的未处理的眼睛的切片上，使用抗β-连环蛋白抗体(红色)进行免疫荧光染色。在用DKKl处理之后，在NMDA-损伤眼睛(红色箭头)中检测到的在视网膜细胞中β-连环蛋白的表达和细胞核累积减少。比例尺:20μπι。(B)体内重编实验方案的示意图。注射未经处理(对 照)，或用BIO处理24小时的红色-标记SPC到Nanog-GFP-Puro受体小鼠的NMDA-损伤或未受损伤的眼睛中。注射一天后，在重编杂交体中分析GFP的表达。(C)NMDA处理没有激活Nanog-GFP视网膜神经元中GFP的表达(绿色)。(D-F)如图所示，在未经处理的(E)或者BIO-处理的(F)细胞中，通过靶基因Axin2的RT-PCR (D)或通过β-连环蛋白的核转运，HSPC的BIO处理激活的β -连环蛋白信号。(G)在健康的Nanog-GFP眼睛中，BIO-处理的HSPCkfp (红色)的移植没有诱导Nanog-GFP转基因(绿色)的再激活。用DAPI复染细胞核。
[0026]图13.在体内细胞融合后，Wnt/β-连环蛋白信号通路的激活增强神经元的重编。(A)体内重编实验方案的示意图。在注射HSPCk26y—天前，巢蛋白-CRE小鼠接收玻璃体内注入NMDA和DKKl、单独NMDA或作为对照的PBS。在移植以前，用或不用Wnt3a，或BIO预处理HSPCsk26y,并用DiD红色染料标记。在细胞移植24小时之后分析样品。Cre可以仅仅由于细胞融合和重编，由于巢蛋白促进剂的激活，在成年小鼠中再表达，诱导在保持红色膜的杂交体中YFP的表达。(B)仅仅存在NMDA而没有DKKl，移植红色HSPCsk26y的细胞开始表达YFP (绿色箭头)。黄色箭头表示双-阳性的红色和绿色细胞。在移植以前用fct3a预处理红色HSPCk26y增加了双-阳性的红色/绿色杂交体的量。比例尺:50 μ m (C-D)在移植未经处理的HSPC、或用Wnt3a或BIO-处理的HSPC24小时之后，在用NMDA、NMDA+DKK1处理的、或未经处理的(无NMDA)的巢蛋白-CRE(C)或Nanog GFP (D)视网膜中检测到的双红色/绿色(DiD/YFP)-阳性的杂交体的数量的统计分析。用在光学视野中检测到的YFP-阳性的细胞相对于总红色HSPC的数量来估算百分比。数据是平均值土标准误差；n=90。***P〈0.001。(E)在未受损伤的(无NMDA) Nanog-GFP视网膜和用Wnt3a (NMDA+Wnt3a)预处理的HSPC移植的NMDA Nanog-GFP视网膜的移植24小时后的共聚焦的显微照片。
[0027]图14.在体内细胞融合之后，fct/β-连环蛋白信号通路的激活增强神经元的重编。(A)代表样品，其中在Nanog-GFP-puro小鼠注射PBS (无NMDA)，或注射NMDA24小时之后注射DiD-ESC。在ESC注射24小时之后，在NMDA-损伤(NMDA)的ESC-神经元杂交体(红色和绿色)中检测到了 Nanog - GFP的表达(绿色)，但是在未经处理的眼睛(无NMDA)中没有检测到。用DKKl (NMDA+DKK1)预处理减少了 GFP-阳性杂交体的数量。相对于未经处理的ESC (无B10)，经BIO和Wnt3a预 处理的ESC增加GFP-阳性的重编神经元(红色/绿色)的数量。用DAPI (蓝色)复染细胞核。比例尺:20μπι。(B)从用BIO-处理(BIO)或未经处理的(无BIO) ESC移植的NMDA-损伤的Nanog-GFP眼睛中分离杂交体，其在嘌呤霉素筛选下体外培养。细胞培养一个月后，其中检测到平均23个GFP-阳性克隆。这些克隆也对于碱性磷酸酶染色是阳性的。(C)在存在或不存在BIO处理的情况下，移植RSPC (红色)不重编NMDA-损伤的视网膜神经元。用DAPI (蓝色)复染细胞核。(D)用NMDA预处理(NMDA)或未经NMDA预处理(无NMDA)的R26Y眼睛中，注射未经处理的或经BIO-处理的HSPCare (白条)，ESCare (灰色条)或者RSPCsare (黑色条)之后，YFP-杂交体的百分比的统计分析。
[0028]图15.重编的杂交体的特性。(A)在BIO (黑色条)或未经BIO-处理(灰色条)HSPC&e/RFP移植到R26Y NMDA-损伤的眼睛之后24小时，在根据FACS分选出的RFP阳性的杂交体中不同的基因表达的RT-PCR分析。(B)移植用BIO-处理的HSPCsto和随后用抗-0ct4、抗-Nanog、抗-巢蛋白、抗cKit或者抗Tuj-1抗体染色24小时的NMDA-损伤R26Y视网膜共聚焦的显微照片。YFP阳性的杂交体(绿色)对于0ct4、Nanog和巢蛋白(红色,箭头)表达也是阳性的，然而它们对于c-Kit或Tuj-1 (绿色，箭头)不是阳性的。比例尺:50 μ m。(C-D)在BIO-处理和DiD标记人类⑶34+HSPC移植到Nanog-GFP小鼠的NMDA-损伤眼睛24小时之后，使用在杂交体中FACS-分选的小鼠(C)或人类(D)特异的寡核苷酸通过RT-PCR评估种属特异性的基因表达。(E-J)用BIO处理(BIO)或未经处理的(无BIO) HSPCcre玻璃体内注射到NMDA-损伤R26Y眼睛中，24小时之后分析。为了评估YFP阳性的杂交体(绿色)的增殖(E-G和I)和细胞死亡(F、H和J)，切片进行染色或者用抗-Ki67 (G和I，红色)或抗-膜联蛋白V (H和J)抗体进行染色。阳性的杂交体的量评价作用Ki67 (E)或膜联蛋白V (F)阳性的细胞相对于总YFP杂交体的百分比来估算。数据是平均值土标准误差；n=30。P值〈0.001(***)。G和J中的黄色箭头分别表示Ki67阳性的杂交体或膜联蛋白V阳性的杂交体。比例尺:50μπι。(K-L)在BIO-处理(K)或者未经处理(L)的HSPC&e注射到R26Y小鼠的NMDA-损伤眼睛之后，在形成的YFP杂交体中对于ESC (0ct4, Nanog),中胚层(Gata4)，内胚层(Handl),神经外胚层(巢蛋白,Noggin和0tx2), HSPC (c-Kit和Seal)或末端的分化神经元(Tuj-1)的标记的表达进行评估，所述小鼠在细胞移植之后24小时(白色条)、48小时(灰色条)和72小时(黑色条)处死。数据是平均值土标准误差；n=30。
[0029]图16.在杂交体中的增殖和基因表达。(A-B)未移植NMDA-损伤R26Y视网膜(A)或未经处理的(无ΒΙ0，灰色条)，或BIO-处理的(ΒΙ0，黑色条)HSPC细胞的RT-PCR分析。(C)用DiD-标记和BIO-处理的人CD34+HSPC(红色)移植的NMDA-损伤Nanog-GFP视网膜的共聚焦的显微照片。检测YFP阳性的杂交体(绿色/红色细胞，黄色箭头)。(D-E)在NMDA-损坏R26Y眼睛中注射BIO-处理或未经处理的ESC之后获得的YFP-阳性的重编杂交体上进行Ki67 (D)和膜联蛋白V (E)染色。阳性的杂交体用阳性细胞相对于总的YFP杂交体的数量的百分比来估算。数据是平均值土标准误差；n=30。P值〈0.001 (#*)。(F)在BIO处理HSPCare注射入R26Y小鼠的NMDA-损坏眼睛之后，在所形成的YFP杂交体中对于中胚层(Gata4),内胚层(Handl),神经外胚层(巢蛋白，Noggin和0tx2),末端的分化神经元(Tuj-1)或ESCs (0ct4, Nanog)的标记的表达进行评估，所述小鼠在细胞移植之后24小时(白色条)，48小时(灰色条)和72小时(黑色条)被处死。数据是n=30的平均值。
