Hmo合成的制作方法

专利名称：Hmo合成的制作方法
HMO合成本发明涉及稳定地培养于培养基中的适应于制备寡糖的细胞，转化所述细胞使其包含至少一个编码参与寡糖合成的酶的核酸序列。例如从Dumon等Q001)已知这种细胞。长时间来已知人母乳，除乳糖外，还包含被称为人乳寡糖(HMO)的寡糖的复杂混合物。就组成和量而言此人母乳的寡糖部分是独特的。与其他哺乳动物形成对比，人母乳包含7 12g/L的寡糖浓度，其比在大多数其他哺乳动物中高10 100倍(Boehm和Mahl， 2007，Kunz 等，2000，Newburg 和 Neubauer，1995)。现在，属于HMO的超过80种化合物已经在结构上被表征。通常，与在人体中发现的其他寡糖不同，HMO的特征在于，在还原末端的乳糖结构部分，和在非还原末端的岩藻糖和/或唾液酸。区分有两种基本类型1型结构的寡糖具有与GIcNAC进行α 1，4_连接的岩藻糖， 而II型结构的寡糖显示GIcNAC或葡萄糖的α 1，3位岩藻糖基化；任何一种类型可以包含与半乳糖进行α 1，2-连接的岩藻糖。最重要的寡糖是2'-岩藻糖基乳糖和3-岩藻糖基乳糖。这些结构与上皮细胞表面复合糖的表位、Lewis组织-血型抗原诸如Lewis χ(Lex) (Gal ( β 1-4) [Fuc-(a 1-3) ]GlcNAc ( β 1))密切相关(Newburg，2001)。HMO 与上皮表位的结构同源性解释了防御细菌性病原体的性质。例如，通过使病原体与HMO而非与人黏膜表面聚糖结合能够显著减小致病大肠杆菌(Escherichia coli) (Cravioto 等，1991)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae) (Coppa 等， 2006)、肺炎链球菌(Sti^ptococcus pneumoniae) (Andersson 等，1986)或空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni) (Ruiz-Palacios等，2003)的毒力，并且与毒素如大肠杆菌 (E. coli)的热稳定肠毒素的结合也是如此(Crane等，1994)。除了所提及的在肠道中的局部作用，HMO通过进入全身循环，还能够在婴儿中诱发全身作用(tooth等，2001)。HMO对蛋白-碳水化合物相互作用，例如选择蛋白-白细胞结合的影响能够调节免疫反应并且减小炎性反应(Bode，2006，Kunz和Rudloff，2006)。为降低新生儿获得感染的频率并且，因此，以及婴儿死亡率，当然非常需要广泛地给婴儿提供包括HMO的营养物。这在其中普遍并且广泛实行母乳喂养的社会中可能是容易实现的。但是一般都不是这样。存在若干医学原因，比如可能的传染性疾病的母婴传播，所述原因在特定情况下反对母乳喂养。在很多非洲国家，例如，母乳喂养可能是在婴儿期期间感染HIV的主要原因。同样地，文化情况可能导致拒绝母乳喂养，如在主要工业国家像，例如，美国就是这样。由于HMO在天然源诸如其他哺乳动物的乳汁中只能以低浓度存在，所以从天然源提取寡糖不适于满足对HMO的需要。寡糖的化学合成是费力的并且需要多个保护和脱保护步骤(Kretzschmar和Stahl, 1998)，因此通常相对昂贵并且具有低的回收率。因此，利用生物技术工程生物体发酵制备寡糖对于大规模的HMO合成是有前途的可选解决方案。在过去的十年中，若干合成HMO的成功尝试已被发表，所述尝试使用重组大肠杆菌发酵或使用体外酶转化。这些尝试主要集中在合成属于HMO或与HMO十分相似的岩藻糖基化的化合物。