专利名称：在载体上测试核酸并对其质量控制的方法
技术领域：
本发明涉及测试载体上的核酸的方法，其包括通过交联固定一条或多条核酸，其中每一条固定化的核酸包含仅一种碱基类型的核苷酸段(a stretch of nucleotides)，提供与所述核苷酸段互补的标记的寡核苷酸以及确定对于所述核酸的情况的评价标准。本发明进一步涉及用于测试载体上的核酸的试剂盒，其包含固定化在固体载体上的核酸阵列，其中每一条固定化的核酸包含仅一种碱基类型的核苷酸段以及与所述核苷酸段互补的标记的寡核苷酸。本发明还涉及标记的寡核苷酸用于测试固定化在固体载体上的核酸的情况的用途，所述寡核苷酸与仅一种碱基类型的核苷酸段互补。
背景技术：
在现代分子生物学和医学中，生物芯片或生物学微阵列，特别是DNA微阵列，已经成为重要的工具。通常地，芯片由大量的核酸分子构成的显微点排列组成，每一个显微点包含小量的特异的核酸序列。这个可以是，例如，基因或其他DNA元件的短片段，在允许捕获探针和相应的靶标结合的情况下，该短片段被用于作为捕获探针以杂交cDNA或cRNA样品(靶标或靶探针)。捕获探针-靶标杂交通常通过荧光团标记靶标的基于荧光的检测来检测和定量，以确定核酸序列在靶标中的相对丰度。 微阵列技术由DNA印迹进化而来，在其中片段DNA附着在基片(substrate)上，然后用已知的基因或片段探测。1987年，首次描述了阵列上的独特DNA的集合用于表达谱， 阵列DNA用于识别表达受到干扰素调节的基因。这些早期的基因阵列利用针点样装置，通过将cDNA点样到滤纸上来制作。小型化微阵列的应用，特别是在基因表达谱上的应用，在 1990年首次被报道。在微阵列上的完整的真核基因组在1997年公布。核酸寡聚探针已经长期应用于检测感兴趣的或靶探针中核酸序列的互补核酸序列，并已用于检测具体基因表达，例如，在RNA印迹中。在微阵列形式中，寡核苷酸探针被固定化在固体载体上。用这种方式制备的寡核苷酸阵列可以用于检测互补的靶核酸序列，如在TO 89/10977和WO 89/11548中描述的。在寡核苷酸微阵列中，探针通常是短序列，其被设计成与已知或预测的开放读码框部分序列相匹配。多种技术可以被用于制作这样的微阵列。这些技术包括用精细尖端的针点样 (printing)，使用预制掩膜的光刻法，使用动态微镜装置的光刻法，喷墨点样(Lausted C等人，2004，Genome Biology 5: R58)或者电化学。通常，捕获探针通过共价键结合到化学基质上，而附着到固体表面。例如，这样的固体表面可以具有显微珠子的形式。光刻技术通过直接在阵列表面合成序列，诉诸寡核苷酸阵列的生产。这种技术包括在硅基片上光刻合成，在基片上光和光敏掩膜剂被用于产生一条序列，每次通过全部阵列加一个核苷酸(Pease等人，1994，PNAS 91: 5022 - 50 )。每一条可用的探针在将阵列浸入单独一种核苷酸的溶液中之前选择性地去除掩膜，然后掩膜反应发生，下一套探针去除掩膜，为不同的核苷酸暴露做准备。几次重复之后，每条探针的序列完全构建。因此，构建的寡核苷酸可以较长(例如60-mers)或较短(例如25-mers)，依赖于预期的目的。在点样的微阵列中，寡核苷酸探针作为完整的序列被沉淀，即探针在沉淀到阵列表面前被合成，然后点样到基片上。通常的方法使用由机械臂控制的精细的针或针头构成的阵列，将其浸入含有DNA探针的孔中，然后在阵列表面上设定的位置沉淀每条探针，或者用喷墨点样装置，通过液滴喷射沉淀探针材料。产生的探针阵列代表了制备的捕获探针的核酸谱，并且可以与例如源自实验室和临床样品的互补的cDNA和cRNA靶探针相互作用。另外，这些阵列可以容易地为特别试验定制，因为探针和在阵列上的点样位置可以被特异地选择。在微阵列的制造过程中，知道基片上的每一条点是否存在并仍可以杂交是必须的。微阵列生产中点样和沉淀过程的控制、调整和微调已经被描述在例如GB 2355716中。然而，这种方法聚焦在点样过程本身，并包括喷墨装置的震动或仪器故障的检测， 但不提供技术方案以确保液滴正确和有效地沉淀在基片上或者允许控制在点样过程结束之后液滴的命运。这种点样控制方法不可用于点样的探针的质量评价。尤其是，不可确定沉淀的核酸捕获探针是否确实存在或能够与靶标分子杂交。因此，需要允许测试沉淀在载体上的核酸的情况和质量的方法。
发明内容
本发明满足了这个需要，并提供手段和方法，以允许对沉淀在支持物上的核酸固定和随后测试及质量控制。因此，本发明的一个目的是提供手段和方法，以允许控制在点样过程结束之后点样核酸的命运，并评价点样探针的质量。上述目的是通过测试在载体上的核酸的方法来实现的，其中包括通过热或光交联或者通过化学固定将一条或多条核酸固定化在固体载体上，其中每一条固定化的核酸包含仅一种碱基类型的核苷酸段，提供与仅一种碱基类型的核苷酸段互补的标记的寡核苷酸， 其中所述标记的寡核苷酸能够与每一条固定化的核酸分子在仅一种碱基类型的核苷酸段处形成复合物，以及通过与固定化的核酸形成复合物中标记的寡核苷酸的量来确定对于所述核酸的情况的评价标准。根据本发明中的方法的优点是提供廉价、多功能和通用的工具，以允许在简单而可靠的相互作用方案中控制和检查沉淀的核酸。该方法依赖于捕获探针核酸的存在和使用，其包含仅一种碱基类型的核苷酸段。这些核酸提供有效固定化在基片上的方法，其通过所述的仅一种碱基类型的核苷酸段，优选通过热或光交联来进行，作为进一步和独立的特征，允许仅一种碱基类型的核苷酸段与互补的寡核苷酸相等和一致的相互作用。因此，仅一种寡核苷酸类型是必要的，其比由多于一种碱基类型的核苷酸构成的寡核苷酸更容易合成，并降低了质量控制方案的总成本。由于寡核苷酸可以相当短，进一步降低成本是可行的。因此，本发明的一个主要优点在于直接和容易地详查点样和固定化过程的结果的可能性，特别是检查点样点是否完全丢失，分子是否没有正确地被固定化，原因在于例如过期的基片表面的自然降解，固定步骤应用的过长或DNA的降解或修饰，以至于不再能够进行杂
5交。此外，此方法是不会分开的(non-disruptive)并允许控制在基片上沉淀的核酸的情况， 同时生产过程的产量不会受到影响。在优选的实施方案中，另外可能的是在洗涤步骤后再将测试寡核苷酸用于后续对照反应。这种作用过程另外地有助于在沉淀的核酸的质量控制方面限制成本和时间。在本发明的一个具体方面，提供了测试载体上的核酸的试剂盒。所述试剂盒包含一个通过热或光交联或通过化学固定而固定化在固体载体上的核酸阵列，其中每一条固定化的核酸包含仅一种碱基类型的核苷酸段；以及与仅一种碱基类型的核苷酸段互补的标记的寡核苷酸，其中所述标记的寡核苷酸能够与每一条固定化的核酸在仅一种碱基类型的核苷酸段处形成复合物。在本发明的另一个方面涉及与仅一种碱基类型的核苷酸段互补的标记的寡核苷酸用于测试通过由热或光交联或通过化学固定而固定化在固体载体上的核酸的情况的用途，其中每一条固定的核酸包含仅一种碱基类型的核苷酸段，其中所述标记的寡核苷酸能够与每一条固定化的核酸在仅一种碱基类型的核苷酸段处形成复合物。在本发明优选的实施方案中，测试核酸的情况包括确定与所述固定化的核酸形成复合物中标记的寡核苷酸的量的评价标准。在本发明进一步优选的实施方案中，进行测试的核酸是单链DNA、RNA、PNA、CAN、 HNA、LNA或ANA，其寡核苷酸或其任何组合。在本发明进一步优选的实施方案中，包含在如上所述被测试的核酸中的所述仅一种碱基类型的核苷酸段是胸腺嘧啶、尿嘧啶或鸟嘌呤段。在本发明另一个优选的实施方案中，如上所述仅一种碱基类型的核苷酸段长度为约2到约100个核苷酸。在进一步特别优选的实施方案中，所述仅一种碱基类型的核苷酸段长度为约16个核苷酸。在本发明还另一个优选的实施方案中，如上所述用于在固体载体上固定化一个或多个核酸的交联是由波长为约200-300nm的光进行的交联。在特别优选的实施方案中，所述光交联是在波长254nm进行。在本发明另一个优选的实施方案中，如上所述用于在固体载体上固定化一个或多个核酸的交联是由波长为约300-500nm的光进行的交联。在特别优选的实施方案中，所述光交联是在波长365nm进行。在本发明进一步优选的实施方案中，如上所述用于在固体载体上固定化一个或多个核酸的交联是由波长为约200-300nm或300-500nm的光进行的交联，通过使用范围从约 0. 1 Joule/cm2到约10 Joule/cm2的能量来进行。在本发明进一步优选的实施方案中，如上所述用于在固体载体上固定化一个或多个核酸的化学固定是胺修饰的核酸和固体载体上相应的官能团的耦合。在特别优选的实施方案中，所述的官能团是环氧基、醛基、羧基或者NHS基。在本发明还另一个优选的实施方案中，如上所述仅一种碱基类型的核苷酸段位于所述核酸的3’或5’端。在本发明进一步优选的实施方案中，根据本发明将被固定化核酸以下列分子式表示
5，-Yn-Xm-Br-Xp-Zq-S'Y和Z是仅一种碱基类型的核苷酸段，其中，Y和Z可以是相同或不同的碱基类型；X是间隔，优选由脱碱基核苷酸组成；B是多于一种碱基类型的序列，n、m、r、p和q是核酸中核苷酸的数量，其中以下情况可以应用n、m、p、q、r >1 ； n、m、r > 1并且p、q = 0 ； p、q、r >1 并且 n、m = 0 ;n、q、r > 1 并且 m、ρ = 0 ;n、r > 1 并且 m、ρ、q = 0 ;q、r > 1 并且 η、 m、ρ = 0。在本发明进一步优选的实施方案中，如上述标记的寡核苷酸包含荧光的、放射性的或化学发光的标记物。在本发明的另一优选的实施方案中，如上所述的固体载体包含胺官能化的基团。 在本发明的特别优选的实施方案中，所述包含有胺官能化的基团的载体包含伯胺或仲胺。在本发明进一步特别优选的实施方案中，所述包含有胺官能化的基团的载体包含多孔基片。在甚至更优选的实施方案中，上述多孔基片由尼龙构成。在本发明进一步特别优选的实施方案中，所述包含有胺官能化的基团的载体包含无孔基片。在本发明甚至更优选的实施方案中，上述无孔基片由玻璃、聚-L -赖氨酸涂层材料、硝酸纤维素、聚苯乙烯、环烯烃共聚物(C0C)、环烯烃聚合物(COP)、聚丙烯、聚乙烯或聚碳酸酯构成。在本发明进一步优选的实施方案中，根据本发明上述方法，所述与仅一种碱基类型的核苷酸段互补的标记的寡核苷酸通过升高温度到超过所述寡核苷酸的解链温度而获得，以便在另外的方法步骤中再利用。在另一个方面，本发明涉及用于分析核酸的方法，其包括步骤(a)通过热或光交联或化学固定将一条或多条核酸固定化在固体载体上，其中每一条固定化的核酸包含仅一种碱基类型的核苷酸段；(b)提供与仅一种碱基类型的核苷酸段互补的标记的寡核苷酸， 其中所述标记的寡核苷酸能够与每一条固定化的核酸在仅一种碱基类型的核苷酸段处形成复合物；(c)检测与在仅一种碱基类型的核苷酸段之外的序列互补的特异性序列的存在；以及(d)通过在与固定化核酸形成的复合物中与仅一种碱基类型的核苷酸段互补的标记的寡核苷酸的量来确定所述核酸的情况的评价标准。优选地，步骤(b)和(C)同时进行。在本发明还另一个优选的实施方案中，根据本发明固定化核酸的质量可以在包括额外步骤的方法中另外测试，所述步骤包括
