专利名称：一种检测农田生态环境的高通量多重ldr分型试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于多重LDR分型试剂盒领域，特别涉及一种检测农田生态环境的高通量 多重LDR分型试剂盒。
背景技术：
田间的多个物种对农田生态系统及其重要，它能为哪一营养关系处于更重要的地 位提供指导，田间多个物种的检测分型对于研究生态系统功能非常重要。目前国内外已建 立了若干针对田间多个物种的检测分型方法，但这些方法普遍存在着通量小、操作难度大、 烦琐，提供信息量少等弱点，妨碍了研究机构对田间多个物种开展有效的科研和检测。现有 的检测田间多个物种的方法主要分为两种，一是传统的对其肠道或排泄物进行分析，一是 以聚合酶链式反应结合连接酶检测反应为主要技术的高通量、高准确度，高灵敏度分析法。从田间收集多个物种并对其肠道或排泄物进行分析，其检测手段从最初的放射性 标记、多克隆抗体和物种的酶谱分析愈发倾向于单克隆抗体与DNA技术，检测靶标亦从单 一物种转移到多物种鉴别。但因单克隆抗体制备极其烦琐，且靶标唯一难以实现高通量检 测，故在检测田间多个物种中其应用方面大打折扣。而DNA技术在1997年首先在海洋生物 捕食链中展示其可行性后，逐渐成为脊椎动物与无脊椎食物链研究的新型模式。DNA分子作 为遗传信息的直接载体，不受环境、生物发育阶段及器官组织的影响，因而能较为准确地反 映出各个物种间的系统发生关系，但常规的PCR方法需要对每个物种设计相应的引物来扩 增，而田间物种种类繁多，无法使用多重PCR技术来监测多达数十种的植食者昆虫，故限制 了其应用。通用引物PCR结合LDR(ligase detection reaction)技术是使用通用引物对多 物种的保守区进行扩增，根据种间物种特异性单核苷酸位点，构建不同长度的LDR物种特 异探针，利用高温连接酶的高特异性对基因内部的序列差异进行检测，因而具有高通量，高 准确度，高灵敏度等特性，是一种可移植性很强的检测方案。线粒体上的COI基因由于具有 独特的遗传特性，因此被用来分析生物遗传多样性和亲缘关系。由于探针和引物具有高度 敏感性和特异性，使其能对多个物种进行检测分型。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种检测农田生态环境的高通量多重LDR分 型试剂盒，以克服现今普通的分型试剂盒只能揭示少量猎物的田间捕食规律，难以实现高 通量检测的问题。本发明的一种检测农田生态环境的高通量多重LDR分型试剂盒，包括(一)PCR扩增体系(1)农田16种物种的线粒体COI基因通用引物序列上游5'-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3‘；下游5'-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3‘；[OO11] (2)PCR扩增体系试剂[OO12] 上游引物o．5 u M[OO13] 下游引物o．5 u M[O014] 10XBur’fer1>l
5]dNTPo．2rnM[OO16] M／’2．olDM[O017] ．Faq p。lymeraSeo．1 u l(o．5Unit)[OO18] H，。补水至10>l；[OO19] (二)多重LDR检测体系
(1)农田16种物种的线粒体C。工基因的特异探针序列
拟水狼蛛，LDR探针
F．FTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGG(TCCTGACATATCTTTTCCTC(；AATAAATAATC
RP一．ITT(．FTTTTGGTTAI’TACCACCTTCTTTATTTTTATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT—Fam
拟水狼蛛，产物长度121bp
白背飞虱，LDR探针
FTTGGAGCACC．FGATATAG(TTTCCCCC(；AATAAA(
RP—AATATAAGATTTTGGTTA(TTCCACCCTCCTTAAT—Fam
白背飞虱，产物长度70bp
大螟，LDR探针
F．FTTTTTAGGAG(．TATTAATTTTAI’TACAA仁；AAT‘FAT(
RP—AATATACGAC．TAAATAATTTAT(TTTTGAT()AAAT．F-Fam；大螟，产I彩0长度7 3bp
稻沼蝇，LDR探针
F．FTTT~’TCAGCTC．TTTTA(TAC．FTI’TATCATTACC．FGTTCTC