[0030]图17.在移植的HSPC融合之后，NMDA-损伤视网膜可以再生。(A)在B10_HSPC&e移植之后I个月，在N MDA-损伤视网膜中，H&E染色显示内核层的厚度增加(ini，括号)和神经节细胞层(gcl，箭头)的再生增加。箭头表明在NMDA-损伤视网膜中神经节细胞损失。比例尺:50mm。(B-C)在gcl (B)中的神经节细胞核和在ini (C)中的细胞核行数的定量分析，移植用BIO-处理(BIO)或未经处理的HSPC的损伤(NMDA)或未受损伤的视网膜纵向视网膜切片的统计。数据是平均值土标准误差(n=30)。*#P〈0.001.(D)沿着鼻颞(左)和背腹侧的(右)轴计数在gcl中的神经元并用每平方毫米的细胞数的曲线图表示。对于每个样品统计组成整个视网膜的总共80个不同的图像。数据是3个视网膜的平均值土标准误差。*P〈0.01。ON:视神经。(E)沿着鼻颞(左)和背腹侧的(右)轴计数在gcl中的除外内皮细胞的总细胞，并用密度图曲线来表示。如在色条中表明的，暗红相应于10，000细胞/平方毫米的细胞密度。
[0031]图18.在细胞融合-介导的重编之后获得的杂交体的长期的分化潜力。(A)在BIO-处理或未经处理的HSPCare移植到NMDA-损伤R26Y视网膜中一个月之后，鉴定YFP+杂交体的实验策略。(B)在B10-HSPC&e移植一个月之后，在NMDA-损伤R26Y视网膜平片中检测YFP+神经元。用DAPI (蓝色)复染细胞核。比例尺:50μπι。在右侧组中显示了更高的放大倍数的YFP+神经元。(C)YFP+分化杂交体(绿色)表达神经节细胞标记SM1-32 (左侧，红色)或者无长突细胞标记Chat (右侧，红色)。(D)在用BIO-HSPCto移植的眼睛的视神经中检测到YFP+轴突(绿色)，然而在用未经处理的-HSPCto移植的眼睛中没有检测到。在右侧组中显示了在更高的放大倍数的所述视神经YFP+阳性轴突(绿色)。
[0032]图19.在内源BM松动术和细胞融合之后，骨髓更换效率的分析和杂交体增殖和细胞凋亡的分析。(A)在骨髓更换一个月之后，代表性的小鼠血液色谱细胞计数(haemochromocytometric)分析。(B-C)在来自接受:BMEFP/Cre 更换的小鼠的 NMDA-损伤 R26Y眼睛中注射B1024小时之后，在所获得的YFP-阳性重编的杂交体上进行Ki67 (B)和膜联蛋白V (C)染色。
[0033]图20.损伤眼睛中回收(recruite)的内源BM-衍生的细胞可以与视网膜神经元融合。(A)实验方案。在亚-致死剂量照射后，R26Y小鼠通过尾静脉注射接受BMKFP/&e移植。在BM重建之后(一个月)，右眼接受NMDA的玻璃体内的注射，左眼不注射；小鼠在24小时后分析。仅仅在回收的-BM细胞(红色)和神经元的细胞融合的情况下，才检测到YFP/RFP双阳性的杂交体。(B-F)在NMDA-损伤(B-C，NMDA)中检测到双阳性的YFP/RFP杂交体，但是在健康的眼睛中(D-E，无NMDA)没有检测到。(F)估算YFP/RFP双阳性的杂交体相对于总的检测的RF P细胞的百分比。(G-K)视网膜细胞-融合助手的免疫化学分析。在NMDA损伤24小时之后，YFP杂交体(绿色)对于Seal (G)和c-Kit (H) HSPC标记，和对于神经节(I，Thyl.1，红色)，无长突细胞(J，突触融合蛋白，红色)和MUller (K，GS，红色)视网膜细胞标记也是阳性的。黄色箭头表明双阳性的细胞。比例尺:50μπι。
[0034]图21.通过BIO诱导的内源BM细胞融合-介导的视网膜神经元的重编。(A)实验方案。在亚-致死剂量照射后，巢蛋白-Cre小鼠通过尾静脉注射接受BMk26y移植。在BM重建之后(一个月)，右眼接受B10+NMDA的玻璃体内注射，而对侧的眼睛单独注射NMDA。仅仅在回收的-BMCk26y和神经元之间的细胞融合-介导的杂交体重编的情况下，巢蛋白-介导的Cre表达才导致YFP的表达。(B-C)仅仅在BIO注射之后(C)，在招募的BM-细胞和损伤的神经元的融合之后，才检测到YFP阳性的重编杂交体(绿色)。相反无BIO的NMDA-损伤的眼中没有看到YFP杂交体(B)。(D-E)增殖(Ki67阳性的，D)或死亡(膜联蛋白V阳性的，E)杂交体的百分数，用YFP双阳性的细胞的数量相对于总的YFP细胞的数量来估算。数据是平均值土标准误差；n=30。(F-1) NMDA+B10处理的视网膜共聚焦的显微照片显示0ct4(在F-G中红色)和Nanog (红色在H-1中红色)蛋白质在YFP-重编重编杂交体中的表达(绿色，看到并入融合至G和I)。0ct4和Nanog阳性的杂交体(E)的百分数，用YFP双阳性的细胞的数量相对于总的YFP细胞的数量来估算。数据是平均值土标准误差；n=30。
[0035]图22.在HSPC移植之后，巨噬细胞/单核细胞分析。(A)未经处理的HSPC移植一个月之后，平片式NMDA-损伤视网膜的代表性的共聚焦图像。仅仅检测到少数YFP+细胞(绿色)。比例尺:50 μ m。(B)在NMDA-损伤R26Y眼睛中移植HSPC&e24小时之后，采集视神经。比例尺:200 μ m。(C-F)在NMDA-损伤R26Y眼睛中移植HSPCCre/RFP之后24小时(C，D)和2周(E，F)之后，用RFP+/YFP+杂交体对于CD45 (C-E)和Macl (D-F)染色同样是阳性的的百分比进行FACS分析。
[0036]发明详述
[0037]通过植入一些类型的细胞到受试者的视网膜可以实现视网膜再生，所述细胞具有干细胞或祖细胞的性质，如造血干细胞、祖细胞和/或间质干细胞。这些细胞与视网膜细胞融合，如视网膜神经元，例如视柱细胞、神经节细胞、无长突细胞等等，或与视网膜胶质细胞融合，例如MUller细胞，来形成杂交细胞，其随后去分化并最终分化为目的视网膜神经元，例如光感受器细胞和/或神经节细胞等等，其中在所述植入细胞或在杂交细胞中fct/β-连环蛋白信号通路的激活对于诱导所述杂交细胞的去-分化和最终的再-分化为目的视网膜神经元是必要的。在一个实施例中，fct/β-连环蛋白信号通路的激活是至少部分地由植入细胞(其已经用fct/ β -连环蛋白信号通路激活剂，或用Wnt/ β -连环蛋白信号通路阻断剂的抑制剂来处理，和/或过表达fct/ β -连环蛋白信号通路激活剂)来提供，而在另一个实施例中，Wnt/ β -连环蛋白信号通路的激活是仅仅由于对待治疗的受试者施用Wnt/β -连环蛋白信号通路激活剂，或fct/ β -连环蛋白信号通路阻断剂的抑制剂来提供，或由于视网膜损伤或伤害，出现在如视网膜变性疾病中。