(i)提供至少一种标记的测试寡核苷酸，其与除在仅一种碱基类型的核苷酸段之外的预先确定的特定的核苷酸段互补，其中所述标记的寡核苷酸能够区别地与固定化的核酸形成复合物，所述固定化的核酸包含所述特定的核苷酸段；以及
(ii)通过在与固定化的核酸中的在仅一种碱基类型的核苷酸段之外的预先确定的特定的核苷酸段形成的复合物中所述测试寡核苷酸的存在来确定所述核酸的情况的评价标准，所述固定化核酸包含所述特定的核苷酸段。在本发明还另一个优选的实施方案中，如上所述的用于测试载体上的核酸的试剂盒另外包含至少一个标记的测试寡核苷酸，其与除在仅一种碱基类型的核苷酸段之外的预先确定的特定的核苷酸段互补，其中所述标记的寡核苷酸能够区别地与固定化的核酸形成复合物，所述固定化的核酸包含所述特定的核苷酸段。在本发明还另一个优选的实施方案中，在所述分析核酸的方法中，在根据本发明的所述确定固定化核酸的质量的方法中以及在如上所述用于测试载体上的核酸的试剂盒中，所述标记的测试寡核苷酸互补于除在仅一种碱基类型的核苷酸段之外的预先确定的特定的核苷酸段，所述标记的测试寡核苷酸用标记物标记，所述标记物在光学上或化学上区别于与仅一种碱基类型的核苷酸段互补的标记的寡核苷酸上的标记物。本发明的这些和其他特征、特点和目的将从以下结合附图和实施例的详细描述中变得显而易见，其通过说明本发明的原理来证明。描述仅用于举例目的，而不是限制本发明的范围。
图1显示了用于实施例中描述的实验的圆点模式的实例。图2A描述了膜的排布。点1至5 (参考号1至5)代表未标记的杂交点。这些点都包含了 16个胸腺嘧啶的尾(T16)，但对于每一个点，寡核苷酸的杂交部分包含了不同的序列。点6 (参考号6)包含带有荧光标记的寡核苷酸。该寡核苷酸用于网格和校准。图2B描述了其排布如图2A所示的膜在杂交前的图像。该图像仅显示了在如图2A 所示包含了荧光标记的寡核苷酸的点(参考号6)上有信号。图2C描述了图2B所示的膜用对照探针杂交后的图像。该膜与标记的A16寡核苷酸共同孵育。杂交点清晰可见。如图2A中所示，包含了带有荧光标记的寡核苷酸的点(参考号6)上的信号作为较大的点更加明显。图2D描述了图2C所示的膜在加热以从捕获探针点上去除对照寡核苷酸后的直接的图像。在图2C中可见的杂交点不再显示任何信号。图像仍然在如图2A所示包含有荧光标记的寡核苷酸的点(参考号6)上显示信号。图3描述了与互补于4号点(如图2A所示参考号4)上捕获探针的杂交部分的标记的反义寡核苷酸杂交后的膜的图像。膜之前在如图2B到2D中所述的对照和测试杂交方法时被使用过。粗方框标明的是与标记的反义寡核苷酸杂交后显示信号的点，对应为图2A 所示的4号点。图像表明膜上捕获探针在质量控制步骤中未受破坏，仍能够与反义寡核苷酸结合。图4A描述了不带T尾和带T16尾的捕获寡核苷酸(即包含16个胸腺嘧啶的延伸链)的实时杂交曲线。包含T16尾的寡核苷酸显示了增强的杂交信号，这要归因于较高的恢复(recovery)。图4B显示了沉淀的捕获寡核苷酸(包含T或A核苷酸)的归一化的恢复，其作为碱基类型(T或A)和碱基数量(2、4、8、16或32)的函数。以上结果表明，当T的数量从2增加到32，恢复可以为3-4倍的增加。图5描述带0、4和16个T的捕获探针与互补的、单错配((AG)突变)和双错配 ((AAGG)突变)杂合体(hybrid)的去结合曲线。捕获探针的固定化沿着曲线示意性地描述。 图显示由于互补的探针相对于错配的探针增加的解链温度，获得增强的选择性。图6显示了脱碱基位点的数目(0、2、4或8)对来自细菌物种的扩增子与互补及错配捕获探针杂交的杂交强度的影响。
具体实施例方式发明人已发现决定点样过程结束之后点样核酸的命运和评估点样探针的质量是有可能的。虽然本发明将用具体的实施方案描述，但是这种描述不以限制意义解释。在详细描述本发明示例性实施方案之前，给出对于理解本发明重要的定义。如本说明书和所附的权利要求书中使用的，“一”(“a”和“an”)的单数形式还包括各自的复数形式，除非上下文另有明确规定。在本发明的上下文中，术语“约”和“大约”表示精确度的间隔，本领域普通技术人员应理解其仍然保证提及特征的技术效果。该术语通常表示从指定数值偏差士 20%，优选士 15%，更优选士 10%，甚至更优选士 5%。可以理解的是术语“包含”(“comprising”)是非限制性的。对于本发明的目的， 术语“由……组成” ("consisting of”)被认为是术语“包含” ("comprising of”)的优选实施方案。如果在下文中，一组(a group)被定义为包含至少某种数量的实施方案，这意味着还包括优选只由这些实施方案组成的一组。此外，在说明书和权利要求书中，术语“第一”、“第二”、“第三”或“(a)”、“(b)”、 “(c)”、“(d)”等以及相似术语被用于区别相似的要素，而不必须用于描述顺序或时间顺序排列。应理解的是如此使用的术语是在适当情况下可以互换的，并且本文所述的发明的实施方案能够按不同于本文中描述或说明的其他顺序操作。在术语“第一”、“第二”、“第三”或“(a) ”、“ (b ) ”、“( c )，，、“(d)”等涉及方法或使用的步骤的情况下，步骤之间没有时间或时间间隔一致性，即步骤可以同时进行或这些步骤之间可以存在几秒钟、几分钟、几小时、几天、几周、几个月甚至几年的时间间隔，除非在如本文下述的应用中另外指出。如上文已经陈述的，本发明在一个方面涉及用于测试载体上的核酸的方法，其包括(a)通过热或光交联或化学固定将一种或多种核酸固定化在固体载体上，其中每一种固定化的核酸包含仅一种碱基类型的核苷酸段，(b)提供与仅一种碱基类型的核苷酸段互补的标记的寡核苷酸，其中所述标记的寡核苷酸能够与每一条固定化的核酸在仅一种碱基类型的核苷酸段处形成复合物，以及(c)通过与固定化的核酸形成复合物中标记的寡核苷酸的量来确定对于所述核酸的情况的评价标准。术语“将核酸固定化在载体上”涉及核酸分子通过分子相互作用结合到支持的基片上，这种相互作用将核酸定位到支持基片上的特定区域中，并随即阻止了例如在洗涤、漂洗或化学杂交步骤中核酸的分离。通常地，这种分子相互作用基于载体材料结构元件或官能团与要被固定化的核酸例如核酸相应的官能团之间的共价化学键，如本领域普通技术人员已知的。术语“固体载体”表示载体材料以非液体坚固性为主，从而允许核酸在载体材料上的精确和可追踪的定位。术语“热或光交联”涉及通过在能量源如热或光提供的能量的影响或驱动下，经由将结构元件连接在一起的分子相互作用或键的形成，所述载体材料和所述核酸之间的相互作用。通常地，热交联通过干燥和随后在某种温度下烘烤基片上核酸分子来进行。干燥和烘烤被认为导致核酸通过疏水相互作用附着在基片上，虽然结合的精确性质尚不清楚。 此过程可归类为物理吸附亚型。术语“物理吸附”涉及包括初始的分离和吸引步骤的过程，由此核酸与反应基团靠近，这基于物理吸附过程。生物分子例如核酸吸附到固体载体上可以发生在实际任何载体材料上，因为已观察到任何这样的载体材料均可与几乎任何表面相互作用。通常，载体材料与核酸分子之间相互作用的水平发生变化，其取决于载体材料的性质和形式及核酸的大小和化学特性。这种相互作用通常是五阶段程序，包括步骤(i)将分子运输到表面，(ii)吸附到表面，(iii)吸附分子的重排，(iv)吸附分子潜在的去吸附以及 (ν)将去吸附的分子运输离开表面。虽然该程序在某种程度上意味着去吸附的可能性是固有的，但是结合通常是不可逆的，其取决于分子大小。在吸附相互作用的上下文中，术语“分子大小”涉及存在的结合位点的数目。尽管任何一个结合位点理论上可以在任何时间从基片的表面上分离，但是大量结合位点的效果是分子作为一个整体将保持结合。通过施用热形式的能量，例如，在约40 到150°C的温度下，优选50到120°C，更优选60到110°C，甚至更优选70到100°C，最优选 80到90°C，核酸分子向载体材料的物理吸附可以被加强，有效固定化的必需时间可以被缩短。热交联可以进行本领域普通技术人员已知的任何适合的时间长度，例如2分钟到12小时，优选10分钟到8小时，更优选30分钟到6小时，甚至更优选45分钟到4小时，甚至更优为1小时至3小时，最优选2小时。通过加热或烘烤的交联可以通过本领域普通技术人员已知的任何适合的手段进行，例如烘干室或烘箱。除了温度，还有其他参数，如湿度、通风或换气也可以调节到本领域普通技术人员已知的适当值。通过加热或烘烤的交联可以也与其他固定化方式如光交联或化学固定组合。光交联是通过施加典型波长的光(例如，在150至550nm范围内，优选在200到500 nm范围内)给核酸分子以引起分子和载体材料之间的相互作用来进行的。通常，在分子和载体材料之间引起的相互作用是核酸与材料的共价结合。光交联可以例如通过使用紫外光来进行。紫外交联是确保载体材料与核酸探针共价结合的最简单的方法之一。通常地，连接通过核酸分子的碱基例如胸腺嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶残基来进行，其与载体材料上相应并适当的功能性化学基团反应，如本领域普通技术人员已知的。载体材料上或内部的功能性化学基团的存在和数目可以通过适当的化学激活过程来控制和调节。这种激活过程可以例如提供特异地定位于载体材料上或内部的官能团并在这些定位的官能团中促进核酸分子和材料间的特异性的反应。载体材料上或内部的功能性化学基团的存在和数目可以也对固定化的核酸的方向性和自由度有影响。例如，更高数量官能团的存在可以导致在核酸分子内不同的点上固定化。此外，在核酸分子内相应的反应元件的存在可以用于控制载体材料上的核酸分子方向性，例如，在核酸分子的头部或尾部区、或5’或3’区的固定化，或者单独在中心区或同时在中心和末端区的固定化。另一个参数是用于照射的能量的量，当通过光将核酸分子交联到载体材料上时， 此参数是重要的。通常，本领域普通技术人员能够通过遵循照射设备的厂商提供的指示， 确定适当和最适的照射剂量。例如，应用于基片上的总剂量可以利用公式D = P T来计算，其中D是应用于基片上的总剂量，以mj/cm2为单位，P是应用于载体材料上的光的功率，以mW/cm2为单位，T是应用剂量使用的时间，以秒为单位。应用于载体材料上的光的功率依赖于光源和光源与被照射的载体材料间的距离。光源可以是本领域普通技术人员已知的任何合适的光源，例如，汞灯，优选低压汞