RP—GCTGGAGCCATTAC．FATG(TTCTTACGGATC(；AAATTTTTT—Fam
稻沼蝇，产物长度82[，p
稻纵卷叶螟，LDR探针
F．FTTTTTTT(TATTATAATTGGAGGATTTGGAAATTGATTAGTG
RP—CC．TTTAATAT’TAGGAGCCCC．FGATATAGC．FTq’TCCTTTTTTT—Fam
稻纵卷叶螟，产物长度851，p
稻纵卷叶螟绒茧蜂，LDR探针
] F．FTTTTTTTI’TGCC．FTTATTATAATTTTTTTTATAGT’TATACCAG
RP一．FAATAATTGGAGGATTTGGAAATTGATTAA~’TCCATTTTTTTTT—Fam
稻纵卷叶螟绒茧蜂，产物长度88t，p
杆蝇，LDR探针
F．FTTTTTTTTTTTTTGATTAT’TACCTCCTTCAT．FAA(TTTATTAATG
RP—GC．TAGAAGTATAGTAGAAAATGGAG(．TGGAA(TGGTTTTTTTTTT—Fam
杆蝇，产物长度91bp
褐飞虱，LDR探针
F．FTTTTTTTTTTTCAGGATTTATAGGAACCATAA(；TAGTATAAT‘FAT(R:P-CGATCAGAATTAACTCAACCAGGATCTCTAATTAATTTTTTTTTTTT-Fam ； 褐飞虱，产物长度94bp 黑肩绿盲蝽，LDR探针
F:TTTTTTTTTTTTTTTATCACATAATGGAAGATCAGTAGATTTAGCAATC ； R:P-TTCTCACTTCACTTAGCTGGTATTTCATCAATTTTTTTTTTTTTTTTT-Fam ； 黑肩绿盲蝽，产物长度97bp 黑尾叶蝶，LDR探针
F:TTTTTTTTTTTTTTTTACTTTTAATAAGATCTATCATTGAAATAGGAGTG ； R:P-GGAACAGGTTGAACAGTATACCCCCCCCTTTCAAGTTTTTTTTTTTTTTT-Fam ； 黑尾叶蝉，产物长度IOObp 灰飞虱，LDR探针
F:TTTTTTTTTTTTTTTTTTCGCTGGAGTTAGATCTATTATAGGAGCTATCAAC ； R=P-TTCATTTCTACAATTATTAATATACGATCAAAAAATTTTTTTTTTTTTTTT-Fam ； 灰飞虱，产物长度103bp 摇蚊，LDR探针
F:TTTTTTTTTTTTTTTTTTCTAGAAGTATAGTAGAAAATGGAGCAGGAACAGGG ； RP-TGAACTGTTTATCCTCCACTTTCATCTGGAATTGCTTTTTTTTTTTTTTTTTT-Fam ； 摇蚊，产物长度106bp 蓟马，LDR探针
F:TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGATCGAAATTTGAACACTTCATTTTTTGATCCAAG ； RP-AGGAGGAGGGGATCCAGTACTTTACCAACACTTATTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-Fam ； 蓟马，产物长度109bp 水蝇，LDR探针
F:TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAATAAATAATATAAGATTTTGATTATTACCTCCTG ； R :P-CATTAACTTTATTATTAGTAAGCAGTATAGTTGATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT ； 水蝇，产物长度112bp 蚜虫，LDR探针
F:TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTACAATTCATGCTTTTATTATAATTTTTTTTATAA ； R P-CTATACCAATTGTTATTGGTGGTTTTGGAAATTGATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-Fam ； 蚜虫，产物长度115bp 二化螟，LDR探针
FTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGATCTTTAATTGGGGATGATCAAATTTATAATACC ；