[0038]具有干细胞或祖细胞的性能的细胞用于治疗视网膜变性疾病的用途，其通过Wnt/ 连环蛋白通路的激活的介导，重编融合到所述细胞的视网膜细胞
[0039]治疗A
[0040]一方面，本发明涉及一种用于治疗视网膜变性疾病的细胞，所述细胞具有的激活的Wnt/ β -连环蛋白信号通路，并选自由造血干细胞、祖细胞、间质干细胞所组成的组。换言之，依据该方面，本发明提供一种细胞，其选自由造血干细胞(HSC)、祖细胞、间质干细胞(MSC)所组成的组，其中所述细胞的Wnt/β-连环蛋白信号通路是激活的，该细胞用于视网膜变性疾病的治疗。
[0041]因而，本发明提供一种用于治疗视网膜变性疾病的细胞，其选自由造血干细胞、祖细胞和间质干细胞所组成的组，其中所述细胞是用fct/β-连环蛋白信号通路激活剂处理、或用Wnt/ β -连环蛋白信号通路阻断剂的抑制剂处理，和/或它是一种过表达fct/β-连环蛋白信号通路激活 剂的细胞。作为所述处理的结果，或操作细胞来过表达fct/β -连环蛋白信号通路激活剂，所述细胞具有激活的fct/ β -连环蛋白信号通路，并可以用于视网膜变性疾病的治疗。因此，将这样处理或操作的细胞植入到需要视网膜变性疾病治疗的受试者的眼睛中。
[0042]换言之，本发明的这个方面涉及一种细胞在制备用于治疗视网膜变性疾病的药物组合物中的应用，所述细胞具有激活的fct/ β -连环蛋白信号通路，所述细胞选自由造血干细胞、祖细胞和间质干细胞所组成的组；或可替代地，本发明的这个方面涉及一种选自由造血干细胞、祖细胞和间质干细胞的细胞在制备用于治疗视网膜变性疾病的药物组合物的用途，其中所述细胞用fct/β -连环蛋白信号通路激活剂处理，或用Wnt/β -连环蛋白信号通路阻断剂的抑制剂来处理，和/或过表达fct/ β -连环蛋白信号通路激活剂。
[0043]根据治疗A，Wnt/ β -连环蛋白信号通路的激活是至少部分地通过植入具有激活的Wnt/ β -连环蛋白信号通路的，并选自由造血干细胞、祖细胞和间质干细胞所组成的组细胞来提供。待治疗的受试者也可以在视网膜损伤或伤害之后激活fct/β-连环蛋白信号通路。总的来说，当靶基因转录时，fct/β-连环蛋白信号通路被激活；举例说明，可以通过常规技术来证实fct/ β -连环蛋白信号通路的激活，例如，通过分析靶基因(如Axin2)的表达，通过本领域技术人员熟知的方式来分析基因的表达，诸如RT-PCR(逆转录-聚合酶链式反应),或通过常规技术来检测在所述细胞的细胞核中fct/ β -连环蛋白易位,诸如通过免疫染色，或通过检测散乱蛋白(Dishevelled)的磷酸化作用或LRP尾部的磷酸化作用等。
[0044]激活Wnt/ β -连环蛋白信号通路的方式可以不同。举例说明，如下文所述，在一种选自由造血干细胞(HSC)、祖细胞和间质干细胞(MSC)所组成的组的细胞中，Wnt/β-连环蛋白信号通路的激活可以通过用fct/ β -连环蛋白信号通路激活剂处理或或用Wnt/ β -连环蛋白信号通路阻断剂的抑制剂处理来实现，或通过操作所述细胞来过表达一种蛋白质或肽，所述蛋白质或肽是fct/β-连环蛋白信号通路激活剂来实现。如下文将论述的，可替代地，Wnt/β-连环蛋白信号通路的激活可以作为视网膜损伤或伤害的结果来完成，如出现在例如视网膜变性疾病中，或通过给予fct/β-连环蛋白信号通路激活剂至待治疗的受试者，或给予一种fct/ β -连环蛋白信号通路阻断剂的抑制剂至待治疗的受试者，以这种方式激活所述通路。
[0045]如本文使用的术语“造血干细胞”或“HSC”，复数形式“HSCs”涉及一种多能的干细胞，其产生所有的血细胞类型，从髓细胞(单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、红细胞、巨核细胞/血小板和树突细胞)，和淋巴细胞系(T-细胞、B-细胞、NK-细胞)。HSC是一种异源群体。干细胞分三类，通过在血液中它们的淋巴与髓细胞样的后代的比值来区分(L/M)。髓细胞样的-偏向(My-bi)HSC具有低的L/M比值(>0，〈3)，而淋巴-偏向(Ly-bi)HSC显示大的比值(>10)。第三类由均衡的(Bala)HSC组成，其3 ( L/
10。作为干细胞，HSC通过它们的重新补足所有的血细胞类型的能力(多能性)和它们的自我更新能力来定义。关于表型，HSC是通过它们的小型，缺少谱系(Iin)标记，用活体染料着色低(侧群)诸如若丹明123 (若丹明DULL，也称为rholo)或Hoechst33342，和在它们的表面存在各种抗原的标记来鉴定。在人类中，大多数HSC是⑶34+⑶38-⑶90+⑶45RA-。然而所述组合不覆盖所有的HSC，尽管如此，所述组合很普遍。实际上，甚至在人类中，也有HSC是⑶34-⑶38-。在一个优选的实施例中，HSC是哺乳动物细胞，优选地人类细胞。
[0046]在一个具体的实施例中，HSC是一种长期的HSC (LT-HSC),即能够促进造血作用数月甚至一生的造血干细胞，其特征在于CD34-、CD38-、SCA-1+, Thyl.1+/低、C_kit+、Iin-,CD135-、Slamf1/CD150+。
[0047]在另一个具体的实施例中，HSC是一种短期的HSC (ST-HSC),即一种具有局限于几周的再生能力的 HSC，它是 CD34+、CD38+、SCA-1+, Thyl.1+/ 低、C_kit+、Iin-, CD135-、Slamfl/CD150+、Mac-1 (CDllb)低。
[0048]如本文使用的术语“CD34”涉及在人体内存在的某些细胞上的分化抗原。它是一种细胞表面糖蛋白并用作细胞-细胞粘着因子。它可以同时介导干细胞到骨髓细胞外基质或直接地到基质细胞的附着。表达CD34的细胞(CD34+细胞)通常发现于脐带和骨髓如造血细胞、间质干细胞的亚型、内皮的祖细胞、血管的内皮细胞，但在淋巴管没有发现。人类CD34的完整的蛋白质序列具有UniProt登录号P28906(2012年7月26日)。
[0049]如本文使用的术语“CD38”涉及分化抗原簇38，又名环ADP核糖水解酶，是一种在许多免疫细胞(白细胞)表面发现的糖蛋白，其包括CD4+、CD8+、B细胞和天然杀伤细胞。CD38同样在细胞粘着、信号转导和钙信号中起作用。CD38是一种II类跨膜蛋白质，用作一种信号分子并介导淋巴细胞和内皮细胞之间的粘着。它同样用作第二信使环ADP核糖的酶促形成和水解。在造血 系统中，⑶38在血浆细胞上最高表达。人类⑶38完整的蛋白质序列具有 UniProt 登录号 P28907 (2012 年 7 月 26 日)。
[0050]如本文使用的术语“⑶90”或Thy-1涉及分化簇90，一种25 - 37kDa重N-糖基化的，具有单个V样免疫球蛋白域(所述免疫球蛋白域是一类蛋白质结构域，其由设置在两个β-折叠中7和9之间的反平行β折叠链的具有希腊钥匙拓扑结构的2-层三明治组成)的锚定糖磷脂酰肌醇(GPI)的保守细胞表面蛋白，最初发现作为一种胸腺细胞抗原。人类CD90的完整的蛋白质序列具有UniProt登录号Ρ04216 (2012年7月26日)。