10紫外线灯或高压汞紫外线灯。光源也可以是LED灯，例如，紫外LED灯。光源可以发出具有主发射谱线的波长的光谱，如在254nm或365nm。光源也可以结合特定的滤光片元件，为只发出的特定的发射光。滤光片还可以用来抑制应用于载体材料上的能量的量。当进行光交联时，除了波长和使用能量的量，还有其他参数，如湿度、通风或换气， 也可以调整到本领域普通技术人员已知合适的值。关于载体材料的照射的一个关键问题是水分含量。由于水吸收光照射，尤其是紫外线照射，干燥过程中的变化可以对交联过程的结果有影响。载体材料的水分含量可以根据本领域普通技术人员已知的任何合适的手段调节。优选地，光交联可与预先干燥过程结合进行一段时间以便调整存在的液态水的量。术语“化学固定”涉及基于化学反应的载体材料和核酸之间的相互作用。这种化学反应通常不依赖于通过热或光的能量输入，但可以通过应用热(例如为达到化学反应的某种最适温度增强)，或某种波长的光来加强，如本文上述解释的。例如，化学固定可以在载体材料上的官能团和核酸分子上相应的功能元件之间发生。这些核酸分子相应的功能元件可以存在于分子中(例如作为核酸分子的化学结构的一部分)或者被额外地引入。这样的官能团的实例是胺基团。通常地，核酸分子包含功能胺基团，或被化学修饰以包含功能胺基团。这样的化学修饰的手段和方法是本领域普通技术人员已知的并可以源自例如从有机化学教科书，如 Hart 等人的 Organische Chemie, 2007，Vollhardt 等人的 Wiley-Vch or Organische Chemie, 2005, Wiley-Vch0所述官能团在分子内的定位可用于控制和定形分子的结合行为和/或方向，例如官能团可以被置于分子的末端或尾端、5’和/或3’区，或在分子的中间。核酸分子的典型反应伴侣包含能够结合核酸的部分，优选结合胺官能化的核酸的部分。这样的载体材料的实例是醛、环氧或NHS基片。这种材料是本领域普通技术人员已知的。官能团是本领域普通技术人员已知的，所述官能团在核酸分子和载体材料间提供连接反应，其中核酸分子通过胺基的引入具有化学反应性。核酸分子中可选反应伴侣可以必须被化学激活，例如，通过官能团的激活进行，其在载体材料上可获得的。术语“活化的载体材料”涉及材料，其中相互作用或反应的化学官能团通过如本领域普通技术人员已知的化学修饰过程被确定或使其可行。例如，包含羧基的基片必须在使用前被激活。此外，存在可用的包含官能团的基片，该官能团可与已存在于核酸中的特定部分反应。这些反应中的一些能被加热或紫外照射所增强。实例是基片表面上的胺基(amine group)，可结合在DNA的特定碱基上。上述的官能团也可以定位或分布不同，例如，载体材料可以包含胺基，核酸分子可以进行修饰，以便包含相应的化学反应官能团，如环氧基、醛基或羧基。载体材料上或内部的功能性化学基团的存在、数量和定位(该载体材料能够结合和固定核酸分子)可以用于控制和调节核酸分子的结合行为。载体材料中的反应性化学基团的特定位置可以用于促进在这些位置的官能团内核酸和材料间特定的相互作用。这样的定位过程可以用于提供特殊定位的核酸分子的规则的阵列，例如通过使用液体点样装置， 优选喷墨装置。在载体材料上或内部的反应性化学元件也可以被封闭试剂所掩盖，在去封闭和去掩盖过程之后，可与核酸分子发生化学反应。另外，这种化学元件可以通过使用本领
11域普通技术人员已知的相应且适合的激活剂被激活。在本发明的上下文中，术语“仅一种碱基类型的核苷酸段”涉及核酸分子的一部分，其由仅一种碱基如胸腺嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶组成，或本领域普通技术人员已知的能够与互补的碱基相互作用的任何其化学衍生物。核酸分子的所述部分可以具有可变的长度，从仅几个碱基到多于100个碱基。术语“仅一种碱基类型”不仅包含相同的碱基，还包含在与互补碱基相互作用方面显示可比较的化学行为的碱基及其衍生物。因此。 该术语在胸腺嘧啶的示例性情况中不仅涉及仅胸腺嘧啶的碱基类型或核苷酸，还涉及其功能上等同的衍生物或修饰。术语“功能上等同”涉及碱基和互补碱基建立非共价连接的能力，其在化学上相似于其衍生自的核苷酸或碱基的非共价连接。这样的功能上等同或修饰的碱基仍可结合互补碱基进行杂交。术语“提供标记的寡核苷酸”涉及提供包含化学或物理元件的寡核苷酸，此元件允许从不包含此元件的背景中区分出该寡核苷酸。这种区别可以优选基于光学的差异，例如， 在刺激或化学激活后光从标记物中发射，或放射性辐射的发射。优选地，这样发出的光可以有特定的颜色，其容易从对照的背景中探测出。术语“提供”亦涉及相互作用过程的起始和进行，所述相互作用发生在这样的寡核苷酸和一个或多个或优选全部的根据本发明的固定化在载体材料上的核酸分子之间。这样的相互作用过程的细节是本领域普通技术人员已知的，并能够从分子生物学教科书中得到，如Sambrook等人编写的分子克隆实验指南，2001 年，冷泉港实验室出版社。在本发明的上下文中，术语“与仅一种碱基类型的核苷酸段互补的寡核苷酸”涉及中等数量残基的单链核酸分子，优选长度在约2到约100个核苷酸之间，更优选在约3到约 70个核苷酸之间，甚至更优选的长度为4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、 20,21 、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、 45,46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64 或 65 个核苷酸，最优选长度为16个核苷酸，其提供了通过核酸杂交和非共价氢键连接能够结合到如本文上述的固定化核酸上的核苷酸序列。术语“互补”涉及寡核苷酸在寡核苷酸和固定化的核酸之间建立非共价连接的能力，其通过两个或三个氢键进行，依赖于存在的碱基种类。通常地， 腺嘌呤和胸腺嘧啶碱基通过两个氢键非共价连接，鸟嘌呤和胞嘧啶碱基通过三个氢键非共价连接。尿嘧啶和腺嘌呤通常通过两个氢键非共价连接。因此，如果例如仅一种碱基类型的核苷酸段由胸腺嘧啶核苷酸或其功能上等同的衍生物构成，标记的寡核苷酸可以由腺嘌呤核苷酸或功能上等同的其衍生物构成。在本发明的上下文中，术语“与仅一种碱基类型的核苷酸段互补”还包括寡核苷酸或核酸分子的部分，如上文定义的关于互补性化学作用规则，其显示一个或多个错配。错配的数量可以根据寡核苷酸的长度及核酸分子的大小或长度有所变化。例如，寡核苷酸在其互补段中可以包括至的错配碱基，优选1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、 10%,11 %>12%,13%,14%,15%,16%,17%,18%,19%,20%,21 %,22%,23%,24%, 25 %、沈％、27 %、观％、四％或30 %的错配碱基。术语“错配碱基”涉及碱基或核苷酸，其不能通过氢键与定位在另一个相互作用的单链核酸分子上相对位置的碱基建立非共价键的连接。这种错配碱基可以定位遍及寡核苷酸，或在寡核苷酸两端的任一端或在寡核苷酸的中间。根据本发明，这样的错配碱基可以对固定化的核酸分子和如上文定义的标记的寡核苷酸之间的相互作用产生影响。通常地，所述错配碱基可以降低两种分子间相互作用的强度。术语“降低”涉及相互作用下降约1到约50%。但是，此术语并不包括完整抑制或去除依据本发明的寡核苷酸和固定化的核酸分子间的相互作用。在本发明的上下文中，术语“与每一条固定化的核酸分子在仅一种碱基类型的核苷酸段处形成复合物”涉及基于非共价连接的相互作用，所述非共价连接通过固定化核酸和如上文定义的寡核苷酸中的互补碱基间的氢键来进行。这样的复合物的形成可以对于所有包含互补区的分子是特异的。这种特异性依赖于碱基相关的化学性质、分子的长度、 互补区的长度和形式以及环境因素，如温度、PH、盐含量和盐浓度或者更其他化合物的存在和浓度，如本领域普通技术人员已知的。上面提到的参数和因素可以根据本发明修饰和调节。优选地，可以调节所述参数以使如果0%和35%的错配存在于分子之间，更优选如果只有 0%U%>2%,3%,4%,5%,6%,7%,8%,9%,10%,11%>12%,13%,14%,15%,16%, 17%、18% ,19%,20%,21%,22%,23%,24%,25%,26%,27%,28%,29%^； 30%的错配存在于分子之间，如上文定义的寡核苷酸只结合到核酸分子的互补段。因此，复合物的形成可以还包括两种不互补分子的区域，只要分子的互补区域间发生可检测的相互作用。术语“每一条固定化的核酸”涉及所有固定化的拥有由一种碱基类型的核苷酸段或碱基段的核酸，其互补于如上文定义的寡核苷酸序列。在本发明的上下文中，术语“确定对于所述核酸的情况的评价标准”涉及固定化的核酸和如上文定义的互补的寡核苷酸之间相互作用的程度的测量。这种相互作用的程度可依据几个参数得出结论。例如，相互作用的程度允许检测在载体材料的某个范围或特定位点上是否存在含有互补序列的核酸。如果在载体材料的特定区域或特定位点相互作用的程度非常低，或没有相互作用，这样的结果表示核酸分子全部缺失，或者至少所述分子内互补区域缺失，或者核酸分子功能缺失。此外，相互作用的程度允许测试固定化的核酸的质量。如果相互作用的程度低或至少不是最优的，这样的结果表示在所述核酸分子内至少在互补区存在结构上的损伤或修饰。这种结构上的损伤反过来可以指示固定化核酸的全面的结构问题。包含根据本发明所鉴定的这种结构损伤或修饰的核酸的载体材料、生物芯片或微阵列可以例如，如下文所述根据本发明，从进一步的应用中去除或在额外的测试手段中细察。术语“相互作用的程度”指的是在根据本发明标记的寡核苷酸如上文定义地被提供后，即在寡核苷酸被引入到固定化核酸分子的附近以允许复合物的形成后，在核酸已被固定化的基片区域或区内，从物理信号例如光学信号或化学信号的测量而得到的数值与没有核酸被固定化的区域中这种信号的测量(即背景范围)相比较。因此，寡核苷酸内标记元件(element)的存在可以通过如本领域普通技术人员已知的相应的适当的方法来测量和检测。因此，只有在标记的寡核苷酸和固定化的核酸之间的相互作用发生的区域中，这样的物理或化学信号可以被检测。测量的数值依赖于用于寡核苷酸的标记元件，即信号的绝对强度。所述值也可以涉及相对于基片上一个或多个区域(优选在不含有固定化核酸的载体材料上几个不同的位置)的背景信号调整过的信号强度。此外，所述值可以相对于对照值调整，对照值从标记的寡核苷酸与固定化的核酸最佳的相互作用反应中获得，例如，其中寡核苷酸的所有碱基与固定化的核酸分子连接或杂交和/或其中基本上没有寡核苷酸的去结合发生。
