专利名称：动物皮毛中9种芽孢杆菌16s rDNA PCR-RFLP指纹图谱分析方法
技术领域：
本发明属于进出境动物皮毛中常见芽孢杆菌(包括致病的芽孢杆菌)的指纹分析 方法。
背景技术：
随着我国对外贸易的扩大以及我国在世界经济发展角色的转变，我国已成为动物 皮革加工及出口的国家之一。皮革加工是一个高污染的产业，发达国家为保护环境已经将 其转移到发展中国家。目前我国皮毛的进口国有美国、法国、阿根廷、乌拉圭、加拿大、新西 兰、比利时等。动物皮毛中含有大量的细菌，虽然大多数为非致病菌或条件性致病菌，但如 果动物的皮毛来源于患病动物，那么所进口的皮毛中必定携带有这些致病菌，如炭疽杆菌、 结核杆菌、布氏杆菌等。炭疽杆菌作为进出境皮毛的法检项目已实施多年，但检出率很低， 基本上没有。但这并不能说明皮毛中不含有炭疽杆菌，主要是由于目前所用的标准方法的 灵敏性不高，而且容易出现假阳性的结果。基于DNA的检测方法已越来越多的被当前检验检疫行业标准所采纳，成为对大宗 货物进行筛查的方法之一。细菌的16s rDNA是非常保守的一段序列，通过对其序列的分析， 可将细菌鉴定到属，甚至是种。同时，对其序列的分析发现，各个细菌的16s rDNA具有限制 性片段多态性。基于细菌16s rDNA的PCR-RFLP(PCR-限制性片段长度多态性)可以建立 各种细菌(本专利主要是针对动物皮毛中常见的9种芽孢杆菌)指纹图谱，因此可以通过 对皮毛中的细菌进行16s rDNA的PCR-RFLP分析，与所建立的指纹图谱进行比对，即可得出 是哪种芽孢杆菌，从而进行鉴别。该方法操作简便、灵敏、特异、快速、重复性好等优点。目前国内外还没有建立针对 动物皮毛中芽孢杆菌的16s rDNA的PCR-RFLP指纹图谱，本发明可弥补目前方法的缺陷，准 确完成动物皮毛中芽孢杆菌的鉴定。
发明内容
本发明主要是应用17种内切酶对芽孢杆菌16s rDNA进行切割，从而建立9种芽 孢杆菌的16s rDNA指纹图谱。本发明的主要原理为针对9种芽孢杆菌的16s rDNA，利用通用引物27f和1492r 进行扩增，扩增产物用17种内切酶分别进行切割，经琼脂糖凝胶电泳后，显示出各个芽孢 杆菌的特异性指纹谱图。
具体实施例方式(1)常规方法分离鉴定皮毛中的芽孢杆菌，分离到8种芽孢杆菌，炭疽杆菌为军事 医学科学院提供的核酸样本。(2)细菌总DNA的提取
利用细菌DNA提取试剂盒，分别提取9种菌的总DNA，步骤按照试剂盒操作说明。(3) PCR利用细菌16s rDNA通用引物对提取的细菌DNA进行16s rDNA扩增。(4) RFLP用17种内切酶对PCR产物进行切割。17种内切酶及其排布顺序如下Aval，BamHI，Bg II，DraI，EcoRI，EcoR II，HindIII，Hinf，HpaI，PstI，SmaI，TaqI， XbaI，XmaI，AluI，XhoI，PvuI0(5)琼脂糖凝胶电泳对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳胶为2%的琼脂糖凝胶。(6) PCR-RFLP指纹图谱的建立对所得图谱进行分析，显示各个菌的谱图能相互区分，表明各个菌的指纹图谱具 有特异性，可作为其他菌株PCR-RFLP比对的基础。
图1是分离的一种芽孢杆菌的16s rDNA PCR-RFLP图谱；图2是分离的另外一种芽孢杆菌的16s rDNA PCR-RFLP图谱； 图3是侧芽短芽孢杆菌的16s rDNA PCR-RFLP图谱；
图4是环状芽孢杆菌的16s rDNA PCR-RFLP图谱； 图5是枯草芽孢杆菌的16s rDNA PCR-RFLP图谱； 图6是蜡样芽孢杆菌的16s rDNA PCR-RFLP图谱； 图7是耐热芽孢杆菌的16s rDNA PCR-RFLP图谱； 图8是桥石芽孢杆菌的16s rDNA PCR-RFLP图谱； 图9是球型芽孢杆菌的16s rDNA PCR-RFLP图谱； 图10是苏云金芽孢杆菌的16s rDNA PCR-RFLP图谱； 图11是炭疽芽孢杆菌的16s rDNA PCR-RFLP图谱。 比对，所分离的2种菌分别与图9和图10吻合，因此鉴定为苏云金芽孢杆菌和球型芽 孢杆菌。
权利要求
1.芽孢杆菌鉴定的快速检测方法，其特征在于所使用的内切酶种类及酶切后形成的指 纹图谱共用17种内切酶分别对动物皮毛中的9种芽孢杆菌进行酶切鉴定，17种内切酶为Ava I, BamH I, BgII, Dra I,EcoR I, EcoRII, HindIII, Hinf, Hpa I，Pst I, Sma I, Taq I, Xba I,Xma I, AluI, Xho I，Pvu I，并按照这样的顺序进行酶切。指纹图谱为这17种内切酶切 割后形成17道的电泳图谱，而且每种菌均具有特异而且唯一的指纹。
全文摘要
本发明为动物皮毛中9种芽孢杆菌PCR-RFLP的检测技术，具体地说是用17种内切酶对存在于动物皮毛中的9种芽孢杆菌的16s rDNA进行酶切，每种菌形成一个16s rDNA的内切酶指纹图谱，从而建立9种菌的检测方法。方法包括PCR扩增16s rDNA，然后以17种内切酶分别对9种菌的16s rDNA扩增产物进行酶切，再经琼脂糖凝胶电泳。9种芽孢杆菌分别是球型芽孢杆菌、环形芽孢杆菌、桥石芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、耐热芽孢杆菌、侧芽短芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、炭疽芽孢杆菌。具体检测方法包括9种芽孢杆菌DNA的提取、PCR扩增16s rDNA、内切酶酶切、琼脂糖凝胶电泳、PCR-RFLP指纹图谱的建立。其优点是快速、特异性强、灵敏度高、操作简便。
文档编号C12Q1/04GK101993953SQ20101016037
公开日2011年3月30日 申请日期2010年4月23日 优先权日2010年4月23日
发明者朱来华, 肖西志, 邓明俊, 高宏伟 申请人:山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心