[0051]如本文使用的术语“CD45”涉及由多个成员组成的家族，其是所有单个复杂基因的产物。该基因包含34个外显子和初级转录物的三个外显子，可选择地拼接生成最多八个不同的成熟mRNA，和在翻译后生成八个不同的蛋白质产物。这三个外显子产生RA、RB和RC亚型。CD45 存在各种亚型:CD45RA、CD45RB、CD45RC、CD45RAB、CD45RAC、CD45RBC、CD45R0、CD45R (ABC)。人类CD45完整的蛋白质序列具有UniProt登录号P08575 (2012年7月26日)。
[0052]术语“SCA-1”涉及功能未知的脊髓小脑共济失调蛋白(ataxin) I。人类SCA-1完整的蛋白质序列具有UniProt登录号P54253 (2012年7月26日)。
[0053]术语“c-kit”涉及一种肥大/干细胞生长因子受体(SCFR)，也称为原癌基因C-Kit或酪氨酸-蛋白激酶Kit或⑶117，是一种在人类中由KIT基因编码的蛋白质。⑶117是一种受体酪氨酸激酶类型III，其连接到干细胞因子，又名“青灰因子”或“c-kit配体”。人类c - kit的完整蛋白质序列具有UniProt登录号P10721 (2012年7月26日)。
[0054]如本文使用的术语“⑶135”涉及分化抗原簇135 (⑶135)，也称作Fms样酪氨酸激酶3 (FLT-3)，或受体型酪氨酸-蛋白质激酶。⑶135是一种在造血的祖细胞表面上表达的细胞因子受体。人类⑶135完整的蛋白质序列具有UniProt登录号P36888 (2012年7月26 曰)。
[0055]如本文使用 的术语“SLAMF1”涉及信号转导淋巴细胞的激活分子，是一种在人类中由SLAMFl基因编码的蛋白质。近来SLAMFl同样被指定为⑶150 (分化抗原簇150)。人类SLAMFl完整的蛋白质序列具有UniProt登录号Q13291 (2012年7月26日)。
[0056]如本文所使用的术语“Mac-Ι (⑶lib)”涉及整合蛋白a M (ITGAM)，是一种形成异质二聚体的整合蛋白α-Μβ-2 ( αΜβ 2)分子的蛋白质亚基，也称为巨噬细胞-1抗原(Macl)或补体受体3(CR3)。ITGAM也称为CR3A，分化抗原分子簇llB(CDllB)。人类Mac-1完整的蛋白质序列具有UniProt登录号P11215 (2012年7月26日)。
[0057]所述术语“lin”涉及谱系标志物，设计一种标准的鸡尾酒式的抗体以从样品中移出成熟的造血细胞。那些抗体靶向是在小鼠中的CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、NKl.1、B220、TER-119、和Gr-Ι，以及在人类中的⑶3 (T淋巴细胞)、⑶14 (单核细胞)、⑶16 (NK细胞，粒细胞)、⑶19 (B淋巴细胞)、⑶20 (B淋巴细胞)和CD56 (NK细胞)。
[0058]“祖细胞”涉及一种通过分化衍生自干细胞的细胞，并且能够进一步分化为更成熟细胞类型。相较于干细胞，祖细胞典型地具有更多受限制的增殖能力。在一个具体实施例中，所述祖细胞是一种衍生自HSC通过在从HSC到分化功能的细胞期间分化的造血祖细胞。所述造血祖细胞的特征在于标记物⑶34+⑶38-⑶90-⑶45RA-。在一个优选的实施例中，所述祖细胞是哺乳动物的细胞，优选地人类细胞。
[0059]在一个具体的实施例中，所述祖细胞是早期多潜能祖细胞(早期MPP)，其特征在于 CD34+、SCA-1+, Thyl.1-、C-kit+, lin-、CD135+、Slamf 1/CD150-、Mac-1 (CDllb)低、CD4低。
[0060]在另一个具体的实施例中，所述祖细胞是晚期多潜能祖细胞(延迟MPP)，限定为CD34+、SCA-1+、Thy 1.1-、C-kit+, lin-、CD 135 高、Slamf 1/CD150-、Mac-1 (CDllb)低、CD4低。
[0061]在另一个具体的实施例中，所述祖细胞是谱系受限的祖细胞(LRP)细胞，其特征在于 CD150-CD48+CD244+。
[0062]在另一个具体的实施例中，所述祖细胞是普通骨髓祖细胞(CMP)，即产生骨髓细胞的群落形成单位，特征在于⑶34+⑶38+IL3Ra低⑶45RA-。在另一个具体的实施例中，所述祖细胞是粒细胞-巨噬细胞祖细胞(GMP)，成单核细胞和原粒细胞的前体，特征在于CD34+CD38+IL3Ra-CD45Ra-。
[0063]在另一个具体的实施例中，所述祖细胞是巨核细胞-红细胞祖细胞(MEP)，特征在于 CD34+CD38+IL3RA+CD45RA-。
[0064]如本文所使用的术语“CD4”涉及分化抗原簇4。它是一种在免疫细胞的表面上发现的糖蛋白，例如T辅助细胞、单核细胞、巨噬细胞和树突细胞。CD4是一种共-受体，其辅助T细胞受体(TCR )与抗原呈递细胞。利用它的位于T细胞内部的部分，CD4通过招募酶来放大通过TCR产生的信号，所述酶已知为酪氨酸激酶lck，其对 于激活包含在激活T细胞的信号级联中的许多分子是必不可少的。CD4利用它的胞外域也直接地与在抗原呈递细胞表面上的II类MHC分子相互作用。人类⑶4完整的蛋白质序列具有UniProt登录号P01730 (2012年7月26日)。
[0065]如本文使用的术语“⑶244”涉及⑶244分子，天然杀伤细胞受体2B4。该基因编码一种在天然杀伤(NK)细胞(和一些T细胞)上表达的细胞表面受体，其介导非-主要组织相容性复合体(MHC)限制的杀伤。通过这个受体在NK-细胞和靶细胞之间的相互作用被认为是调节NK-细胞细胞溶解的活性。人类CD244的完整蛋白质序列具有UniProt登录号Q9BZW8(2012 年 7 月 26 日)。
[0066]如本文使用的术语“IL3RA”涉及白细胞介素3受体，α (低亲合力)(IL3RA)，也称为⑶123 (分化抗原簇123)，是一种41.3Kda的I类跨膜蛋白，IL3RA已经显示出与白细胞介素3相互作用。人类的IL3RA完整的蛋白质序列具有UniProt登录号P26951 (2012年7月26日)。
[0067]如本文使用的术语“间质干细胞”或“MSC”，复数形式“MSCs”，涉及一种多能基质细胞，其能够分化为各种细胞类型，包括:成骨细胞(骨细胞)、软骨细胞(软骨细胞)和脂肪细胞(脂肪细胞)。通过间质干细胞表达的标记包括CD105(SH2)、CD73(SH3/4)、CD44、CD90 (Thy-1)、CD71和Stro-1,以及粘着分子CD106、CD166和CD29。MSC阴性的标记(没有表达)是造血标记⑶45、⑶34、⑶14，和共刺激分子⑶80、⑶86和⑶40以及粘着分子⑶31。
[0068]如本文使用的术语“⑶105”涉及内皮糖蛋白，一种位于细胞表面的I类糖蛋白，是TGFii受体复合体的一部分。人类⑶105的完整的蛋白质序列具有UniProt登录号P17813(2012 年 7 月 26 日)。