在载体材料的某些特定区域，相对于如上文定义的对照值计算得到的约0%到约 5%、优选约0%到3%的相互作用程度可被视为指示(indicative)在载体材料的所述某些区域或点样点内核酸完全缺失或在所述核酸内互补区域的缺失。约5%到80%、优选约10% 到约70%的相互作用程度可被视指示(indicative)在载体材料的特定区域或点样点内存在核酸分子，其为至少在所述核酸的互补区域内存在结构上损伤的，或者只包含了所述区域的一部分(subportion)。这种相互作用程度进一步指示在沉淀或固定化过程中发生的问题。根据本发明，显示了约5%到约80%、优选约10%到约70%的中等相互作用程度的核酸仍可以最适地与第二寡核苷酸相互作用，所述第二寡核苷酸与在仅一种碱基类型的核苷酸段之外的特定的核苷酸段互补，因为如上文定义的相互作用程度只是在仅一种碱基类型的核苷酸段的环境中计算的。显示了这样的中等相互作用程度的核酸可以另外用第二特异结合的寡核苷酸检测，例如，与在仅一种碱基类型的核苷酸段之外的特定核苷酸段互补的寡核苷酸，为了证明特定的核苷酸段是否能够与更高相互作用程度结合，即所述中等相互作用是否因为仅一种碱基类型的核苷酸段的限制，或者因为在这种第二位点也有结构损失。这种第二相互作用检测也可以用与仅一种碱基类型的核苷酸段互补的寡核苷酸，在只有非常低或没有相互作用程度被检测到的情况下进行。下文描述相应的第二相互作用的细节。在载体材料的某些特定区域，相对于如上文定义的对照值计算得到的约80%到约 100%、优选约90%到约100%的相互作用程度可被视为指示在载体材料的特定区域或点样点存在核酸分子，其为至少在所述核酸的互补区域结构上无损伤。在某些情况下，相互作用程度也可以超过100%，例如约100%到约150%。例如，如果对照值是从小于检测区域最强信号的信号得到的，或者对照值是从平均或归一化信号得到的，该平均信号值低于检测区域的最强信号，这样的结果可以获得。术语“信号”是指在载体材料表面或载体材料内部的两个点或范围之间，任何化学地或物理地优选光学地可区分的差异。任何这样的信号的测量和检测可以运用本领域普通技术人员已知的任何适当的方法进行。例如，信号可以用微阵列扫描仪或CCD光学设备检测。为了分析和比较检测到的信号，可根据需求使用适当的计算机设备和程序。这些计算机设备和程序是本领域普通技术人员已知的。术语“核酸的情况”涉及固定化核酸的存在或缺失，也涉及在互补区域内关于结构上的限制和损伤方面，固定化核酸的质量。因此，如上文定义的本发明用于测试核酸的方法允许在基片上存在或不存在沉淀和固定化模式之间进行“全或无”区分，以及在如上文定义的固定化核酸分子和标记的寡核苷酸之间进行几种相互作用程度之间的“质量控制”区分。 低或中等程度的相互作用可视为指示固定化核酸的低质量，其可在与特异性结合的寡核苷酸相互作用的过程中导致后续问题。此外，如上文描述的本发明用于测试核酸的方法的步骤(a)、(b)及(C)可以在步骤之间没有任何时间或时间间隔一致性地进行，即所有的步骤或某些步骤的子群可同时进行，或可以在步骤(a)和/或(b)和/或(c)之间有任何合适的时间间隔。例如，步骤(b) 可在步骤(a)进行之后几秒钟、几分钟、几小时、几天、几周、几月甚至数年的时间间隔后进行。同样适用于步骤(c)对于步骤(a)和步骤(b)。在特定的实施方案中，步骤(a)首先进行，接着是步骤(b)和步骤(C)。
优选地，随后的步骤(b)到(c)在步骤(a)开始或终止后约1小时到约12个月后进行。在另一个方面，本发明涉及用于检测载体上的核酸的试剂盒。所述试剂盒包含通过如上文定义的热或光交联或化学固定，固定化在固体载体上的核酸阵列，其中，每一条固定化的核酸包括如上文定义的仅一种碱基类型的核苷酸段，以及与仅一种碱基类型的核苷酸段互补的标记的寡核苷酸，其中，所述标记的寡核苷酸能够与每一条固定化的核酸在仅一种碱基类型的核苷酸段处形成复合物。该试剂盒可以另外包含对如上文定义的测试反应必要的成分和组分，例如缓冲液如杂交缓冲液，洗涤液和/或能够检测标记物元件的组分， 或包含试剂盒使用信息的包装信息单。该试剂盒可以本领域普通技术人员已知的任何适当的形式提供。例如，该试剂盒可作为开放或封闭的盒子提供。封闭的盒式试剂盒可包含几个区室，在其中可储存一种或多种上述成分。在另一个方面，本发明涉及如上文定义的标记的寡核苷酸用于测试如上文定义的通过热或光交联或化学固定而固定化在固体载体上的核酸的情况的用途，所述标记的寡核苷酸与如上文定义的仅一种碱基类型的核苷酸段互补，其中，每条固定化的核酸包含仅一种碱基类型的核苷酸段，其中所述标记的寡核苷酸能够与每条固定化的核酸在所述仅一种碱基类型的核苷酸段处形成复合物。与仅一种碱基类型的核苷酸段互补的标记的寡核苷酸用于检测通过交联固定化在固体载体上的核酸的情况的用途可以包括确定对于与如上文定义的固定化的核酸形成的复合物中标记的寡核苷酸的量的评价标准。根据本发明的优选实施方案，核酸可以是单链DNA、RNA、PNA、CNA、HNA、LNA或 ANA。DNA可以是例如A-DNA、B-DNA或Z-DNA的形式。RNA可以是例如p-RNA(即吡喃基-RNA) 或结构上修饰的形式，如发夹RNA或茎环RNA。术语“PNA”涉及肽核酸，即人工合成的与DNA或RNA类似的聚合物，其用于生物研究和医学治疗，但所知不会自然发生。PNA骨架通常由重复的N -(2-氨乙基)-甘氨酸单位通过肽键连接构成。各种嘌呤和嘧啶碱基通过亚甲基羰基键连接到骨架上。PNA通常描述为类似肽，具有在第一位(左侧)的N端和在右侧的C端。术语“CNA”涉及环乙烷氨基酸核酸。此外，此术语涉及环戊烷核酸，即核酸分子包含例如 2’ -脱氧卡巴鸟苷(2，- deoxycarbaguanosine)。术语“HNA”涉及己糖醇核酸，即DNA类似物，其由标准核苷碱基和磷酸化的1，5 -失水己糖醇骨架构成。术语“LNA”涉及锁核酸。通常地，锁核酸是修饰的并因此无法获得RNA核苷酸。 LNA核苷酸的核糖部分可被连接2’和4’碳的额外的桥修饰。这样的桥在3’内(3’ -endo) 结构构象中锁定核糖。被锁定的核糖构象提高碱基的堆积和骨架的预组织。这可以显著提高热稳定性，即寡核苷酸的解链温度。术语“ANA”涉及阿糖核酸或其衍生物。在本发明的上下文中，优选的ANA衍生物是2’ -脱氧-2’ -氟-β -D-阿糖核苷(2’ F-ANA)。在进一步优选的实施方案中，核酸分子可以包含任何一种单链DNA、RNA、ΡΝΑ、 CNA、HNA、LNA和ANA的组合。特别优选的是LNA核苷酸与DNA或RNA碱基的混合物。在进一步优选的实施方案中，如上文定义的核酸分子可以是短寡核苷酸、长寡核苷酸或多聚核苷酸的形式。根据本发明的优选实施方案，一种碱基类型的核苷酸段可以仅由胸腺嘧啶、尿嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤或胞嘧啶碱基构成。一种碱基类型的核苷酸段还可以另外由如上文定义的胸腺嘧啶、尿嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤或胞嘧啶碱基的功能等同物，或胸腺嘧啶和其功能等同物，尿嘧啶和其功能等同物，鸟嘌呤和其功能等同物，腺嘌呤和其功能等同物或胞嘧啶和其功能等同物构成。所谓“功能等同物”涉及能够与互补碱基建立非共价连接的碱基，所述连接在化学上类似于衍生出此碱基的核苷酸或碱基的非共价连接。在特别优选的实施方案中，仅一种碱基类型的核苷酸段是胸腺嘧啶、尿嘧啶或鸟嘌呤或其组合与各自功能等同物的段。甚至更优选的是仅一种碱基类型的核苷酸段，由胸腺嘧啶或组合或胸腺嘧啶与其功能等同物构成。根据本发明的进一步优选的实施方案，仅含有一种碱基类型的核酸可以具有从约 2到约200个核苷酸的长度，更优选从约2到约100个核苷酸，特别优选从约2到约50个核苷酸，甚至更优选从约10到20个核苷酸。还优选的长度是2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、 14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39