例如，若干出版物描述了以下各项的合成=Lewis结构乳_N_新岩藻戊糖 (lacto-N-neofucopentaose)、乳-N-新二岩藻己糖(lacto-N-neodifucohexaose)禾口乳-N-新二岩藻辛糖(lacto-N-neodifucooctaose)，以及2'-和3_岩藻糖基乳糖 (fucosyllactose) (Albermann 等，2001，Dumon 等，2006，Dumon 等，2001，Dumon 等，2004， Koizumi等，2000)。在这些情况中，离析物像例如乳糖的酶岩藻糖基化通过岩藻糖基转移酶 (FucTs)来进行。报道岩藻糖基化的化合物制备的多数出版物就此描述了源自幽门螺杆菌 (Helicobacter pylori)的FucTs的使用。一般，人FucI1s也能够用于此目的。然而，当在细菌细胞中超表达时，来源于细菌的FucTs —般较少地倾向于产生诸如错折叠和不溶性的问题。此外，多数公布的用于合成岩藻糖基化的化合物的系统依赖大肠杆菌的内源 ⑶P-岩藻糖库，所述库通常用于合成包含岩藻糖的外泌多糖可拉酸(colonic acid) (Grant 等，1970)。在这些情况中，⑶P-岩藻糖的可用性当然是瓶颈，其限制了合成效率。最近，本发明的发明人已经描述了利用Fkp酶的新的整细胞制备方法(Parkot等， 2008)，此专利申请的全部内容通过引用结合于此。Fkp (Coyne等，2005)，来源自脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)，是具有双重功能的酶，其拥有岩藻糖激酶和L-岩藻糖-I-P-鸟苷酸转移酶两种活性。因此，外源供给的岩藻糖首先被磷酸化然后被核苷酸激活从而形成重要的前体分子GDP-岩藻糖。基于Fkp 的L-岩藻糖补救途径已经被成功地用于合成岩藻糖基化的寡糖(Parkot等，2008)。虽然，在如此的生化合成的水平上，已经发展出重要策略，但是已知的用于体内寡糖合成的方法都具有一定的不足，其抑制，至多，寡糖的大规模制备。在细胞中高速制备寡糖的实际难点一方面是细胞内大量富集制备的寡糖和核苷酸副产品，而另一方面是制备的寡糖的提取。由于细胞内富集，所述合成反应的产物会逐渐形成对合成酶的产物抑制作用。因此在某一点，所述合成变得无效率的慢。此外，所述产物可能达到细胞毒性浓度以驱使细胞裂解或至少代谢受阻。在任何情况中，寡糖的连续细胞内制备是不可能的。此外，能够预期过量的寡糖累积将最终导致细胞裂解和细胞死亡。此细胞裂解或之后进行的用于从所述细胞提取合成的寡糖的细胞裂解将产生目标寡糖和细胞组分(代谢产物、碎片)的复杂混合物。从此复杂混合物中纯化目标寡糖成本昂贵并且因此对于大多数寡糖来说是不经济的。在这些条件下，生物技术寡糖制备是低效并且难以控制的，尤其因为已知的生物技术寡糖制备使用分批培养来进行，从经济角度，这种分批培养是很不令人满意的。考虑到以上，本发明的目标是以这样的方式改进生物技术制备寡糖的方法以致所述制备变得容易和更可控，并且寡糖的产量总的来说得到提高。根据本发明，此目标和其他目标通过提供最初提到的类型的细胞来实现，此外转化所述细胞使其包含至少一个编码糖流出转运蛋白家族(sugar efflux transporter family)蛋白、其功能同系物或衍生物的核酸序列。本发明的目标因此完全实现。根据本发明，理解寡糖是单糖的短的聚合物，其包含至少2个糖亚基。所述寡糖可以是亚基的支链或形成亚基的直链。此外，所述寡糖的糖亚基的特征可以是许多化学修饰。 因此，根据本发明的寡糖可以包含一个或多个非糖结构部分。根据本发明，核酸序列描述遗传密码，其由核酸聚合物像例如脱氧核糖核酸聚合物或核糖核酸聚合物代表。遗传密码因此可以包括包含蛋白形成信息的编码序列，或非编码区域，所述非编码区域包括例如启动子区域、用于结合调节或辅助化合物的区域、间隔区和影响所述核酸聚合物自身的二级或三级结构和/或参与其加工的结构序列。