R=P-ATTGTTACAGCTCATGCATTTATTATAATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-Fam
二化螟，产物长度IlSbp ；
(2) LDR检测体系试剂
混合探针0. lumol/L
IOXBuffer1 μ 1
PCR扩增DNA模板 1 μ 1
Taq0.1 μ 1 (4Unit)
7
H2O补水至 10 μ 1。所用的1 X Taq DNA连接酶缓冲液具体组分为20mM Tris-HCl (pH 7. 6)，25mM KAc, IOmM Mg (Ac) 2, IOmM DTT，ImM NADfPO. Triton X100，缓冲液应冷冻C存。所述的混合探针的方案为将16中物种探针以等浓度混合。本试剂盒主要由通用引物PCR和特异探针LDR两部分组成。在PCR中，设计的通 用引物同时扩增出所选物种的CO I基因序列，再经过连接反应，各物种特异的LDR探针达 到分型的目的。LDR信号由ABI Prism 377型核酸分析仪检出，测得的荧光值作为定性的依 据。本试剂盒的设计原理包括以下步骤(1)靶标基因的确定、稻田捕食者及其猎物的获得选取的稻田捕食者为拟水狼蛛，猎物为白背飞虱、大螟、稻沼蝇、稻纵卷叶螟、稻纵 卷叶螟绒茧蜂、杆蝇、褐飞虱、黑肩绿盲蝽、黑尾叶蝉、灰飞虱、摇蚊、蓟马、水蝇、蚜虫和二化 螟，一共16种；选取线粒体上的CO I基因作为靶标基因，进行分型研究，构建多物种联合检 测的PCR体系和多重LDR体系；(2)线粒体CO I基因片段的通用引物PCR扩增及测序特异PCR引物扩增拟水狼蛛及其猎物的CO I基因序列，将通用引物扩增的PCR产 物克隆到大肠杆菌的质粒里，并测序，得到包括拟水狼蛛在内的16个物种的序列，每个物 种尽量测10个体，用于评估个体间的SNP影响；(3)序列比对及探针设计将测序的物种用DNAssist软件比对，找出COI基因扩增片段的种间差异，寻找种 间物种特异性单核苷酸位点，构建LDR物种特异探针，选出的位点须经物种个体间比对，排 除种内SNP位点位于该物种特异性单核苷酸位点上；针对物种特异性核苷酸位点设计LDR探针，各物种连接探针连接产物长度为70 121bp，相邻片段间隔为3bp;(4)探针特异性检测及优化抽提各物种的标准质粒，定量到统一浓度(IOpg/ μ L)。首先，取单模板和单探针做 探针特异性评估，经测序仪分析，所有探针均有预测长度连接产物生成；其次，取单模板和 多探针做探针特异性评估，经测序仪分析，特异性良好。最后，多模板多探针检测，将16个 物种的标准质粒等浓度混合(总浓度IOpg/ μ L)，利用CO I的通用引物进行扩增，然后用多 重探针进行检测，得到多重探针检测方案。有益效果本发明的试剂盒针对CO I基因的通用引物有效扩增出所有目标物种序列，保证了 各目标序列以及其中低拷贝的模板可被检测到；各目标物种的特异探针进一步又保证了特 异性，使各目标序列完全区分出来，实现多重分型定量，从而了解田间捕食结构的变化，维 护农田生态环境。
图1为CO I基因的通用引物PCR结合LDR检测多个物种的示意图；其中，(A) 16个物种的标准质粒DNA，⑶线粒体上CO I基因的通用引物，(C)利用CO I基因通用引物和质粒DNA模板进行的PCR反应，(D)针对CO I基因通用引物扩增区段 设计的特异LDR探针，(E)针对CO I基因通用引物扩增区段设计的不同长度的特异LDR探 针，(F)进行的是按特异探针混合方案进行的多重LDR反应，(G)ABI Prism 377型核酸分析 仪上获得的单模板单探针荧光定量分型分析图，(H)ABI Prism 377型核酸分析仪上获得的 16个物种的多模板多探针荧光定量分型分析图。
具体实施例方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人 员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定
的范围。
实施例1
(一)拟水狼蛛DNA和被食者DNA的通用引物扩增
(1)将16个物种的标准质粒等浓度混合，总浓度为IOpg/ μ L ；
⑵通用引物
上游5' -GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3‘；
下游5' -TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3‘；
(3)扩增体系(10μ 1)
上游引物0. 5μΜ