或40个核苷酸。最优选的是16个核苷酸的长度。根据本发明的另一优选的实施方案，将一个或多个核酸固定化在载体上所用的交联可以是光交联，其在波长约200-300 nm范围内或其子范围进行，例如子范围是 200-220nm、220_240nm、240_260nm、260-280nm,^0_300nm。这种交联可认为是经典紫外光交联。使用的光的波长可主要通过灯具的选择来确定。例如，为了建立在200-300nm的谱中的波长，可使用低压汞紫外灯。如本领域普通技术人员应知的，这种灯通常发射不只一个波长，而是波长谱。术语“200-300 nm的谱”涉及这种从低压汞紫外灯中发出的典型的光谱。可选地，光线也可以从紫外LED中发出，其可以具有不同的发射光谱或本领域普通技术人员已知的任何其他灯或光源，只要发射波长的主线在200-300nm范围内。在特别优选的实施方案中，主要的发射线是在所述200-300 nm的谱内的254 nm。进一步优选的是这样的交联方法，其中使用的光源不发出整个光谱波长，而只发出特定波长，特别优选的是波长为 254 nm。这种限制可以通过使用特定的灯或LED模式，或使用本领域普通技术人员已知的只允许确定的波长通过滤光片元件来得到。可以优选使用在波长为200- 300nm，特别是254 nm的核酸交联以固定化包含尿嘧啶、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶和腺嘌呤碱基的核酸分子，更优选包含由尿嘧啶、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶和腺嘌呤碱基构成的仅一种碱基类型的核苷酸段的核酸。在更优选的实施方案中，可优选使用在波长为200-300nm特别是254nm的核酸的交联以固定化包含由尿嘧啶、胸腺嘧啶或鸟嘌呤碱基构成的仅一种碱基类型的核苷酸段的核酸分子，甚至更优选包含胸腺嘧啶或尿嘧啶碱基构成的仅一种碱基类型的核苷酸段的核酸。最优选的是包含尿嘧啶构成的仅一种碱基类型的核苷酸段的核酸分子，因为已发现在波长为254 nm时，由尿嘧啶构成的仅一种碱基类型的核苷酸段可以比胸腺嘧啶构成的仅一种碱基类型的核苷酸段更有效地固定化到载体材料上，腺嘧啶构成的仅一种碱基类型的核苷酸段反过来在所述波长又可以比由鸟嘌呤、胞嘧啶和腺嘌呤构成的仅一种碱基类型的核苷酸段更有效地固定化到载体材料上。根据本发明的另一个优选的实施方案，将一个或多个核酸固定化在载体上所用的交联可以是光交联，其在波长约300-500nm或其子范围进行，例如子范围是300-320nm、 320-340nm、340-360nm、360-380nm、380-400nm、400-420nm、420-440nm、440-460nm、 460-480nm、480-500nm。这种交联可认为是非经典的紫外线或长波长交联。使用的光的波长可主要通过灯具的选择来确定。例如，为了建立在300 - 500nm的谱中的波长，可使用高压汞紫外灯。如本领域普通技术人员应知的，这种灯通常发射不只一个波长，而是波长谱。术语“300-500nm的谱”涉及这种从高压汞紫外灯发出的典型的光谱。可选地，光线也可以从 LED发出，其可以有不同的发射光谱或本领域普通技术人员已知的任何其他灯或光源，只要是发射波长的主线在300-500nm的范围内。在特别优选的实施方案中，主要的发射线是在所述300-500nm的谱内的365nm。进一步优选的是这样的交联方法，其中使用的光源不发出整个频谱波长，而只发出特定的波长，特别优选的是波长为365nm。这种限制可以通过使用特定的灯或LED模式，或使用本领域普通技术人员已知的只允许确定的波长通过滤光片元件来得到。可以优选使用在波长为300 - 500nm，特别是波长为365nm的核酸交联以固定化包含尿嘧啶、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶或腺嘌呤核苷酸的核酸分子，更优选包含由尿嘧啶、 胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶或腺嘌呤核苷构成的仅一种碱基类型的段的核酸。在更优选的实施方案中，可优选使用在波长为300 - 500nm，特别是365nm的核酸交联以固定化包含由鸟嘌呤、尿嘧啶或胸腺嘧啶碱基构成的仅一种碱基类型的段的核酸分子，甚至更优选包含由鸟嘌呤或尿嘧啶碱基构成的仅一种碱基类型的段的核酸分子。最优选的是包含由鸟嘌呤碱基构成的仅一种碱基类型的延伸链的核酸分子，因为本发明人已发现在波长为365nm时， 由鸟嘌呤构成的仅一种碱基类型的段可以比由尿嘧啶构成的仅一种碱基类型的段更有效地被固定化在载体材料上，由尿嘧啶构成的构成的仅一种碱基类型的段反过来又可以在所述波长比由胸腺嘧啶构成的仅一种碱基类型的段更有效地被固定化到载体材料上，由胸腺嘧啶构成的仅一种碱基类型的段反过来又可以在所述波长比由胞嘧啶或腺嘌呤构成的仅一种碱基类型的段更有效地被固定化到载体材料上。根据本发明的另一优选的实施方案，将一个或多个核酸固定化在载体上所用的交联可以是在波长约200-300 nm进行的光交联，使用能量的量为约0.05至约1.5 Joule/ cm2,更优选约0. 075至约1. 0 Joule/ cm2,甚至更优选约0. 1到约0. 6 Joule/ cm2,最优选0.3 Joule/ cm2。在特别优选的实施方案中，通过使用0. 3 Joule/ cm2能量的量在波长 254nm进行交联。根据本发明的另一优选的实施方案，将一个或多个核酸固定化在载体上所用的交联可以是在波长约300-500 nm进行的光交联，使用能量的量为约0.5至约15 Joule/ cm2, 更优选约2.0至约12 Joule/ cm2，甚至更优选约4到约10 Joule/ cm2，最优选5 Joule/ cm2。在特别优选的实施方案中，通过使用5 Joule/ cm2能量的量在波长365nm进行交联。如上文所述，应用在载体材料上光的强度和因此所用的能量的量等等依赖于光源和被照射的载体材料之间的距离。所用光源和载体材料之间的距离可以根据本领域普通技术人员已知的参数适当地调节。优选使用5cm到Im之间的距离，更优选IOcm到500cm之间，甚至更优选20cm到200cm之间的距离。进一步优选IOcm到150cm之间的距离。最优选50cm的距离。核酸分子化学固定到载体材料上可以根据本发明进一步的优选实施方案，通过氨基修饰的核酸与包含相应功能的载体材料元件即功能化学基团之间的耦联来进行，所述功能化学基团主要与胺修饰的核酸分子相互作用。术语“胺修饰的”(“amine-modified”) 涉及为了建立反应性功能胺基，核酸分子中胺基的引入、激活或修饰。这样的胺基(amine group)可以例如在整个分子的长度被引入。优选此基团被引入到分子的两端或一端，或其中间。这样的修饰可以用于控制和定型载体上分子的结合行为。与氨基修饰的核酸的主要相互作用的适当的功能化学基团是本领域普通技术人员已知的，并可以从有机化学教科书中得到，如从 Hart 等人 Organische Chemie, 2007, Vollhardt 等人 Wiley-Vch or Organische Chemie, 2005，Wiley-Vch。在特别优选的实施方案中，载体材料上胺修饰的核酸分子的固定化是通过核酸分子上的所述胺基和载体材料上的环氧基、醛基、羧基或NHS 基的相互作用来进行的。术语“NHS”涉及N -羟基琥珀酰亚胺，这是作为羧酸活化试剂的化合物。活化的酸(基本上是含有良好的离去基团的酯)可与胺反应形成例如酰胺，而正常的羧酸只可与胺形成盐。通常，NHS活化的酸是通过在无水的溶剂中混合NHS和所需的羧酸及少量的有机碱而合成的。脱水剂，如二环己基碳二亚胺(DCC)或乙基(二甲氨基丙基)碳二亚胺(EDC)可随后加入，以形成极不稳定的活化的酸中间体。NHS反应形成较稳定的活化的酸。这种含有酸和NHS的酯，即琥珀酸酯，在无水和低温的情况下足够稳定以在无水情况下在低温纯化和贮存，并因此适合用于在载体材料上固定核酸，其随后可以进行洗涤和/ 或杂交程序。被固定化在载体材料上的核酸可根据进一步的优选实施方案以式I表示 5，-Yn-Xm-Br-Xp-Zq-S'
在式I中，Y和Z是仅一种碱基类型的核苷酸段，其中Y和Z可以是相同或不同的碱基类型；X为间隔，B是多于一种碱基类型的序列，n、m、r、p和q是核酸中核苷酸的数目，其中以下情况可以应用n、m、p、q、r >1 ；n、m、r > 1 且 p、q = 0 ；p、q、r >1 且 n、m = 0 ；n、q、 r > 1 且m、p = 0; n、r > 1 且 m、p、q = 0 ;q、r > 1 且 n、m、p = 0。术语“仅一种碱基类型的核苷酸段”已在上文定义，涉及仅由一种碱基构成的核苷酸，所述碱基例如胸腺嘧啶、 鸟嘌呤、腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶，或任何功能等同的其衍生物。优选地，Y段和/或Z段可用于核酸的固定化，原因在于仅一种碱基类型的核苷酸的存在。更优选，如果固定化通过在200 - 300nm如254 nm波长的交联进行，Y段和/或 Z段可以由胸腺嘧啶或尿嘧啶碱基构成，甚至更优选为尿嘧啶；或如果固定化通过在300 -500nm如365nm波长的交联进行，它们可以由鸟嘌呤或尿嘧啶构成，更优选为鸟嘌呤。Y和Z可以同时存在于同一核酸分子内。这种形式可以用于通过仅一种碱基类型的段在分子两端的同时交联。在进一步优选的实施方案中，Y和Z可以由不同碱基类型构成，即Y可以例如由尿嘧啶碱基类型构成，而Z可以由鸟嘌呤碱基类型构成，或反之亦然。这种核酸可以例如在不同波长被固定，优选在254 nm和365 nm，并因此导致核酸不同的方向性。这种核酸也可用于测试核酸的方向性和固定化方法对根据本发明与互补的寡核苷酸形成复合物的能力的影响。在优选的实施方案中，Y和Z可以是相同的长度也可以是不同的长度。Y和/或 Z可以具有约2到约100个核苷酸的长度，更优选约4至约50个核苷酸，甚至更优选约8至约 30 个核苷酸。还优选4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、 25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39 或 40 个核苷酸的长度。最优选的是 16个核苷酸的长度。在核酸分子的两端都包括元件Y和Z的形式中，在其中心包含如上文式I所述的特定核苷酸B。可选地，区域B可以只连接Y或Z中的一个，因此位于分子的末端。区域B可以被用于经典杂交或微阵列方法中的特定检测反应，即用于检测与特异性结合到位于元件 B中它们互补区域的寡核苷酸的相互作用反应。