根据本发明，“转化...以使其包含”涉及向细胞中插入至少一个另外的核酸序列的任何方法，其后所述核酸序列作为质粒出现在所述细胞中或被整合到所述细胞的染色体中。已知的转化方法包括例如化学转化或电穿孔。通过将至少一个另外的核酸序列的染色体整合，即使在没有选择剂的情况下，通常能够获得稳定的基因转移。为了该目的，可以用病毒或噬菌体感染所述细胞。备选地，可以应用使用例如基于病毒或转座子的系统的同源和非同源重组的其他方式。对于生物技术应用，从细胞输出较大的寡糖是复杂的问题。这是主要的情况，因为只鉴定出了很少的涉及这种运输的细胞机制。从细胞输出寡糖很少发生的原因在于寡糖合成消耗大量的细胞资源。因此这些化合物的损失对于细胞来说通常是不利的。此外，寡糖输出的大部分已知机制涉及寡糖的化学修饰，例如通过使它们与脂质-结构部分相连(Alaimo等，2006)。从而，寡糖不仅以膜运载，这抑制它们释放到培养基中，而且与脂质-结构部分化学连接，这降低了它们在水性介质中的溶解度。因此，这样的机制几乎不适于在大规模制备寡糖中使用。由Liu和同事首先描述(Liu等，1999a)的大肠杆菌的糖流出转运蛋白(SET)家族包括蛋白SetA、ktB和ktC。转运蛋白的同源物(氨基酸同一性> 50% )主要在肠杆菌科(Enterobacteriaceae)中被发现(Liu 等，l9"a)。除葡萄糖和乳糖外，SET输出蛋白(exporter protein)显示出对以下物质的底物特异性特定单糖和二糖以及，例如，诱导物分子异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)和有毒的糖类似物ο-硝基苯基-β -D-硫代半乳糖苷(ONPG) (Liu等，1999b)。然而生化研究显示，例如，SetA对较大的或较庞大的分子诸如庚糖或三糖显示非常低至零转运活性。由于以上原因，不能预期SET家族的输出蛋白将丝毫适于转运寡糖。然而，本发明人已经发现，令人惊奇地，SET输出蛋白的超表达导致非常有效的寡糖输出。此外，SET蛋白已经显示输出乳糖(所述合成反应的离析物之一)。因此预期，在经修饰的细胞中获得的寡糖的合成将非常低效并且缓慢地进行，这归因于离析物持续地从所述细胞中排出。相反，本发明人已经能够首次显示，纵使SET输出蛋白超表达，在经修饰的细胞中获得的寡糖的合成也具有高的生产率。通常，优选地，所述细胞选自由以下各项组成的组细菌、真菌、动物和植物细胞。 因此特别优选地，所述细胞是大肠杆菌细胞。由此优势是大肠杆菌细胞提供高的代谢活性和高的繁殖率。此外，大肠杆菌是一种得到最好表征的用于分子生物学和生物技术用途的生物体。本领域中已知的用于转化和培养细菌的众多技术尤其适用于大肠杆菌。此外，在市场上可以买到具有多种遗传背景的大肠杆菌菌株。此外，优选地，所述酶选自包含以下各项的组糖基转移酶、Leloir类糖基转移酶、非Leloir糖基转移酶、唾液酸转移酶、半乳糖基转移酶、岩藻糖基转移酶、甘露糖基转移酶、N-乙酰葡糖胺转移酶、N-乙酰半乳糖胺转移酶。根据一个实施方案，所述酶是岩藻糖基转移酶。此外，优选地，所述糖流出转运蛋白是SetA或其衍生物。在此情况中的优势是，在输出蛋白的SET家族的经生化表征的成员中，SetA以具有最广的底物特异性为特征。因此，使用^tA能够至少潜在地输出并因此制备最广泛多样的寡糖。同样优选地，进一步转化所述细胞使其包含至少一个编码推动或促进寡糖合成所需离析物的输入的蛋白的核酸序列。因此，有优势的是，细胞内的离析物浓度增加。在正常条件下，离析物诸如岩藻糖或乳糖的输入受限于相应输入蛋白(importer protein)的可用性。