下游引物0. 5μΜ
IOXBuffer1 μ 1
dNTP0. 2mM
Mg2+2. OmM
Taq polymerase0. 1 μ 1 (0. 5Unit)
加水至10 μ 1 ；
(4)扩增程序
95 0C 15min
94°C 30s — 50°C Imin — 72°C 2min (35cycles)
72 °C 7min — 4°Cforever
(二)拟水狼蛛DNA和被食者DNA的连接酶检测反应(LDR)
(1)将通用引物扩增所得PCR产物作为模板用于LDR信号检测
(2) LDR 体系(10 μ1)
混合探针0.lumol/L
IOXBuffer1 μ 1
模板1 μ 1
Taq polymerase0. 1 μ 1 (4unit)
加水至10 μ 1
其中，16个物种的特异探针等浓度混合；
(3) LDR反应程序
9
95 °C 2min94°C 30s — 60°C 2min (35cycles)。
权利要求
一种检测农田生态环境的高通量多重LDR分型试剂盒，包括(一)PCR扩增体系(1)农田16种物种的线粒体CO I基因通用引物序列上游5′ GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG 3′；下游5′ TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA 3′；(2)PCR扩增体系试剂上游引物 0.5μM下游引物 0.5μM10×Buffer 1μldNTP 0.2mMMg2+ 2.0mMTaq polymerase 0.1μlH2O补水至10μl(二)多重LDR检测体系(1)农田16种物种的线粒体CO I基因的特异探针序列拟水狼蛛，LDR探针FTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGGCTCCTGACATATCTTTTCCTCGAATAAATAATC；RP TTTCTTTTTGGTTATTACCACCTTCTTTATTTTTATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT Fam；拟水狼蛛，产物长度121bp白背飞虱，LDR探针FTTGGAGCACCTGATATAGCTTTCCCCCGAATAAAC；RP AATATAAGATTTTGGTTACTTCCACCCTCCTTAAT Fam；白背飞虱，产物长度70bp大螟，LDR探针FTTTTTTAGGAGCTATTAATTTTATTACAACAATTATC；RP AATATACGACTAAATAATTTATCTTTTGATCAAATT Fam；大螟，产物长度73bp稻沼蝇，LDR探针FTTTTTTCAGCTCTTTTACTACTTTTATCATTACCTGTTCTC；RP GCTGGAGCCATTACTATGCTTCTTACGGATCGAAATTTTTT Fam；稻沼蝇，产物长度82bp稻纵卷叶螟，LDR探针FTTTTTTTTCTATTATAATTGGAGGATTTGGAAATTGATTAGTG；RP CCTTTAATATTAGGAGCCCCTGATATAGCTTTTCCTTTTTTT Fam；稻纵卷叶螟，产物长度85bp稻纵卷叶螟绒茧蜂，LDR探针FTTTTTTTTTTGCCTTTATTATAATTTTTTTTATAGTTATACCAG；RP TAATAATTGGAGGATTTGGAAATTGATTAATTCCATTTTTTTTT Fam；稻纵卷叶螟绒茧蜂，产物长度88bp杆蝇，LDR探针FTTTTTTTTTTTTTTGATTATTACCTCCTTCATTAACTTTATTAATG；RP GCTAGAAGTATAGTAGAAAATGGAGCTGGAACTGGTTTTTTTTTT Fam；杆蝇，产物长度91bp褐飞虱，LDR探针FTTTTTTTTTTTTCAGGATTTATAGGAACCATAAGTAGTATAATTATC；RP CGATCAGAATTAACTCAACCAGGATCTCTAATTAATTTTTTTTTTTT Fam；褐飞虱，产物长度94bp黑肩绿盲蝽，LDR探针FTTTTTTTTTTTTTTTATCACATAATGGAAGATCAGTAGATTTAGCAATC；RP TTCTCACTTCACTTAGCTGGTATTTCATCAATTTTTTTTTTTTTTTTT Fam；黑肩绿盲蝽，产物长度97bp黑尾叶蝉，LDR探针FTTTTTTTTTTTTTTTTACTTTTAATAAGATCTATCATTGAAATAGGAGTG；RP