Y和/或Z的长度和化学性质可以影响B区的灵活性，因此可用于优化这个区内的特定相互作用，例如，使用互补的寡核苷酸的特定杂交反应。在优选的实施方案中，B具有约4至约90个核苷酸长度，更优选约4至约50个核苷酸长度，甚至更优选约20到约30个核苷酸。优选长度还为4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、 14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39 或40个核苷酸。最优选的是25个核苷酸的长度。因此，根据本发明具体实施方案，如上文定义的仅一种碱基类型的核苷酸段可以位于核酸分子两端中的任意一端，即在固定化核酸的3’或5’。更优选仅一种碱基类型的核苷酸段可以位于核酸分子的5’端。本发明式I的元件X可以作为间隔元件另外存在，即作为包括未确定性质的序列的区域。更优选，元件X可以由脱碱基核苷酸组成。术语“脱碱基”涉及核酸分子上无碱基残基存在的位置。因此，核酸的脱碱基区域或段仅由糖磷酸骨架元件构成。这种脱碱基结构可以对整个分子特别是对于分子的元件B的灵活性有积极的影响。发明人能证明脱碱基位点的存在对固定化分子与靶探针的特异性相互作用或杂交的能力产生积极的影响(参见实施例5和图6)。分子用于固定化的部分例如式I中的Y或Z的分离形成分子用于特异性杂交的部分例如式I中的B，其通过引入包含脱碱基位点的间隔元件来进行，这种分离可以显著地降低用于特异性杂交的分子部分例如式I中的B的非特异性杂交反应。间隔元件Xm和Xp可以完全由脱碱基位点构成，或部分地由脱碱基位点构成。如果间隔元件部分地由脱碱基位点构成，间隔元件的基础(basic)部分可以由仅一种碱基类型的核苷酸构成，或可以由不同碱基类型的核苷酸构成。如上文定义的脱碱基位点可以聚集在一段中，或分散在间隔元件内，或者，可选地，也可以存在于如式I描述的整个分子中。 优选地，脱碱基位点位于间隔元件X中并聚集在1或2段中。优选地，如式I中描述的分子内的脱碱基位点的数量可以为约1到30之间，更优选约1到约20之间，甚至更优选地，这样的分子可以包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、 13、14、15、16、17、18、19 或 20 个脱碱基位点。间隔元件Xm和Xp可以在化学性质和长度上相同，或可以在化学性质和长度上不同。优选地，间隔元件Xm和Xp长度相等，为约1至约50个核苷酸，更优选1、2、3、4、5、6、7、 8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29 或 30 个核苷酸的长度。在进一步的实施方案中，当q = 0，即没有式I所描述的序列元件Z的存在，末端间隔也是可以避免的，即P = 0。同样的，当η = 0，即没有式I所描述的序列元件Y的存在， 末端间隔也是可以避免的，即m = 0。根据本发明进一步优选的实施方案，可被固定化的核酸和/或与其互补的寡核苷酸可以在任一或两个末端包含一个或多个标记物，优选在5’端。可选地，所述核酸分子或寡核苷酸也可以在分子的任何位置包含一个或多个标记物。优选地，所述核酸分子或寡核苷酸包含1至10个标记物，其可以是相同或不同的或其任何组合。更优选地，核酸分子或
19寡核苷酸包含1至5个标记物，甚至更优选2个标记物，最优选只有1个标记物。所述标记物可以是放射性的、荧光的或化学发光的标记物。术语“放射性标记物” 涉及发射放射性辐射的标记物，优选由放射性同位素构成。术语“放射性同位素”在标记物的上下文中涉及本领域普通技术人员已知的这样的要素。更优选，此术语涉及N-15、C-13、 P-31 或 1-131。术语“荧光标记物”涉及荧光团的化学反应性衍生物。通常，常见的反应性基团包括胺反应性异硫氰酸酯衍生物，如FITC和TRITC (荧光素和罗丹明衍生物)，胺反应性琥珀酰亚氨酯，如NHS-荧光素，巯基反应性马来酰亚胺活化的荧光剂，如荧光素-5-马来酰亚胺。任何这些反应性染料与另一个分子的反应引起在荧光团和分子之间形成稳定的共价键。经过荧光标记反应，从标记的靶标分子中去除任何未反应的荧光团通常是必要的。这可以通过体积排阻色谱来完成，其利用荧光和标记的核酸或寡核苷酸大小不同的优势。荧光团可以与分离基质相互作用，降低分离效率。由于这个原因，可使用基于荧光染料疏水性的专门的染料去除柱。荧光标记物的特别的优势是从荧光标记物中发出的信号不会分散。缺乏荧光信号散开允许例如载体上更密集的探针间距。荧光探针的另一优点是可进行容易的多色杂交检测，允许直接定量测定与固定化在载体材料上的核酸分子形成复合物的寡核苷酸的相对丰度。在特别优选的实施方案中，可使用荧光标记物FITC、荧光素、荧光素-5-EX、 5-SFX、罗丹明绿-X、BodipyFL-X、Cy2、Cy2-0Su、Fluor X、5 (6) TAMRA- X,Bodipy TMR-X、罗丹明、罗丹明红-X、得克萨斯红、得克萨斯州红_X、Bodipy TR-X、Cy3-0Su、Cy3. 5_0Su、Cy5、 Cy5_0su、Alexa荧光剂、Dylight荧光剂和/或Cy5. 5_0Su。这些标记物可单独或以任何组合使用。术语“化学发光标记物”涉及作为化学反应的结果，伴随着有限的发热，能够发出光线(发光)的标记物。优选地，此术语涉及鲁米诺、cyalume、草酰氯、TMAE (四(二甲氨基) 乙烯)、焦酚、光泽精、acridinumester或二氧杂环丁烷(dioxetane)。在优选实施方案中，两个实体(如上文定义的核酸分子和寡核苷酸)可以分别标记不同的标记物，通常是两个光学上或化学上可区分的不同的标记物。这种可区分的标记物可在核酸分子和寡核苷酸内不同的位置存在。因此，如果例如，核苷酸用Cy2标记，寡核苷酸可以用Cy5标记。这些标记物可用于例如在固定化的核酸分子和互补结合的寡核苷酸之间的相互作用中检测分子过程。这种不同的标记进一步为固定化的核酸和任何结合的寡核苷酸的共定位提供了机会。这种方法也可用于获取如上文定义的相互作用的程度的值。在进一步优选的实施方案中，对照核酸可以被某种标记物标记，优选荧光标记物， 以及根据本发明的测试寡核苷酸可以标记不同的光学可区别的标记物或相同的标记物。如果将从对照核酸得到的信号作为100%，从固定化核酸和所述标记的寡核苷酸之间的相互作用得到的任何信号可以对于所述值归一化，以便为相互作用的程度定义可选值。此外，源自没有核酸物质被固定化的载体材料区域的背景信号可被扣除。根据本发明另一优选实施方案，载体材料可以是固体材料或基片，其包含功能性化学基团，优选胺基或胺官能化的基团。术语“胺官能化的基团”涉及被胺官能化的基团， 即通过化学修饰已具有胺的功能。这些胺或胺基可为伯胺和仲胺。此外，载体材料或基片可以包含光敏化合物，其可用于载体材料和核酸分子间的相互作用。如本领域普通技术人员已知的，适当的光敏化合物可用作连接分子。这种分子的实例是光敏生物素，或反应性部分，如在载体材料中的琥珀酰亚氨基-6- [4’ -叠氮_2’ _硝基苯氨基]己酸。光敏生物素由生物素基团、连接基团和硝基苯叠氮基团构成，硝基苯叠氮基团是光可活化的。它通常用于在基片上定型分子。通常，紫外激光激发光敏生物素附着各种表面。这种附着过程通常发生在水性溶液中。光敏生物素是一种生物素种类，其为光可活化的，并可用于生物素化核酸和分子，特别是那些不具有存在用于耦合的胺或巯基的生物素化核酸和分子。当暴露在强光下，生物素的芳基叠氮基团转化为极具反应性的芳氮烯。这个过程可用于标记含有生物素的分子，例如核酸分子。上述这些化合物可以与核酸分子反应，并在基片上固定化分子。在进一步优选的实施方案中，载体材料包含补骨脂素。补骨脂素是一种用于核酸的双功能光化学交联试剂。它插入核酸螺旋，并经长波长(365 nm)紫外光的照射，形成与嘧啶碱基的共价键。优选地，补骨脂素可以通过在300-500 nm的波长，更优选365nm波长的光交联用于固定化核酸。优选的载体材料是多孔的载体材料或多孔基片。特别优选的是尼龙，例如Nytran Ne或者Nytran SPCe或者Biodyne C 。进一步优选的载体材料或基片类型是无孔基片。 在无孔基片中，特别优选的是玻璃、聚-L -赖氨酸涂层材料、硝酸纤维素、聚苯乙烯、环烯烃共聚物(COCs)、环烯烃聚合物(COPs)、聚丙烯、聚乙烯和聚碳酸酯。硝酸纤维素膜是传统的膜，一般用于转移技术如DNA印迹。实现核酸结合硝酸纤维素的方法通常通过物理吸附方式进行，这是现有技术中众所周知的形式。硝酸纤维素的主要优点是它的现成的可用性和熟悉性。通过信号检测的放射性方法，硝酸纤维素膜的应用是被良好地建立。作为硝酸纤维素膜的替代品，尼龙可用作核酸结合的基片，这归因于其更大的物理强度和结合能力，以及提供的可用表面化学性质的更广泛范围，从而优化核酸附着。尼龙膜上的固定化可以通过例如光交联，特别是紫外光交联，或化学活化来进行。尼龙上的固定化已被证明在重复的探针剥离过程中非常耐用。大分子结合松散材料例如聚苯乙烯的方式还不是很清楚。松散材料结合能力的分配或者其增强可以通过提供官能团，优选胺基(其例如通过涂覆过程或表面处理或喷涂等是可利用的)来实现。优选使用的涂层材料是多聚-L _赖氨酸，其属于阳离子表面活性剂组。它包含带正电荷的亲水性基团(氨基)和疏水性基团(亚甲基)，并已知与核酸分子相互作用。作为松散材料，可以使用本领域普通技术人员已知的任何适当的材料。通常，使用玻璃或聚碳酸酯或环烯烃共聚物或环烯烃聚合物或聚苯乙烯。聚苯乙烯是疏水性材料，适于结合带负电荷的大分子，因为它通常包含很少量的亲水基团。为了将核酸固定化在载玻片上，另外已知的是通过提高玻璃表面的疏水性，可以提高DNA固定化。这种增强可以允许相对更加密集填充形成。除了用多聚-L _赖氨酸进行涂布或表面处理，松散材料特别是玻璃可以用硅烷化例如用环氧硅烷或氨基硅烷处理，或用甲矽烷化(silynation)或聚丙烯酰胺处理。在本发明进一步的特别实施方案中，松散材料可以用如上文提到的膜材料来覆盖或涂覆。