[0069]如本文使用的术语“⑶73”涉及5’ -核苷酸酶(5’ -NT),也称为外_5’ -核苷酸酶或⑶73 (分化抗原簇73)，是一种在人类中由NT5E基因编码的酶。人类⑶73的完整蛋白质序列具有UniProt登录号P21589 (2012年7月26日)。
[0070]术语“CD44”涉及抗原，是在细胞-细胞相互作用、细胞粘着和迁移中涉及的细胞表面糖蛋白。人类CD44的完整蛋白质序列具有UniProt登录号P16070(2012年7月26日)。
[0071]如本文使用的术语“⑶71”涉及转铁蛋白受体蛋白I (TfRl)，也称为(分化抗原簇71) (CD71)，是铁从铁传递蛋白向细胞传递所需要的蛋白质。人类CD71的完整蛋白质序列具有UniProt登录号P02786 (2012年7月26日)。
[0072]如本文使用的术语“STR0-1 ”涉及由骨髓基质细胞和红细胞前体表达的细胞表面蛋白。
[0073]术语“⑶106”涉及血管的细胞粘连蛋白1，也称为血管的细胞粘着分子I (VCAM-1)或分化抗原簇106 (CD106)，是一种在人类中由VCAMl基因编码并用作细胞粘着分子的蛋白。人类CD106的完整蛋白质序列具有UniProt登录号P19320 (2012年7月26日)。
[0074]如本文使用的“⑶166”涉及一种100_105kD的I类跨膜糖蛋白，其是蛋白质的免疫球蛋白超家族的成员。人类⑶166的完整蛋白质序列具有UniProt登录号Q13740 (2012年7月26日)。
[0075]如本文使用的术语“⑶29”涉及一种整联蛋白β-l，是一种与极晚期抗原受体相关的整联单元。人类⑶29的完整蛋白质序列具有UniProt登录号Ρ05556 (2012年7月26日)。
[0076]如本文使用的术语“⑶14”涉及分化抗原簇14，其是先天的免疫系统的组分。人类CD14的完整蛋白质序列具有UniProt登录号Ρ08571 (2012年7月26日)。 [0077]如本文使用的术语“⑶80”分化抗原簇80 (同样⑶80和B7_l)是在激活的B细胞和单核细胞上发现的蛋白质，其提供一种T细胞激活和存活所必需的共刺激信号。人类CD80的完整蛋白质序列具有UniProt登录号Ρ33681 (2012年7月26日)。
[0078]如本文使用的术语“⑶86”涉及分化抗原簇86 (也称为⑶86和Β7_2)，是在抗原呈递细胞上表达的蛋白，其提供T细胞激活和存活所必需的共刺激信号。人类CD86的完整蛋白质序列具有UniProt登录号Ρ42081 (2012年7月26日)。
[0079]如本文使用的术语“⑶40”，涉及一种在抗原递呈细胞上发现的共刺激蛋白，并为抗原递呈细胞的激活所需。人类⑶40的完整蛋白质序列具有UniProt登录号Ρ25942 (2012年7月26日)。
[0080]如本文使用的术语“⑶31”涉及一种血小板内皮细胞粘着分子(PECAM-1)，也称为分化抗原簇31 (CD31)，是在从身体中移除老化嗜中性粒细胞起关键作用的蛋白质。人类CD31的完整蛋白质序列具有UniProt登录号Ρ16284(2012年7月26日)。
[0081]可以测定在细胞中标记的存在与否，举例来说通过使用常规方法和设备的流式细胞仪。比如可以使用一种具有市场上可获得的抗体和在本领域已知的实验方案的BD LSR IIF流式细胞仪(BD生物科学公司，富兰克林湖，新泽西州，美国)。因而，可以选择放射一种对于特定细胞表面标记比背景噪音更强烈的信号的细胞。背景信号定义为与用来在常规的FACS分析中检测每个表面标记的特异性抗体的相同的同种型的非特异性的抗体给出的信号强度。为了使一种标记被认为是阳性的，观察到的特异的信号必须是相较于使用常规方法和设备的背景信号(例如通过使用FACSCalibur流式细胞仪(BD生物科学公司，富兰克林湖，新泽西州，美国)和市场上可获得的抗体)强20%、优选地30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、500%、1000%、5000%、10000%或以上。否则，认为细胞对于所述标记是阴性的。
[0082]在一个具体的实施例中，用于根据治疗A来治疗视网膜变性疾病的细胞是HSC，所述细胞具有激活的fct/β-连环蛋白信号通路。在另一个具体的实施例中，所述细胞是LT-HSC 或 ST-HSC。
[0083]在另一个具体的实施例中，用于根据治疗A来治疗视网膜变性疾病的细胞是祖细胞，所述细胞具有激活的fct/β -连环蛋白信号通路。在另一个具体的实施例中,所述祖细胞是早期 MPP、晚期 MPP、LRP、CMP、GMP 或 MEP。
[0084]在另一个具体的实施例中，用于根据治疗A来治疗视网膜变性疾病的细胞是MSC，所述细胞具有激活的fct/ β -连环蛋白信号通路。
[0085]根据本发明用于视网膜变性疾病的治疗的细胞可以形成所述细胞群的部分，所述细胞用于视网膜变性疾病的治疗构成本发明的一个额外的方面。
[0086]因而，在其它的方面，本发明进一步涉及一种包括多个细胞的细胞群，所述细胞具有激活的fct/ β -连环蛋白信号通路，并且选自由造血干细胞(HSC)、祖细胞、间质干细胞(MSC)及其任意组合所组成的组，用于视网膜变性疾病的治疗。因此，根据这个方面，本发明提供一种细胞群，其包括多个细胞，所述细胞细胞选自由造血干细胞(HSC)、祖细胞、间质干细胞(MSC)及其任意组合所组成的组，其中所述细胞的Wnt/β -连环蛋白信号通路是激活的，用于视网膜变性疾病的治疗。
[0087]换言之，本发明涉及一种用于治疗视网膜变性疾病的包括多个细胞的细胞群，所述细胞选自由HSC、祖细胞、MSC及其任何组合所组成的组，其中所述细胞用Wnt/β -连环蛋白信号通路激活剂处理，或用fct/ β -连环蛋白信号通路阻断剂的抑制剂处理，和/或所述细胞过表达Wnt/ β -连环蛋 白信号通路激活剂。由于所述治疗,或操作细胞来过表达fct/β_连环蛋白信号通路激活剂的蛋白质或肽，所述细胞群的细胞具有激活的fct/β-连环蛋白信号通路，可以用于视网膜变性疾病的治疗。为此将细胞群植入需要视网膜变性疾病治疗的受试者的眼睛中。
[0088]可选择地设计本发明的这个方面涉及包括多个细胞的细胞群在制备用于视网膜变性疾病的治疗的药物组合物中的用途，所述细胞具有它们的激活的fct/β -连环蛋白信号通路，并且选自由HSC、祖细胞、MSC及其任何组合所组成的组；或可选择地，涉及包括多个细胞的细胞群在制备用于视网膜变性疾病的治疗的药物组合物中的用途，所述细胞选自由HSC、祖细胞、MSC及其任何组合所组成的组，其中所述细胞用Wnt/β -连环蛋白信号通路激活剂处理，或用fct/ β -连环蛋白信号通路阻断剂的抑制剂处理，和/或所述细胞过表达Wnt/ β -连环蛋白信号通路激活剂，通过这种方式所述激活所述fct/ β -连环蛋白信号通路。
[0089]所述HSC、祖细胞和MSCs的详情参见上文。上述的治疗的具体目标在于激活Wnt/β连环蛋白信号通路，这将在下文论述。
