专利名称：甜樱桃品种自交不亲和s基因型的ssr分子标记鉴定方法
技术领域：
本发明涉及一种甜樱桃品种(系)自交不亲和S基因型的SSR分子标记鉴定方法， 尤其是一种适用于不同甜樱桃自交不亲和性(S基因型)品种(系)的鉴定、指导育种亲本 的选择及其授粉品种的配置的SSR分子标记鉴定方法。 背景技术：
甜樱桃(Prunusavium L.)属配子体型自交不亲和(Gametophyticself-incomp atibility, GSI)，遗传上由染色体上具有复等位基因构成的单一位点或基因座控制(称为 S基因座)，一个S基因座上，植物种群内可含有多个S等位基因(S alleles)，称之为S基 因。甜樱桃品种大多数为自交不亲和品种，在生产中必须配置授粉树或人工辅助授粉，才能 获得应有的产量和果实品质；因此使用甜樱桃品种自交不亲和S基因型的SSR分子标记鉴 定方法是十分重要。而目前在配置授粉品种时，常是依据田间不同品种间授粉坐果率的高 低来确定授粉品种，这种方法虽直观有效，但不仅费时费力，盲目性比较大，而且由于人们 对品种的S基因型不了解，使在选配品种时具有较大的盲目性，影响了提高樱桃品质。如果知道品种的S基因型或能快速鉴定出品种的基因型，依据不同S基因型的品 种间互相授粉结实，而相同S基因型的品种间授粉不结实原理，能正确选择授粉品种，对提 高樱桃品质具有很大的意义。甜樱桃品种S基因型鉴定是一项长期的应用基础性研究工作，随着新品种的不 断育成和推广，需要探索出一套简易有效的方法来鉴定甜樱桃品种S基因型，这不仅能为 研究甜樱桃自交不亲和性机理提供更有益的试材，而且能为生产确定最佳授粉品种提供依 据。然而，从现有的鉴定方法而言，主要是用田间品种间相互授粉座果率高低来确定，虽然 直观有效，但工作量大，周期长；生物技术方法虽然具有省工、快捷等优点，但要求相应的设 备和技术条件，有一定的局限性，从而使甜樱桃品种S基因型鉴定进展缓慢。尤其在我国， 樱桃生产者选用授粉品种时，多按传统的田间授粉率高低来确定，而对于通过鉴定品种的S 基因型，选择具有不同S基因型品种作为授粉树科学性认识不足，是迄今我国樱桃新品种 选育慢的主要原因之一。甜樱桃品种S基因型鉴定是一个极其薄弱而又急待加强的研究领 域。
发明内容
为了克服上述技术缺点，本发明的目的是提供一种甜樱桃品种(系)自交不亲和 S基因型的SSR分子标记鉴定方法，可提高自交不亲和基因型的检测效率，缩短了甜樱桃育 种进程，节约了生产成本。为达到上述目的，本发明采取的技术方案是用PTCR4SSR标记，其SSR引物序列上游引物5 ‘ -CATAGGTTCAAACCATACCCGTG-3 ‘下游引物5 ‘ -CTCATCTTTGTAGGGTATAATACC-3 ‘
扩增不同甜樱桃品种的DNA，可扩增出255bp的扩增片段，标志着花粉S基因存在， 通过琼脂糖电泳检测获得电泳图；根据琼脂糖电泳图，确定各品种(系)的自交不亲和基因型相同谱带为同一 S基 因型，反之为不同S基因型。本发明设计了，SSR扩增反应体系(25 μ L)中含有10XPCR buffer 2. 5 士 0· 25μ L，2. 5mmol · L-1ClNTPs 2. 0 士 0· 2 μ L，MgCl2 (2. 5mmol · Γ1) 2· 0 士 0· 2 μ L，IU Taq DNA 聚合酶 1 士0. IyL, SSR 上、下游引物(5pmol · μ^Ι Ο. 1 μ L0本发明设计了，SSR扩增反应体系(20 μ L)中含有10XPCR buffer 2. 0 + 0. 2μ L, 2. 5mmol · L_1dNTPs 1· 6 士0· 16 μ L, MgCl2 (2. 5mmol · Γ1) 1· 6 士0· 16μ L，0. 8U Taq DNA 聚合 酶 0· 8士0· 08 μ L, SSR 上、下游引物(5pmol · μ Γ1) 0· 8士0· 08 μ L。本发明设计了，SSR扩增反应体系(15 μ L)中含有10XPCR buffer
1.5 士 0· 15μ L，2. 5mmol · L-1ClNTPs 1. 2 士 0· 12 μ L, MgCl2 (2. 5mmol · Γ1) 1. 2 士 0· 12μ L，0. 6U Taq DNA 聚合酶 0. 6士0. 06 μ L，SSR 上、下游引物(5pmol · μ Γ1) 0. 6士0. 06 μ L。本发明设计了，SSR扩增反应体系(IOyL)中含有10XPCR buffer 1.0士0· IyL,