然而，在适应于大规模合成寡糖的细胞的情况中，离析物的输入，其依赖于输入蛋白的内源水平，可能不足以连续地给所述合成反应提供离析物。可以通过超表达各自的输入蛋白来解决此问题。在此情况中相关的输入蛋白主要是单糖或二糖的输入蛋白诸如乳糖输入蛋白，例如大肠杆菌半乳糖苷通透酶(LacY)或岩藻糖输入蛋白，例如大肠杆菌岩藻糖通透酶 (FucP)，但是也可以包括核苷酸和其他离析物的输入蛋白。尤其优选地，转化所述细胞使其包含至少一个编码选自由以下各项组成的组的蛋白的核酸序列乳糖转运蛋白、岩藻糖转运蛋白、唾液酸转运蛋白、半乳糖转运蛋白、甘露糖转运蛋白、N-乙酰葡糖胺转运蛋白、N-乙酰半乳糖胺转运蛋白、ABC转运蛋白、核苷酸激活糖的转运蛋白以及核碱基(NuclecAase)、核苷或核苷酸的转运蛋白。就此而论，核苷酸激活糖可以是，但不限于⑶P-岩藻糖、CMP-唾液酸、UDP-半乳糖、UDP-葡萄糖、⑶P-甘露糖、UDP-葡糖胺或UDP-半乳糖胺。此外，术语核碱基是指鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶。核苷是指鸟苷、胞苷、腺苷、胸苷和尿苷，而核苷酸可以是鸟苷、胞苷、腺苷、胸苷或尿苷的单磷酸、二磷
酸或三磷酸酯。此外，优选地，进一步转化所述细胞使其包含至少一个核酸序列，所述核酸序列编码选自由以下各项组成的组的蛋白核苷酸基转移酶、鸟苷酸转移酶、尿苷酰基转移酶 (uridylyltransferase) ,Fkpa-岩藻糖激酶、岩藻糖磷酸鸟苷酸转移酶、CMP-唾液酸合成酶、半乳糖激酶、半乳糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、葡萄糖激酶、葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、甘露糖激酶、甘露糖-1-磷酸鸟苷酸转移酶、GDP-4-酮-6-脱氧-D-甘露糖还原酶、葡糖胺激酶、葡糖胺-磷酸乙酰转移酶、N-乙酰-葡糖胺-磷酸尿苷酰基转移酶、
7UDP-N-乙酰葡糖胺4-差向异构酶、UDP-N-乙酰葡糖胺2-差向异构酶。就此而论，术语核苷酸基转移酶通常涉及能够将核苷酸转移到糖磷酸 (phosphosugar)上的酶，不管它是天然存在的糖还是非天然的糖。由此优势是，如在通过引用包含于此的Parkot等，2008中所同样描述的，细胞内核苷酸激活糖像GDP-岩藻糖的库可以得到补充。因此，使寡糖合成更有效。此外，通常优选地，合成寡糖所涉及和/或需要的所选择的单糖、二糖或寡糖的细胞分解代谢通路至少部分失活。此处，优势在于总的合成效率能够增加的事实。这是因为更少的指定用于寡糖合成的离析物被细胞的内源代谢所消耗的情形。在以下描述的实施方案中，例如，使用乳糖降解缺陷型细胞。这能够通过使由IacZ 基因编码的半乳糖苷酶失活来获得。此遗传修饰防止细胞内的乳糖裂解为可快速代谢的单糖葡萄糖和半乳糖。因此，作为随后的糖基化/岩藻糖基化反应的受体分子，乳糖以较高的浓度存在。在备选实施方案中，用于寡糖合成的细胞是，只是或除上述1 α cZ缺陷型外还是， L-岩藻糖降解缺陷型的。这可以通过使fucA基因失活来获得，所述fucA基因编码岩藻糖降解通路的关键的分解代谢酶岩藻糖(fucul0Se)-l-磷酸醛缩酶(FucA)。当然，还有从酶抑制剂到稳定转染的RNAi构建体的其他可用技术，可以使用所述技术以使分解代谢通路至少部分失活。在本发明的范围内，通常优选地，所述寡糖包含至少三个亚基和/或以具有至少大约480g/mol的分子量为特征。所有主要的重要的HMO的分子量在此阈值之上。本发明进一步涉及用于制备寡糖的方法，所述方法包括以下步骤a)提供根据本发明的细胞，b)在允许制备所述寡糖的条件下在培养基中培养所述细胞，c)从所述培养基中提取所述寡糖。