[0090]在一个具体的实施例中，根据治疗Α，用于治疗视网膜变性疾病的细胞群其包括多种(即超过两种的HSs)，所述细胞具有激活的Wnt/ β -连环蛋白信号通路。在一个具体的实施例中，所述HSC选自LT-HSC、ST-HSC及其组合。
[0091]在另一个具体的实施例中，根据治疗Α，用于治疗视网膜变性疾病的所述细胞群，其包括多种祖细胞，所述细胞具有激活的fct/ β -连环蛋白信号通路。在一个具体的实施例中，所述祖细胞选自早期MPP、晚期MPP、LRP、CMP、GMP、MEP及其组合。
[0092]在另一个具体的实施例中，根据治疗Α，用于治疗视网膜变性疾病的所述细胞群，包括多种MSC，所述细胞具有激活的Wnt/ β -连环蛋白信号通路。
[0093]在一个具体的实施例中，根据治疗Α，用于治疗视网膜变性疾病的所述细胞群包括至少一种HSC和至少一种祖细胞，所述细胞具有激活的fct/ β -连环蛋白信号通路。在一个具体的实施例中，所述HSC细胞是LT-HSC或ST-HSC ;在另一个具体的实施例中，所述祖细胞是早期 ΜΡΡ、晚期 MPP、LRP、CMP、GMP、ΜΕΡ。
[0094]在另一个具体的实施例中，根据治疗Α，用于治疗视网膜变性疾病的所述细胞群包括至少一种HSC和至少一种MSC，所述细胞具有激活的Wnt/β -连环蛋白信号通路。在一个具体的实施例中，所述HSC细胞是LT-HSC或ST-HSC。
[0095]在一个具体的实施例中，根据治疗Α，用于治疗视网膜变性疾病的所述细胞群其包括至少一种祖细胞和至少一种MSC，所述细胞具有激活的Wnt/β -连环蛋白信号通路。在一个具体的实施例中，所述祖细胞是早期MPP、晚期MPP、LRP、CMP、GMP、MEP。
[0096]在另一个具体的实施例中，根据治疗Α，用于治疗视网膜变性疾病的所述细胞群包括至少一种HSC、至少一种祖细胞和至少一种MSC，所述细胞具有激活的Wnt/β -连环蛋白信号通路。在一个具体的实施例中，所述HSC细胞是LT-HSC或ST-HSC ;在另一个具体的实施例中，所述祖细胞是早期MPP、晚期MPP、LRP、CMP、GMP、MEP。
[0097]在一个具体的实施例中，可从骨髓获得的包括HSC、前体细胞和MSC的细胞群，本文有时定义为“HSPC”，即“造血的干细胞和祖细胞”。所述细胞群HSPC可以包括不同的比值或比例的HSC、祖细胞和MSC。所述HSPC细胞群可以举例来说，从骨髓获得，或可选择地通过以所需比值或比例混合HSC、祖细胞和MSC，来获得HSPC细胞群。本领域技术人员将理解所述细胞群通过传 统方法可以富集以任何类型特定细胞，例如，通过任何合适的基于使用用于相应表面标记的结合对的技术分离特定类型的细胞。因而，在一个具体的实施例中，HSPC细胞群可以富集HSC，或祖细胞，或MSC。为了使所述定义为HSPC的细胞群合适用于根据治疗A治疗视网膜变性疾病，必要的是所述细胞群的细胞具有激活的Wnt/ β -连环蛋白信号通路。
[0098]为了在本领域的教导下使用，为了最小化最终排斥或不希望有的副反应的风险，所述细胞可以来自相同受试者，即自体的，所述细胞具有激活的fct/β-连环蛋白信号通路并选自由造血干细胞、祖细胞和间质干细胞所组成的组，用于根据本发明的视网膜变性疾病的治疗，或所述细胞群用于根据本发明的视网膜变性疾病的治疗；尽管如此，本发明同时预期异源的细胞的用途，即来自其他的与受体受试者同种的受试者的细胞，其中，虽然视网膜具有低的免疫反应，但仍然推荐使用全身的或局部的免疫抑制剂，因此可以使用兼容来自不同的人类受试者的细胞，只要所述细胞选自HSC、祖细胞和MSC，并经受一种治疗或操作来使它们的fct/ β -连环蛋白信号通路如上所述被激活。
[0099]表述“Wnt/β-连环蛋白信号通路”涉及一种蛋白质网络，其在胚胎发育、细胞分化和细胞极性产生中发挥多种作用。除非另有陈述，它涉及典型的fct通路和包括当Wnt蛋白质与Frizzled家族的细胞表面受体结合时发生的一系列作用，引起受体来激活散乱蛋白(Dishevelled)家族蛋白质并最终导致到达细胞核的β-连环蛋白的量的变化。散乱蛋白(DSH)是膜-关联Wnt受体复合体的关键组分，当通过Wnt结合激活时其抑制包括axin、糖原合酶激酶3 (GSK-3),和结肠腺瘤样息肉蛋白(APC)的第二蛋白质的复合体。所述axin/GSK-3/APC复合体通常促进β_连环蛋白胞内的信号分子的蛋白降解。在抑制这个β_连环蛋白破坏复合体之后，细胞质的β-连环蛋白池稳定，一些β-连环蛋白能够进入细胞核并与TCF/LEF家族转录因子相互作用来促进特异基因表达。几种蛋白质激酶和蛋白质磷酸酶已经证明与细胞表面Wnt-激活的Wnt受体复合体结合到axin,和分解axin/GSK3复合体的能力有关。通过CKl和GSK3，LRP的胞质域的磷酸化作用可以调节axin结合到LRP。GSK3的蛋白激酶活性似乎对于膜-相关Wnt/FRZ/LRP/DSH/Axin复合体的形成，以及Axin/APC/GSK3/P-连环蛋白复合体的功能都是重要的。通过GSK3的β-连环蛋白的磷酸化作用导致β_连环蛋白的破坏。
[0100]如本文使用的“Wnt/β -连环蛋白信号通路激活剂”是指能够激活Wnt/β -连环蛋白信号通路的分子。一般而言，当所述靶基因转录时fct/β-连环蛋白信号通路激活；举例说明，通过分析靶基因的表达可以证实fct/ β -连环蛋白信号通路的激活，例如Axin2，通过RT-PCR，或通过检测在细胞的细胞核中的Wnt/ β -连环蛋白易位，通过例如免疫染色，或通过检测散乱蛋白的磷酸化或LRP尾部的磷酸化等等。Wnt/ β -连环蛋白信号通路激活剂可以作用在fct信号蛋白的膜受体上，和作用于包括信号级联的蛋白质上。说明性而非限制性的Wnt/β -连环蛋白信号通路激活剂的例子包括肽或蛋白质，以及除了肽或蛋白质的化合物(即非肽药物，如:
[0101]-肽或蛋白质，例如Wnt 蛋白亚型，如 Wntl、Wnt2> Wnt2b/13> Wnt3> Wnt3a> Wnt4>Wnt5a> Wnt5b> Wnt6> Wnt7a> Wnt7b> Wnt8a> Wnt8b> Wnt9a> Wnt9b> WntlOa、WntIOb> Wntll 或者Wntl6 ; β -连环蛋白；脊椎蛋白(spondin)，如R-spondin等；或者其功能化变体,例如与先前提及的肽或蛋白质的氨基酸序列具有至少40%，典型的至少50%，有利地至少60%，优选地至少70%，更优选地至少80%,更加优选地至少90%同一性的氨基酸序列的肽或蛋白质，且其保持激活Wnt/β-连环蛋白信号通路能力；或
[0102]-非妝化合物，例如Gilbert等在Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters,第20卷，第一版，2010年I月I日，366-370中公开的2-(4-乙酰基苯偶氮基)_2_ (3，3-二甲基-3,4-二氢-2H-异喹啉-1-基亚基)-乙酰胺(IQl)、(2S)-2-[2-(茚满-5-基氧基)-9-(1，1'-联苯-4-基)甲基)-9H-嘌呤-6-基氨基]-3-苯基-丙-1-醇(QS11)、脱氧胆酸(DCA)、2-氨基-4-[3，4-( 二甲叉氧基)苄基氨基]-6-(3-甲氧基苯基)嘧啶或(杂)芳基嘧啶。