在进一步优选的实施方案中，根据本发明的复合物的形成是通过杂交的方法。杂交反应通常尤其依赖杂交缓冲液的性质和浓度以及杂交温度。用于本发明的上下文中的杂交缓冲液，例如在测试方法或分析方法的上下文中的或本发明的试剂盒包含的杂交缓冲液通常包含盐，其能够提高带负电荷的核酸杂交到带负电荷的捕获探针上。可用于杂交缓冲液的典型的盐是SSC、SSPE或PBS。此外，缓冲液可以包含另外的成分，例如去垢剂，如SDS (优选是0. 01-0. 5%之间)，或吐温20。此外，缓冲液可以包含大量的DNA，其加入通常是为了减少对表面的非特异性结合，如鲱精DNA (hsDNA), 或封闭剂如牛血清白蛋白。根据本发明的杂交缓冲液还可以包含稳定单链核酸的成分。这样的成分的实例是甲酰胺。优选的缓冲液包含5 X SSC、0. SDS和0. lmg/ml的hsDNA。在本发明的内容中还可以使用的这样的缓冲液以及替代缓冲液是本领域普通技术人员已知的，并可以根据源自例如Seambrook等人，Molecular Cloning =2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press 白勺胃；窗、!^!]^·。优选地，杂交反应在低于固定化核酸分子和互补寡核苷酸之间形成的复合物的解链温度的温度下进行。更优选，杂交反应在30至65°C的温度下进行。在进一步的实施方案中，如上文定义的杂交可以与洗涤或封闭步骤结合，这是随后与特异性结合的寡核苷酸杂交反应的通常的先决条件。相反，根据本发明的寡核苷酸可以比特异性结合的寡核苷酸短， 因此，可在较低温度下使用，例如，在杂交反应的起始阶段的必要的洗涤和封闭步骤中。因此，寡核苷酸可以用于相应的洗涤或封闭缓冲液。这种方法可以节省时间和费用，因为没有另外的步骤或额外的缓冲液组是必要的。此外，在特定检测反应的预杂交步骤中，在高于固定化核酸分子和互补的寡核苷酸形成的复合物的解链温度的温度下，例如在50°C，根据本发明的所述固定化核酸分子和互补的测试寡核苷酸的复合物可被解链。因此，测试寡核苷酸可以恰好及时从载体材料上被去除，以允许与特异性结合探针的有效杂交反应。本发明的测试寡核苷酸(其在如上文定义的预杂交步骤中已从载体材料上去除) 可根据本发明的另一优选实施方案，被再利用于根据本发明的随后的相互作用或对照反应。术语“再利用”涉及重复使用寡核苷酸溶液约1至约15次，优选约1至5次。这是本发明另外的优势方面，它提供了降低成本，并利用有限的资源投入允许高通量控制设计的可能性。在进一步的优选的实施方案中，本发明涉及分析核酸的方法，包括步骤(a)通过热或光交联或化学固定，将一条或多条核酸固定化在固体载体上，其中每一条固定化的核酸包含仅一种碱基类型的核苷酸段；(b)提供与仅一种碱基类型的核苷酸段互补的标记的寡核苷酸，其中所述标记的寡核苷酸能够与每一条固定化的核酸在仅一种碱基类型的核苷酸段处形成复合物；(c)检测与仅一种碱基类型的核苷酸段外的序列互补的特异性序列的存在；以及(d)通过在与固定化核酸形成的复合物中与仅一种碱基类型的核苷酸段互补的标记的寡核苷酸的量来确定所述核酸的情况的评价标准。相应的方法，尤其是提供固定化核酸的情况的信息的步骤(b)和检测与仅一种碱基类型的核苷酸段之外的序列互补的特异性序列的存在的步骤(c)，允许平行或实时的控制和特异性地使用固定化在载体上的核酸分子。这种方法可以优选用于本领域普通技术人员已知的适当的环境，优选在医院或其他医疗设施的范围，或在研究实验室中，其中特异性杂交和相互作用反应的实时质量控制可尤为有用。因而，在特异性杂交过程中可检测到例如由于运输或生产问题引起的载体上固定化核酸的失败，从而允许对固定化核酸进行完整的和省时的质量控制、测试和使用。本发明测试核酸的方法的步骤没有严格的时间顺序或排列顺序，首先进行提供的固定化步骤(a)，其为随后的相互作用和检测步骤的先决条件。重要的是，步骤(b)和(c)可以按照先(b)再(c)的顺序进行，反之先(c)再(b)亦可。这同样适用于方法的其他步骤， 例如检测或成像步骤，其根据方法步骤(a)和(b)的顺序，以适当的序列使用。此外，本发明测试核酸的方法的步骤(a)、(b)、(c)及(d)可以在步骤之间没有任何时间或时间间隔一致性地进行，即在步骤(a)和/或(b)和/或(c)和/或(d)之间可以存在任何适当的时间间隔。术语“时间间隔”涉及任何适当的时间段。例如，步骤(b)可在步骤(a)进行后几秒钟、几分钟、几小时、几天、几周、几月甚至几年的时间间隔后进行。这同样适用于步骤(c)对于步骤(a)和步骤(b)，以及步骤(d)对于步骤(a)、(b)和(c)。在优选的实施方案中，如上文定义的分析核酸的方法的步骤(a)可在不同于步骤 (b)、(c)或(d)时间点进行。例如步骤(a)的固定化可在测试和/或特异性控制步骤如步骤(b)、(c)或(d)之前几小时、几天、几周、几个月甚至几年进行。优选地，步骤(b)至(d)在步骤(a)已被起始或终止后约1小时至约12个月后进行。步骤(b)和/或(c)和/或(d) 之间的优选的“间隔时间”可以是约1至60分钟的时间段，更优选约1至30分钟时间段。在特别优选的实施方案中，用于分析核酸的方法的步骤(b)河(C)同时进行。如上所述步骤(a)、(b)及(d)可以对应如上文定义的测试载体上的核酸的方法。 步骤(c)可以是特异性杂交或相互作用的步骤，它允许互补核酸分子的络合，优选约55% 至100%之间匹配的分子，更优选约70%至100%，约80%至100%，约85%至100%，甚至更优选 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99 %或100%。这些值可以指贯穿整个分子计算的全部匹配或者特异互补区域的局部匹配，例如，如上文定义的B区域。 进行特异性杂交和计算错配百分比的方式和方法是本领域普通技术人员已知的，并可以源自例如 Seambrook 等人，Molecular Cloning :2001，Cold Spring Harbor Laboratory Press0优选地，可用如上文提及的和实施例中的缓冲溶液和另外的成分。对于步骤(b)、(c)和/或(d)，可使用相同的缓冲条件或不同的缓冲条件。在使用不同的缓冲条件的情况下，步骤(c)可以在如上文定义的时间间隔后进行，或反之亦然，步骤(C)在步骤(b)后进行。在步骤(b)与(C)和/或(d)之间，可以进行洗涤步骤，优选在确保杂交到固定化核酸上的寡核苷酸的结合与保持的适当的条件下进行的步骤。如上文定义的分析核酸的方法的步骤(b)中提及，为检测寡核苷酸与固定化核酸的相互作用或杂交可使用标记物，此标记物可在光学上或化学上与所述方法的步骤(c)中所用的标记物区分开，即对照的相互作用和特异性杂交反应可通过两种不同的、可区别的标记物进行。适当的标记物是本领域普通技术人员已知的，并且上文已经描述。优选地，使用两种不同的荧光标记物。除了固定化核酸的对照，本发明还提供了通过使用额外的特异性结合的寡核苷酸，独立地控制固定化在载体材料上的核酸的质量的可能性。在优选的实施方案中，该方法预见到提供至少一种标记的测试寡核苷酸，其与除在仅一种碱基类型的核苷酸段之外的预先确定的特定的核苷酸段互补。另外，所述标记的寡核苷酸能够区别地与包含所述特定的核苷酸段的固定化核酸形成复合物。随后，所述核酸情况的评价标准通过复合物中所述测试寡核苷酸的存在来确定，该复合物由所述测试寡核苷酸与固定化核酸中的除在仅一种碱基类型的核苷酸段之外的预先确定的特定的核苷酸段形成，所述固定化的核酸包含所述特定的核苷酸段。这样的独立测试为如上文定义的方法提供了进一步控制层面，因为现在不仅是对照寡核苷酸和实质上所有的固定化核酸之间的相互作用能检测到，而且一条或多条固定化核酸(依赖于特异性序列在沉淀的核酸中存在的数目)和特异性测试寡核苷酸之间的相互作用也可检测到。这样的第二对照反应可以由一个或几个区别的特异性序列进行。 不同的特异性序列的数量取决于存在于载体材料上的不同探针的数量。在优选的实施方案中，全部固定化核酸的约0. 至10%可以在这样第二测试方法中被检测到，以获得对于固定化核酸结合特异性结合的互补寡核苷酸的能力在统计上相应的反馈。优选地，进行数量为1、2、3、4、5或6个特异性第二对照反应。在固定化核酸分子上，使用与相同碱基类型段互补的寡核苷酸获得的原有对照方法的结果，与使用特异性结合寡核苷酸获得的第二对照方法的结果之间，任何差异可指示特别关于这些对照方法之一存在的问题。优选地，这种第二对照方法可以通过使用在光学上或化学上与原有对照方法所用的标记物相区分的标记物进行。为了允许原有和第二对照方法之间存在区别，这些标记物不应定位在一个和同样的寡核苷酸上，其含有例如两个不同的区域，一个包含仅一种碱基类型的核苷酸段，另一个包含特定的核苷酸段，因为在这样的设计中，包含仅一种碱基类型的核苷酸段的区域的结合反应与包含有特定的核苷酸段的区域的结合反应之间不能获得区别。除如上文描述的方法，本发明中还包含用于第二对照方法应用的试剂盒，其作为另外的优选的实施方案。这种试剂盒可以包含如上文陈述根据本发明的试剂盒的一些或全部成分，以及另外包含至少一种与除在仅一种碱基类型的核苷酸段之外的预先确定的特定的核苷酸段互补的标记的测试寡核苷酸，其中所述标记的寡核苷酸能够区别地与包含所述特定的核苷酸段的固定化核酸形成复合物。下面的实施例和图片仅供说明性目的。因此应理解的是，实施例和图片不能被解释为限制性。本领域普通技术人员显然能够设想本文列出的原则的进一步修改。
实施例实施例1——对照探针测定
利用在254nm波长的紫外线和标准的预杂交方法，将膜点样和后处理。沉淀的核酸等的概括可以从图2A中得到。经过后处理，膜的图像只显示标记的点(参见图2B)。随后，膜与标记的A16寡核苷酸在50°C的温度下孵育1小时的时间段。Cy5作为标记物使用。杂交缓冲液为5 X SSC, 0. 1% SDS，0. lmg/ml鲱精DNA。杂交在50°C进行1小时。杂交后，用2 X SSC和0. 1 % SDS进行简短的漂洗。随后，干燥膜及使阵列成像。从图2C可以发现，杂交点清晰可见。这意味着在DNA被沉积和固定化的所有范围内存在DNA。此外，沉淀和固定化的DNA能与腺嘌呤对照杂交探针杂交。这证明基于使用与仅一种碱基类型的核苷酸段互补的对照探针的方法可以有效地应用于质量控制措施，例如，在膜的制造过程中。
实施例2——用于方法非破坏性的膜测试