在本发明的范围内，允许的条件被理解为是涉及物理或化学参数包括但不限于温度、PH、压力、渗透压和产物/离析物浓度的条件。在具体的实施方案中，所述允许的条件可以包括30+/-20°C的温度范围、7+/-3的 PH范围。上述方法具有的优势是寡糖能够直接从所述培养基中提取，而已知方法需要裂解所述细胞以及随后从得到的裂解液中提取寡糖。就此而论，优选地，使用连续流式生物反应器来进行步骤b)。优势在于，使用连续流式生物反应器，能够容易地提高制备的寡糖量。这是因为所述合成以相对高的水平连续发生的情形。同样优选地，步骤b)中的培养基包含一种或多种选自由以下各项组成的组的物质支持细胞生长和繁殖的基础补充剂、选择剂、基因活性的效应物以及合成寡糖所需要的离析物。支持细胞生长和繁殖的典型补充剂是从现有技术广为人知的并且在例如 Sambrook和RuSSel，2001中得到描述。这种基础补充剂解决培养的细胞的一般营养需要，其包含例如蛋白、碳水化合物、脂质和矿物质。同样地，选择剂像抗生素是从现有技术例如Sambrook和RuSSel，2001广为人知的。可以使用这样的药剂以便使遗传修饰的细胞的培养免受竞争性生物体诸如真菌或细菌的持续污染。此外，例如在细菌群落中，可以使用选择剂以便稳定包含在质粒上的遗传信肩、ο可以使用基因活性的效应物以在细胞内选择性地诱导或抑制某些基因或基因的组的活性。这样的效应物在从简单的化学化合物诸如异丙基-1-硫代-D-吡喃半乳糖苷(IPTG)到更复杂的化合物像激素的范围内。这样的基因活性的效应物是从现有技术例如从Sambrook和Russel，2001广为人知。此外，优选地，所述离析物选自由以下各项组成的组阿拉伯糖、苏糖、赤藓糖、核糖、核酮糖、木糖、葡萄糖、D-2-脱氧-2-氨基-葡萄糖、N-乙酰葡糖胺、葡糖胺、果糖、甘露糖、半乳糖、N-乙酰半乳糖胺、半乳糖胺、山梨糖、岩藻糖、N-乙酰神经氨酸、糖苷、非天然糖、核碱基、核苷、核苷酸和其任何可能的二聚体或聚合物。通常优选地，所述寡糖包含至少三个亚基和/或以具有至少大约480g/mol的分子量为特征。根据本发明的实施方案，由上述方法制备的寡糖是岩藻糖基乳糖，在此情况中优势在于岩藻糖基乳糖是存在于HMO中的最主要的化合物中的一种。进一步的优势从对实施方案和附图的描述得出。不言而喻地，以上提及的特征和仍要在以下说明的特征不仅能够用于分别指定的组合，还能够用于其他组合或其自身，而不离开本发明的范围。本发明的若干实施方案图示于附图中并且在随后的描述中得到更详细说明。在附图中

图1显示在根据本发明修饰的革兰氏阴性细菌细胞中寡糖合成和转运的综述示意图；图2显示在细菌培养物的细胞潮湿团块和上清液中3-岩藻糖基乳糖的测量结果， 其比较不同的基因型；以及图3显示在关于不同基因型的细菌培养物中合成的3-岩藻糖基乳糖的量之间的比较。实施例1 在革兰氏阴性细菌细胞内的寡糖合成和转运图1显示革兰氏阴性细菌细胞10的截面。根据本发明的革兰氏阴性细菌细胞10 包括外膜11、质膜12、定位于所述外膜11和所述质膜12之间的周质间隙13、以及被所述质膜12包围在内的细胞溶胶14。所述外膜包括孔蛋白，通过所述孔蛋白水溶性化合物能够从培养基16进入周质间隙13并且反之亦然。根据本发明的一个实施方案，所述质膜包括起第一离析物-转运蛋白17作用的 FucP、起第二离析物转运蛋白18作用的LacY、和起产物输出蛋白作用的SetA0此外，起核苷酸基转移酶20作用的Fkp和起糖基转移酶21作用的FutAco包含在细胞溶胶14中。根据此实施方案，当将作为第一离析物22的岩藻糖和作为第二离析物23的乳糖提供给培养基16时，他们通过孔蛋白15进入周质间隙13。然后，第一离析物22由第一离析物转运蛋白17转运到细胞溶胶14中。