[0103]属于Wnt分泌蛋白质家族,并用作Wnt/ β -连环蛋白信号通路的激活剂的Wnt蛋白质亚型的例子，包括下列或其同源基因(Swiss-prot参考文献):
[0104]人类:Wntl:P04628 ；Wnt2:P09544 ；Wnt2b/13:Q93097 ；Wnt3:P56703 ；Wnt3a:P56704 ；Wnt4:P56705 ；Wnt5a:P41221 ；Wnt5b:Q9H1J7 ；Wnt6:Q9Y6F9 ；Wnt7a:000755 ；Wnt7b:P56706 ；Wnt8a:Q9H1J5 ；Wnt9a:014904 ；Wnt9b:014905 ；Wntl0a:Q9GZT5 ；Wntl0b:000744 ；Wnt 11:096014 ；Wntl6:Q9UBV4;
[0105]小鼠:ffntl:P04426 ；Wnt2:P21552.1 ；Wnt2b/13:070283.2 ；Wnt3:P17553 ；Wnt3a:P27467 ；Wnt4:P22724；Wnt5a:P22725 ；Wnt5b:P22726 ；Wnt6:P22727.1 ；Wnt8a:Q64527 ；Wnt9a:Q8R5M2 ；Wnt9b:035468.2 ；Wntl0a:P70701 ；Wntl0b:P48614 ；ffntll:P48615 ；Wnt16:Q9QYS1.1 ；
[0106]以及其功能亚型、变型或片段，即具有激活Wnt/β-连环蛋白信号通路的能力的功能亚型、变型或片段。[0107]β -连环蛋白的例子包括下列或它的同源基因(Swiss-prot参考文献):
[0108]人类:P35222；
[0109]小鼠:Q02248;
[0110]以及其功能亚型、变型或片段，即具有激活Wnt/β-连环蛋白信号通路的能力的功能亚型、变型或片段。
[0111]R-脊椎蛋白(RSpo)是典型的Wnt/ β -连环蛋白信号通路的4种分泌的激动剂，也称为富含半胱氨酸和包含单血小板反应蛋白域的蛋白质(Cristins)，R-脊椎蛋白共享大概 40% 的氨基酸同一性(Lowther, W.等(2005) J.Virol.79:10093; Kim, K.-Α.等(2006)Cell Cycle5:23)。所有的R-脊椎蛋白都包含两个邻近的富含半胱氨酸弗林蛋白酶样结构域，随后是血小板反应蛋白(TSP-1)基序和碱性残留物富集的区域。仅弗林蛋白酶样结构域是 β _ 连环蛋白稳定所需要的(Kim, K.-A.等(2006) Cell Cycle5:23;Kazanskaya, 0.等(2004)Dev.Cell7:525)。在小鼠中注射重组R-脊椎蛋白I引起β _连环蛋白的激活和肠隐窝上皮细胞的增殖，并改善实验性结肠炎(Kim，K.-A.等(2005) Science309:1256; Zhao，J.等(2007)Gastroenterologyl32:1331) ? R-脊椎蛋白 I (RSPOl)似乎通过与 Wnt 拮抗剂DKK-1竞争，与Wnt共-受体的结合，Kremen来调节Wnt/β-连环蛋白。这个竞争降低DKK-1/LRP-6/Kremen 复合体的内化作用(Binnerts, M.E.et al.等(2007) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA104:147007)。R-Spondins脊椎蛋白的说明性而非限制性的例子包括下列或它的同源基因(Swiss-prot参考文献)，其充当用作Wnt/ β -连环蛋白信号通路的激活剂:
[0112]人类:R-脊椎蛋白-1:Q2MKA7 ;R_ 脊椎蛋白 _2:Q6UXX9 ;R_ 脊椎蛋白 _3:Q9BXY4 ；R-脊椎蛋白-4:Q210M5，或它的功能型亚型、变型或片段，即具有激活Wnt/β-连环蛋白信号通路的能力的它的功能 的亚型、变型或片段，例如维持它们的功能型区域的它们的亚型、变型或片段。
[0113]所述(杂)芳基嘧啶的说明性而非限制性的例子包括下列式(I)-(IV)的化合物。
[0114]在一个具体的实施例中，所述(杂)芳基嘧啶是式(I)、(II)、(III)或(IV)的Wnt/β -连环蛋白信号通路的(杂)芳基嘧啶激动剂[表1]。
[0115]表1
[0116]Wnt/ β -连环蛋白信号通路的(杂)芳基嘧啶激动剂的说明性的例子
[0117]
[0118]
【权利要求】
1.一种用于治疗视网膜变性疾病的细胞，其选自由造血干细胞(HSC)、祖细胞和间质干细胞(MSC)所组成的组，其中所述细胞的Wnt/β-连环蛋白信号通路是激活的。
2.根据权利要求1所述的用于治疗视网膜变性疾病的细胞，其中所述细胞是一种用Wnt/ β -连环蛋白信号通路激活剂处理，或用Wnt/ β -连环蛋白信号通路阻断剂的抑制剂处理的细胞，和/或是一种过表达fct/β -连环蛋白信号通路激活剂的细胞。
3.根据权利要求2所述的用于视网膜变性疾病治疗的细胞，其中所述Wnt/β-连环蛋白通路激活剂选自由fct亚型、β-连环蛋白、R-脊椎蛋白、2-(4-乙酰基苯偶氮基)-2- (3，3- 二甲基-3，4- 二氢-2H-异喹啉-1-基亚基)-乙酰胺(IQl)、{2S) ~2~ [2~ (茚满-5-基氧基)-9- (1，I’ -联苯-4-基)甲基)-W-嘌呤-6-基氨基]-3-苯基-丙-1-醇(QSll)、脱氧胆酸(DCA)、2_氨基_4_[3，4_(亚甲基二氧基)苄基氨基]-6-(3-甲氧基苯基)嘧啶、表1所示的式(I)、(II)、(III)或者(IV)(杂)芳基嘧啶，及其组合所组成的组。
4.根据权利要求2所述的用于视网膜变性疾病治疗的细胞，其中所述Wnt/β -连环蛋白通路阻断剂的抑制剂是选自GSK-3抑制剂、SFRPl抑制剂，及其组合所组成的组。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的用于视网膜变性疾病治疗的细胞，其中所述视网膜变性疾病是选自由色素性视网膜炎、年龄相关性黄斑变性、斯特格病、视锥细胞-视柱细胞营养不良、先天性静止性夜盲、利伯先天性黑朦、贝斯特卵黄状黄斑营养不良、前部缺血性视神经病变、无脉络膜、年龄相关性黄斑变性、黄斑中心营养不良、Bietti晶体角膜视网膜营养不良、尤塞氏综合症，和衍生自初级病变的视网膜变性情况所组成的组。
6.根据权利要求5所述的用于治疗视网膜变性疾病的细胞，其中所述视网膜变性衍生自白内障、糖尿病或者青光眼。
7.用于治疗视网膜变性疾病的细胞群，其包含多种细胞，所述细胞是选自由造血干细胞(HSC)、祖细胞、间质干细胞(MSC)及其任意组合所组成的组，其中所述细胞的Wnt/β -连环蛋白信号通路是激活的。
8.根据权利要求7所述的用于治疗视网膜变性疾病的细胞群，其中所述细胞是用Wnt/β_连环蛋白信号通路激活剂，或者fct/β-连环蛋白信号通路阻断剂的抑制剂处理的细胞，和/或是过表达fct/β -连环蛋白信号通路激活剂的细胞。