GGAACAGGTTGAACAGTATACCCCCCCCTTTCAAGTTTTTTTTTTTTTTT Fam；黑尾叶蝉，产物长度100bp灰飞虱，LDR探针FTTTTTTTTTTTTTTTTTTCGCTGGAGTTAGATCTATTATAGGAGCTATCAAC；RP TTCATTTCTACAATTATTAATATACGATCAAAAAATTTTTTTTTTTTTTTT Fam；灰飞虱，产物长度103bp摇蚊，LDR探针FTTTTTTTTTTTTTTTTTTCTAGAAGTATAGTAGAAAATGGAGCAGGAACAGGG；RP TGAACTGTTTATCCTCCACTTTCATCTGGAATTGCTTTTTTTTTTTTTTTTTT Fam；摇蚊，产物长度106bp蓟马，LDR探针FTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGATCGAAATTTGAACACTTCATTTTTTGATCCAAG；RP AGGAGGAGGGGATCCAGTACTTTACCAACACTTATTTTTTTTTTTTTTTTTTTT Fam；蓟马，产物长度109bp水蝇，LDR探针FTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAATAAATAATATAAGATTTTGATTATTACCTCCTG；RP CATTAACTTTATTATTAGTAAGCAGTATAGTTGATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT；水蝇，产物长度112bp蚜虫，LDR探针FTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTACAATTCATGCTTTTATTATAATTTTTTTTATAA；RP CTATACCAATTGTTATTGGTGGTTTTGGAAATTGATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT Fam；蚜虫，产物长度115bp二化螟，LDR探针FTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGATCTTTAATTGGGGATGATCAAATTTATAATACC；RP ATTGTTACAGCTCATGCATTTATTATAATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT Fam；二化螟，产物长度118bp；(2)LDR检测体系试剂混合探针0.1umol/L10×Buffer 1μlPCR扩增DNA模板 1μlTaq 0.1μlH2O 补水至10μl。
2.根据权利要求1所述的一种检测农田生态环境的高通量多重LDR分型试剂盒，其特 征在于所述的IXTaq DNA连接酶缓冲液具体组分为20mM pH 7. 6Tris_HCl，25mM KAc, IOmM Mg (Ac) 2, IOmM DTT，ImM NAD 和 0. 1% Triton X100，缓冲液冷冻C存。
3.根据权利要求1所述的一种检测农田生态环境的高通量多重LDR分型试剂盒，其特 征在于所述的混合探针的方案为将16中物种探针以等浓度混合。
全文摘要
本发明涉及一种检测农田生态环境的高通量多重LDR分型试剂盒，包括农田16种物种的线粒体COI基因通用引物，上游5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′；下游5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′；农田16种物种的线粒体COI基因的特异探针序列；以及PCR扩增和LDR检测程序所用试剂。本发明的试剂盒针对COI基因的通用引物有效扩增出所有目标物种序列，保证了各目标序列以及其中低拷贝的模板可被检测到；各目标物种的特异探针进一步又保证了特异性，使各目标序列完全区分出来，实现多重分型定量，从而了解田间捕食结构的变化，维护农田生态环境。
文档编号C12Q1/68GK101921828SQ201010102179
公开日2010年12月22日 申请日期2010年1月28日 优先权日2010年1月28日
发明者叶恭银, 周宇荀, 李凯, 田俊策, 肖君华, 赵丽亚, 陈强 申请人:东华大学