为了证明该对照方法(the control method)是非破坏性的，将用于实施例1的膜(即用于如图2B到2C所述的对照和测试杂交方法中)随后升温至去除对照探针。加热以从捕获探针点上去除所有对照寡核苷酸后的膜的图像直接显示杂交点不再包含任何信号(参见图2D)。为了证明如实施例1中描述的对照方法不会损坏固定化核酸的序列，所述固定化核酸用于特异性杂交和特异性寡核苷酸的结合，膜随后与 ο nM标记的反义分子孵育，所述反义分子互补于沉淀在点4#上的DNA。将膜在50°C的温度下孵育1小时的时间。杂交缓冲液为 5 X SSC, 0. 1% SDS，0. lmg/ml 鲱精 DNA。杂交后，用 2 X SSC 和 0. 1 % SDS 进行短暂的漂洗。随后，干燥膜及使阵列成像。膜孵育后，杂交信号可以清楚地看到(参见图3 ；粗线框标出的是与标记的反义寡核苷酸杂交后显示信号的点。对应于图2A所示的点4#)。这一结果得出结论固定化核酸分子在原有的对照步骤中未被破坏，仍然可以被特异的反义寡核苷酸结合。实施例3——包含T尾的核酸的恢复测试和敏感性测试
在实时杂交测定中测试敏感性，即每单位时间捕获的分析物的数量。Nytran N或 Nytran SPC尼龙薄膜用于实验。该测定使用捕获寡核苷酸(即被固定化的沉淀的核酸分子)进行，所述寡核苷酸不包含T尾或包含T16尾，即16个胸腺嘧啶段。这些实验在流动室中进行，其是膜在其中被夹住并且杂交液通过膜被抽吸的装置。图4A中，在X轴描述了循环数，其等于时间(1个周期需要1分钟)。杂交用互补的DNA来完成。杂交缓冲液是5 X SSC, 0. 1% SDS, 0. lmg/ml 鲱精DNA。温度设定在50°C。如从图4A可以得到的，包含T16尾的寡核苷酸显示增加的杂交信号，这是由于较高的恢复。恢复是固定化的寡核苷酸和沉淀的寡核苷酸之间的比值。实验表明恢复和由此的灵敏度随捕获分子内仅一种碱基类型的核苷酸数量的增加而增加。可以从图4B中得到，结果的归一化显示了包含T或A核苷酸的沉淀的寡核苷酸平均恢复率，其作为碱基类型(T或A)和碱基数量(2、4、8、16或32)的函数；结果的归一化清楚地说明当捕获寡核苷酸中仅一种碱基类型的核苷酸的数目(即T的数目)从2增至32 时，恢复可以3-4倍提高。实施例4——固定化核酸的特异性测试
在结合测定中测试固定化核酸的特异性，即区分匹配和不匹配的靶标的能力。该测定是用包含0、4或16个T的固定化核酸(捕获探针)进行的。使用了不同的捕获探针，包含完全匹配、单错配((AG)突变)和双错配((AAGG)突变)。利用PCR产物进行杂交。杂交在流动室中进行，其是膜在其中被夹住并且杂交液通过膜被抽吸的装置。温度设定在50°C。杂交进行1小时。杂交后，缓冲液改为2 X SSC，温度以1°C / min增加，以制作解链曲线和评估特异性。图5描绘了对于不同的捕获探针，互补、单错配和双错配杂合体的去结合曲线； 如可从图5得到的，由于与错配探针相比互补探针增加的解链温度，获得了增强的选择性。
实施例5——脱碱基位点对杂交强度的影响
在结合测定中测试脱碱基位点对含有完全匹配、单错配((AG)突变)和双错配((AAGG) 突变)的DNA的核酸分子的杂交强度的影响。捕获探针包含0、2、4或8个脱碱基位点。结合测定使用互补的靶标寡核苷酸在NytranN尼龙膜进行。如可从图6中得到的，在所有测试的情况下，即与互补的靶标寡核苷酸、错配靶标寡核苷酸或双错配靶标寡核苷酸杂交的情况下，杂交强度随脱碱基位点数量的增加而增加。该影响是因为用于特异性固定和特异性杂交的序列更有效的分离，从而降低非特异性杂交。
权利要求
1.一种测试载体上的核酸的方法，其包括以下步骤(a)通过热或光交联或化学固定，将一条或多条核酸固定化在固体载体上，其中每一条固定化的核酸包含仅一种碱基类型的核苷酸段；(b)提供与仅一种碱基类型的核苷酸段互补的标记的寡核苷酸，其中所述标记的寡核苷酸能够与每一条固定化的核酸在仅一种碱基类型的核苷酸段处形成复合物；以及(c)通过与固定化的核酸形成复合物中标记的寡核苷酸的量来确定对于所述核酸的情况的评价标准。
2.一种用于测试载体上的核酸的试剂盒，其包含(a)通过热或光交联或化学固定而固定化在固体载体上的核酸阵列，其中每一条固定化的核酸包含仅一种碱基类型的核苷酸段；以及(b)与仅一种碱基类型的核苷酸段互补的标记的寡核苷酸，其中所述标记的寡核苷酸能够与每一条固定化的核酸分子在仅一种碱基类型的核苷酸段处形成复合物。
3.与仅一种碱基类型的核苷酸段互补的标记的寡核苷酸用于测试通过热或光交联或通过化学固定而固定化在固体载体上的核酸的情况的用途，其中每一条固定化的核酸包含仅一种碱基类型的核苷酸段，并且其中所述标记的寡核苷酸能够与每一条固定化的核酸在所述仅一种碱基类型的核苷酸段处形成复合物。
4.权利要求3的用途，其中所述测试核酸的情况包括确定与所述固定化的核酸形成复合物中标记的寡核苷酸的量的评价标准。
5.权利要求1的方法、权利要求2的试剂盒或者权利要求3或4的用途，其中所述核酸是单链DNA、RNA、PNA、CNA、HNA、LNA或ANA，其寡核苷酸或其任何的组合。
6.权利要求1的方法、权利要求2的试剂盒或者权利要求3或4的用途，其中所述仅一种碱基类型的核苷酸段是胸腺嘧啶、尿嘧啶或鸟嘌呤段。
7.权利要求6的方法、试剂盒或用途，其中所述仅一种碱基类型的核苷酸段具有约2 到约100个核苷酸的长度，优选约16个核苷酸。
8.权利要求1的方法、权利要求2的试剂盒或权利要求3或4的用途，其中所述交联是由光进行的交联，所述光的波长为约200-300nm，优选为254 nm，或者波长约300-500nm， 优选为365nm，并使用能量为约0. 1 Joule/cm2到约10 Joule/cm2的范围的量。
9.权利要求1的方法、权利要求2的试剂盒或者权利要求3或4的用途，其中所述化学固定是胺修饰的核酸和固体载体上相应的官能团之间的耦合，其中所述官能团优选环氧基、醛基、羧基或者NHS基。
10.权利要求1的方法、权利要求2的试剂盒或者权利要求3或4的用途，其中所述仅一种碱基类型的核苷酸段定位在所述核酸的3’或5’端。
11.权利要求1、5、6、9或10中任意一项的方法，权利要求2、5、6、9或10中任意一项的试剂盒或权利要求3至6、9或10中任意一项的用途，其中所述核酸由下式表示·5，-Yn-Xm-Br-Xp-Zq-S'Y和Z是仅一种碱基类型的核苷酸段，其中Y和Z可以是相同或不同的碱基类型；X是间隔，优选由脱碱基核苷酸组成；B是多于一种碱基类型的序列，以及n、m、r、p和q是核酸中核苷酸的数量，其中以下情况可以应用n、m、p、q、r >1 ； n、m、r > 1且p、q = 0 ； ρ、 q、r>l 且 n、m = 0; n、q、r>l 且 m、p = 0; n> r > 1 m> p> q = 0 ； q、r>l 且n、m、ρ = 0。
12.权利要求1的方法、权利要求2的试剂盒或者权利要求3或4的用途，其中所述标记的寡核苷酸包含荧光的、放射性的或化学发光的标记物。
13.权利要求1的方法、权利要求2的试剂盒或者权利要求3或4的用途，其中所述固体载体包含胺官能化的基团，优选伯胺或仲胺，以及更优选是多孔基片如尼龙，或无孔基片如玻璃、聚-L -赖氨酸涂层材料、硝酸纤维素、聚苯乙烯、环烯烃共聚物(C0C)、环烯烃聚合物(COP)、聚丙烯、聚乙烯或聚碳酸酯。
14.权利要求1或13的方法，其中所述与仅一种碱基类型的核苷酸段互补的标记的寡核苷酸通过升高温度到超过所述标记的寡核苷酸的解链温度而获得，用于在进一步的步骤 (d)中再利用。
15.一种分析核酸的方法，其包括以下步骤(a)通过热或光交联或化学固定，将一条或多条核酸固定化在固体载体上，其中每一条固定化的核酸包含仅一种碱基类型的核苷酸段；(b)提供与仅一种碱基类型的核苷酸段互补的标记的寡核苷酸，其中所述标记的寡核苷酸能够与每一条固定化的核酸在仅一种碱基类型的核苷酸段处形成复合物；(c)检测与仅一种碱基类型的核苷酸段外的序列互补的特异性序列的存在，以及(d)通过在与固定化核酸形成的复合物中与仅一种碱基类型的核苷酸段互补的标记的寡核苷酸的量来确定所述核酸的情况的评价标准。
16.权利要求1、13或14中任意一项的方法，其中所述固定化核酸的质量可以通过进一步的步骤另外测试，所述步骤包括(i)提供至少一种标记的测试寡核苷酸，其与在仅一种碱基类型的核苷酸段之外的预先确定的特定的核苷酸段互补，其中所述标记的寡核苷酸能够区别地与固定化的核酸形成复合物，所述固定化的核酸包含所述特定的核苷酸段；以及(ii)通过在复合物中所述测试寡核苷酸的存在来确定所述核酸的情况的评价标准，所述复合物由所述测试寡核苷酸与在固定化的核酸中的在仅一种碱基类型的核苷酸段之外的预先确定的特定的核苷酸段形成，所述固定化的核酸包含所述特定的核苷酸段。
17.权利要求2的用于测试载体上的核酸的试剂盒，其另外包含(c) 至少一个标记的测试寡核苷酸，其与在仅一种碱基类型的核苷酸段之外的预先确定的特定的核苷酸段互补，其中所述标记的寡核苷酸能够区别地与固定化的核酸形成复合物，所述固定化的核酸包含所述特定的核苷酸段。
18.权利要求15或16的方法或权利要求17的试剂盒，其中所述标记的测试寡核苷酸与在仅一种碱基类型的核苷酸段之外的预先确定的特定的核苷酸段互补，所述标记的测试寡核苷酸用标记物标记，所述标记物在光学上或化学上区别于与仅一种碱基类型的核苷酸段互补的标记的寡核苷酸上的标记物。
全文摘要
本发明涉及测试载体上的核酸的方法，其包含通过交联固定一条或多条核酸，其中每一条固定化的核酸包含仅一种碱基类型的核苷酸段，提供与所述核苷酸段互补的标记的寡核苷酸以及确定对于所述核酸的情况的评价标准。本发明进一步涉及用于测试载体上的核酸的试剂盒，其包含固定化在固体载体上的核酸阵列，其中每一条固定化的核酸包含仅一种碱基类型的核苷酸段以及与所述核苷酸段互补的标记的寡核苷酸。本发明还涉及标记的寡核苷酸用于测试固定化在固体载体上的核酸的情况的用途，所述寡核苷酸与仅一种碱基类型的核苷酸段互补。
文档编号C12Q1/68GK102171367SQ200980138908
公开日2011年8月31日 申请日期2009年9月29日 优先权日2008年10月1日
发明者A·皮里克, H·R·斯塔珀特 申请人:皇家飞利浦电子股份有限公司