9.根据权利要求8所述的用于治疗视网膜变性疾病的细胞群，其中所述Wnt/β-连环蛋白通路激活剂是选自由fct亚型、β-连环蛋白、R-脊椎蛋白、IQ1、QSlU DCA、2-氨基-4-[3，4-(亚甲基二氧基)苄基氨基]-6-(3-甲氧基苯基)嘧啶、表1中所示的式(I)、(II)、(III)或者(IV)的(杂)芳基嘧啶，及其组合所组成的组。
10.根据权利要求8所述的用于治疗视网膜变性疾病的细胞群，其中所述Wnt/β-连环蛋白信号通路阻断剂的抑制剂是选自由GSK-3抑制剂、SFRPl抑制剂，及其组合所组成的组。
11.根据权利要求7-10中任一项所述的用于治疗视网膜变性疾病的细胞群，其中所述视网膜变性疾病是选自由色素性视网膜炎、年龄相关性黄斑变性、斯特格病、视锥细胞-视柱细胞营养不良、先天性静止性夜盲、利伯先天性黑朦、贝斯特卵黄状黄斑营养不良、前部缺血性视神经病变、无脉络膜、年龄相关性黄斑变性、黄斑中心营养不良、Bietti晶体角膜视网膜营养不良、尤塞氏综合症，和衍生自初级病变的视网膜变性情况所组成的组。
12.根据权利要求11所述的用于视网膜变性疾病治疗的细胞群，其中所述视网膜变性衍生自白内障、糖尿病或者青光眼。
13.一种用于视网膜变性疾病治疗的细胞，其选自由造血干细胞(HSC)、祖细胞和间质干细胞(MSC)所组成的组，所述治疗通过在受试者的眼睛中所述细胞与所述视网膜细胞在所述细胞和视网膜细胞接触后的融合介导的视网膜细胞的重编进行，所述重排由视网膜细胞的Wnt/ β -连环蛋白信号通路介导。
14.根据权利要求13所述的用于治疗视网膜变性疾病的细胞，其与Wnt/β-连环蛋白信号通路激活剂，或fct/ β -连环蛋白信号通路阻断剂的抑制剂组合。
15.根据权利要求14所述的用于治疗视网膜变性疾病的细胞，其中所述Wnt/β-连环蛋白通路激活剂是选自由fct亚型、β_连环蛋白、R-脊椎蛋白、IQ1、QS11、DCA、2-氨基-4-[3，4-(亚甲基二氧基)苄基氨基]-6-(3-甲氧基苯基)嘧啶、表格I中所示的式(I)、(II)、(III)或者(IV)的(杂)芳基嘧啶，及其组合所组成的组。
16.根据权利要求14所述的用于治疗视网膜变性疾病的细胞，其中所述Wnt/β-连环蛋白信号通路阻断剂的抑制剂选自由GSK-3抑制剂、SFRPl抑制剂，及其组合所组成的组。
17.根据权利要求13-16中任一项所述的用于治疗视网膜变性疾病的细胞，其中所述视网膜变性疾病是选自由色素性视网膜炎、年龄相关性黄斑变性、斯特格病、视锥细胞-视柱细胞营养不良、先天性静止性夜盲、利伯先天性黑朦、贝斯特卵黄状黄斑营养不良、前部缺血性视神经病变、无脉络膜、年龄相关性黄斑变性、黄斑中心营养不良、Bietti晶体角膜视网膜营养不良、尤塞氏综合症，和衍生自主病症的视网膜变性情况所组成的组。
18.根据权利 要求17所述的用于治疗视网膜变性疾病的细胞，其中所述视网膜变性衍生自白内障、糖尿病或者青光眼。
19.一种用于治疗视网膜变性疾病的细胞群，其包含多种细胞，所述细胞是选自由造血干细胞(HSC)、祖细胞、间质干细胞(MSC)及其任意组合所组成的组，所述治疗通过在受试者的眼睛中所述细胞与所述视网膜细胞在所述细胞和视网膜细胞接触后的融合介导的视网膜细胞进行，所述重编通过视网膜细胞的fct/β -连环蛋白信号通路介导。
20.根据权利要求19所述的用于治疗视网膜变性疾病的细胞群，其与Wnt/β-连环蛋白信号通路激活剂，或fct/ β -连环蛋白信号通路阻断剂的抑制剂组合。
21.根据权利要求20所述的用于视网膜变性疾病治疗的细胞群，其中所述Wnt/β -连环蛋白通路激活剂是选自由fct亚型、β-连环蛋白、R-脊椎蛋白、IQ1、QSlU DCA、2-氨基-4-[3，4-(亚甲基二氧基)苄基氨基]-6-(3-甲氧基苯基)嘧啶、表格I中所示的式(I)、(II)、(III)或者(IV)的(杂)芳基嘧啶，及其组合所组成的组。
22.根据权利要求20所述的用于治疗视网膜变性疾病的细胞群，其中所述Wnt/β-连环蛋白信号通路阻断剂的抑制剂选自由GSK-3抑制剂、SFRPl抑制剂，及其组合所组成的组。
23.根据权利要求19-22中任一项所述的用于视网膜变性疾病治疗的细胞群，其中所述视网膜变性疾病是选自由色素性视网膜炎、年龄相关性黄斑变性、斯特格病、视锥细胞-视柱细胞营养不良、先天性静止性夜盲、利伯先天性黑朦、贝斯特卵黄状黄斑营养不良、前部缺血性视神经病变、无脉络膜、年龄相关性黄斑变性、黄斑中心营养不良、Bietti晶体角膜视网膜营养不良、尤塞氏综合症，和衍生自主病症的视网膜变性情况所组成的组。
24.根据权利要求23所述的用于视网膜变性疾病治疗的细胞群，其中所述视网膜变性衍生自白内障、糖尿病或者青光眼。
25.—种细胞组合物，其中细胞组合物的至少50%的细胞选自由造血干细胞(HSC)、祖细胞和间质干细胞(MSC)所组成的组的细胞，和其中所述细胞的Wnt/β-连环蛋白信号通路是激活的。
26.—种药物组合物，其选自下列的组: 1)一种药物组合物，其包括至少一种选自由造血干细胞(HSC)、祖细胞、间质干细胞(MSC)及其任意组合所组成的组的细胞和药学上可接受的载体，其中激活所述细胞的Wnt/β-连环蛋白信号通路，和 2)—种药物组合物，其包括至少一种选自由造血干细胞(HSC)、祖细胞、间质干细胞(MSC)及其任意组合所组成的组的细胞和药学上可接受的载体，与Wnt/β -连环蛋白信号通路激活剂或fct/ β -连环蛋白信号通路阻断剂的抑制剂组合。
27.—种试剂盒，其选自下列的组: 1)一种试剂盒，其包括至少一种选自由造血干细胞(HSC)、祖细胞、间质干细胞(MSC)及其任意组合物所组成的组的细胞，和使用试剂盒组分的说明书，其中所述细胞的fct/β-连环蛋白信号通路是激活的，和 2)—种试剂盒，其包括至少一种选自由造血干细胞(HSC)、祖细胞、间质干细胞(MSC)及其任意组合物所组成的组的细胞，其与fct/β -连环蛋白信号通路激活剂或Wnt/β -连环蛋白信号通路阻断 剂的抑制剂组合，和使用试剂盒组分的说明书。
28.一种根据权利要求27所述的试剂盒，用于治疗视网膜变性疾病的。
29.根据权利要求28所述的用于治疗视网膜变性疾病的试剂盒，其中所述视网膜变性疾病是选自由色素性视网膜炎、年龄相关性黄斑变性、斯特格病、视锥细胞-视柱细胞营养不良、先天性静止性夜盲、利伯先天性黑朦、贝斯特卵黄状黄斑营养不良、前部缺血性视神经病变、无脉络膜、年龄相关性黄斑变性、黄斑中心营养不良、Bietti晶体角膜视网膜营养不良、尤塞氏综合症，和衍生自初级病变的视网膜变性情况所组成的组。
30.根据权利要求28所述的用于治疗视网膜变性疾病的试剂盒，其中所述视网膜变性衍生自白内障、糖尿病或者青光眼。
【文档编号】C12N5/0793GK104011203SQ201280049453
【公开日】2014年8月27日 申请日期:2012年8月6日 优先权日:2011年8月5日
【发明者】玛丽亚·皮娅·卡斯马, 丹妮拉·桑格斯 申请人:玛丽亚·皮娅·卡斯马, 丹妮拉·桑格斯