在细胞溶胶中，第一离析物22由核苷酸基转移酶 20修饰，产生核苷酸基化的第一离析物24，即GDP-岩藻糖。第二离析物23由第二离析物输入蛋白15输入到细胞溶胶14中。然后糖基转移酶21催化核苷酸基化的第一离析物，即GDP-岩藻糖和第二离析物， 即乳糖之间的反应，产生寡糖25，3-岩藻糖基乳糖，和⑶P (未显示)。之后，寡糖25由产物输出蛋白19(SetA)从细胞溶胶14输出到周质间隙13中并且能够经由孔蛋白15离开周质间隙13，并进入培养基16。实施例2 材料和方法2. 1表达质粒的构建和大肠杆菌菌株的开发使用大肠杆菌JM109 (DE3) (Promega ；www. promega. com)作为用于开发大肠杆菌生产菌株的初始宿主菌株。用于克隆步骤的所有寡核苷酸引物列表于表1中。构建质粒 pACYC-1 α cY 和 pACYC-1 α cF-setA 如下使用引物 IacY NcoI 正向 /IacY EcoRI 反向和 setA NdeI 正向 /setA XhoI 反向从大肠杆菌 TOPlO (Invitrogen ；www. invitrogen. com)的基因组DNA扩增基因IacY (相应于GenBank登录号ACB02461) (GenBank ；www. ncbi. nlm. nih. gov)和 setA (相应于 GenBank 登录号 YP_025^3) (GenBank)。使 PCR 产物进行使用指定的酶的限制性消化，并与相应消化的表达载体pACY⑶uet-1 (Novagen ；www. merckbiosciences. co. uk)连接。通过限制性消化、琼脂糖凝胶电泳以及使用引物pACYCduetUPl、DuetDOffN-I-弓丨物、DuetUP2-引物和T7-终止子-引物的测序来检验所得的质粒的基因的正确插入(数据未显示)。所用的质粒pCOLA-fkp-fucP和pET-futAco以前已经被构建(Parkot等，2008)。 为获得菌株JMOO、JMOl和JM02，通过电穿孔将质粒的不同组合引入大肠杆菌JM109(DE3) (Dower等，1988)。所有的质粒和细菌菌株列表于表2中。2. 2大肠杆菌中岩藻糖-分解代谢的失活为防止外部提供的岩藻糖的降解，使编码关键分解代谢酶L-岩藻糖-1-磷酸醛缩酶的fucA基因从大肠杆菌JM109(DE!3)的染色体中缺失。用于诱变过程的所有寡核苷酸引物列表于表1。为构建fucA缺失型突变体，应用Datsenko和Wanner的方法(Datsenko禾口 Wanner, 2000)，其使用引物fucA-敲除-f和fucA-敲除_r。通过PCR，使用位于染色体插入位点旁侧的引物fucA-对照-f和fucA-对照-r来确认fucA的正确缺失，并且通过将所述细菌涂板于M9基本琼脂(minimal agar)上来证实岩藻糖-阴性表型(Sambrook和 Russell, 2001)，所述M9基本琼脂补充岩藻糖作为唯一碳源(数据未显示)。表1此研究中使用的引物
权利要求
1.在培养基中稳定培养的细胞，所述细胞适应于制备寡糖，转化所述细胞使其包含至少一个编码参与寡糖合成的酶的核酸序列，其特征在于另外转化所述细胞使其包含至少一个编码糖流出转运蛋白家族的蛋白、其功能同源物或衍生物的核酸序列。
2.根据权利要求1的细胞，其特征在于所述细胞选自由细菌、真菌、动物和植物细胞组成的组。
3.根据权利要求2的细胞，其特征在于所述细胞是大肠杆菌(Escherichiacoli)细胞。
4.根据权利要求1至3中任一项的细胞，其特征在于所述酶选自包括以下各项的组 糖基转移酶、Leloir型糖基转移酶、非Leloir糖基转移酶、岩藻糖基转移酶、唾液酸转移酶、半乳糖基转移酶、甘露糖基转移酶、N-乙酰葡糖胺转移酶、N-乙酰半乳糖胺转移酶。
5.根据权利要求4的细胞，其特征在于所述酶是岩藻糖基转移酶。
6.根据权利要求1至5中任一项的细胞，其特征在于所述糖流出转运蛋白是ktA或其衍生物。
7.根据权利要求1至6中任一项的细胞，其特征在于进一步转化所述细胞以使其包含至少一个编码推动或促进寡糖合成所需离析物的输入的蛋白的核酸序列。
8.根据权利要求7的细胞，其特征在于转化所述细胞以使其包含至少一个编码选自由以下各项组成的组的蛋白的核酸序列乳糖转运蛋白、岩藻糖转运蛋白、唾液酸转运蛋白、 半乳糖转运蛋白、甘露糖转运蛋白、N-乙酰葡糖胺转运蛋白、N-乙酰半乳糖胺转运蛋白、 ABC-转运蛋白、核苷酸激活糖的转运蛋白和核碱基、核苷或核苷酸的转运蛋白。
9.根据权利要求1至8中任一项的细胞，其特征在于进一步转化所述细胞以使其包含至少一个编码选自由以下各项组成的组的蛋白的核酸序列核苷酸基转移酶、鸟苷酸转移酶、尿苷酰基转移酶、Fkp、L-岩藻糖激酶、岩藻糖-1-磷酸鸟苷酸转移酶、CMP-唾液酸合成酶、半乳糖激酶、半乳糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、葡萄糖激酶、葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、甘露糖激酶、甘露糖-1-磷酸鸟苷酸转移酶、GDP-4-酮-6-脱氧-D-甘露糖还原酶、 葡糖胺激酶、葡糖胺-磷酸乙酰转移酶、N-乙酰-葡糖胺-磷酸尿苷酰基转移酶、UDP-N-乙酰葡糖胺4-差向异构酶、UDP-N-乙酰-葡糖胺2-差向异构酶。
10.根据权利要求1至9中任一项的细胞，其特征在于所述细胞包含关于所选的单糖、 二糖或寡糖的分解代谢通路，所述分解代谢通路至少部分失活，所述单糖、二糖或寡糖参与所述寡糖合成和/或为所述寡糖合成所需。
11.根据权利要求1至10中任一项的细胞，其特征在于所述寡糖包含至少三个亚基和 /或以具有至少大约480g/mol的分子量为特征。
12.用于制备寡糖的方法，所述方法包括以下步骤a)提供根据权利要求1至11中任一项的细胞，b)在培养基中在允许制备所述寡糖的条件下培养所述细胞，c)从所述培养基中提取所述寡糖。
13.根据权利要求12的方法，其特征在于使用连续流式生物反应器来进行步骤b)。
14.根据权利要求12或13的方法，其特征在于，在步骤b)中的培养基包含一种或多种选自由以下各项组成的组的物质支持细胞生长和繁殖的基本补充剂、选择剂、寡糖合成所需的离析物、基因活性的效应物。
15.根据权利要求14的方法，其特征在于所述离析物选自由以下各项组成的组阿拉伯糖、苏糖、赤藓糖、核糖、核酮糖、木糖、葡萄糖、D-2-脱氧-2-氨基-葡萄糖、N-乙酰葡糖胺、葡糖胺、果糖、甘露糖、半乳糖、N-乙酰半乳糖胺、半乳糖胺、山梨糖、岩藻糖、N-乙酰神经氨酸、糖苷、非天然糖、核碱基、核苷、核苷酸和其任何可能的二聚体或聚合物。
16.根据权利要求12至15中任一项的方法，其特征在于所述寡糖包含至少三个亚基和 /或以具有至少大约480g/mol的分子量为特征。
17.根据权利要求16的方法，其特征在于所述寡糖是岩藻糖基乳糖。
全文摘要
本发明涉及在培养基中稳定培养的细胞，所述细胞适应于制备寡糖，转化所述细胞使其包含至少一个编码参与寡糖合成的酶的核酸序列。此外，转化所述细胞使其包含至少一个编码糖流出转运蛋白家族的蛋白、其功能同源物或衍生物的核酸序列。此外，本发明涉及用于制备寡糖的方法，所述方法涉及以上细胞。
文档编号C12N15/63GK102459605SQ200980159755
公开日2012年5月16日 申请日期2009年6月8日 优先权日2009年6月8日
发明者埃里克·休夫纳, 斯特凡·詹内怀恩, 朱莉娅·帕考特 申请人:詹尼温生物技术有限责任公司