2.5mmol · L_1dNTPs 0. 8 士0. 08 μ L, MgCl2 (2. 5mmol · L-1) 0· 8 士0· 08μ L，0. 4U Taq DNA 聚合 酶 0· 4士0· 04 μ L, SSR 上、下游引物(5pmol · μ Γ1) 0· 4士0· 04 μ L。本发明设计了，扩增热循环参数为94°C预变性3 7min，然后94°C变性40 50s，51 53°C退火40-50s，72°C延伸0 60s，共28个循环，最后72°C延伸7min。本发明设计了，电泳检测设置为2. 5%的琼脂糖凝胶电泳检测。
四
附图为本发明的利用SSR引物PTCR4对甜樱桃品种的S基因型琼脂糖检测结果电 泳图，M为DNA Marker ；泳道1 8依次为甜樱桃品种萨米特(S1S2)、滨库(S3S4)、海蒂 芬根(S3S5)、红蜜(S3S6)、大紫(S1S2K红灯(S3S9)、早大果(S1S9K先锋(S1S3)0
五具体实施例方式本发明的第一个实施例，选取萨米特、滨库、海蒂芬根、红蜜、大紫、红灯、早大果、 先锋8个甜樱桃品种。鉴定操作流程如下1、DNA 提取采用CTAB法，提取萨米特、滨库、海蒂芬根、红蜜、大紫、红灯、早大果、先锋8个甜 樱桃品种的基因组DNA。2、PTCR4SSR 标记的获得利用选择性扩增微卫星(SAM)法从甜樱桃品种‘红南阳’的基因组DNA中分 离SAM片段，经回收、克隆、测序后，用Sputnik软件对测序结果进行分析，获得甜樱桃 PTCR4SSR标记，其SSR引物序列，上游引物5' -CATAGGTTCAAACCATACCCGTG-3 ‘，下游引物 5 ‘ -CTCATCTTTGTAGGGTATAATACC-3‘。3、对甜樱桃品种的基因组DNA进行PCR扩增把8个甜樱桃品种的基因组DNA分别稀释成75ng · μ L—1。
SSR 扩增反应体系(25 μ L)中含有 10XPCR buffer 2· 5μ L，2. 5mmol · I^dNTPs 2. 0 μ L, MgCl2 (2. 5mmol ‘ L-1) 2. 0 μ L, IU Taq DNA 聚合酶，SSR 上、下游引物(5pmol · μ Γ1) 各 IyL0PCR参数为94°C预变性5min，然后94°C变性45s，52°C退火45s，72°C延伸55s，共 28个循环，最后72°C延伸7min。本实施例中，SSR扩增反应在ABI公司Gene Amp PCR System 9700上进行。
4、电泳检测标记引物PTCR4PCR扩增产物对甜樱桃品种(系)的PCR扩增产物在北京六一仪器厂生产的DYY-6C型电泳仪 上，经2. 5%的琼脂糖凝胶电泳在DYCP-33B型电泳槽，100V电压下电泳60分钟，检测PCR 扩增产物，获得扩增片段大小为255bp。5、结果确定根据琼脂糖电泳分析结果，确定各品种的自交不亲和基因型相同谱带为同一 S 基因型，反之为不同S基因型。结果如附图中表示M为DNA Marker ；泳道1 8依次为甜樱桃品种萨米特(S1S2)、 滨库(s3s4)、海蒂芬根(s3s5)、红蜜(s3s6)、大紫(S1S2K红灯(s3s9)、早大果(S1S9K先锋 (S1S3) ο萨米特(S1S2)与大紫(S1S2)为同一 S基因型。本发明的第二个实施例，在实施例一中操作流程步骤3为把8个甜樱桃品种的基 因组DNA分别稀释成50ng · μ L—1。SSR 扩增反应体系(25 μ L)中含有 10XPCR buffer 2. 25 μ L, 2. 5mmol · L_1dNTPs
1.8 μ L, MgCl2 (2. 5mmol ‘ L-1) 1. 8 μ L, IU Taq DNA 聚合酶，SSR 上、下游引物(5pmol · μ Γ1) 各 0· 9μ L。PCR参数为94°C预变性3min，然后94°C变性40s，51°C退火40s，72°C延伸50s，共 28个循环，最后72°C延伸7min。本实施例中，SSR扩增反应在ABI公司Gene Amp PCR System 9700上进行。本发明的第三个实施例，在实施例一中操作流程步骤3为把8个甜樱桃品种的基 因组DNA分别稀释成IOOng · μ L—1。SSR 扩增反应体系(25 μ L)中含有 10XPCR buffer 2. 75μ L，2. 5mmol · L_1dNTPs
2.2 μ L, MgCl2 (2. 5mmol ‘ L-1) 2. 2 μ L, IU Taq DNA 聚合酶，SSR 上、下游引物(5pmol · μ Γ1) 各 1. lyL。PCR参数为94°C预变性7min，然后94°C变性50s，53°C退火50s，72°C延伸60s，共 28个循环，最后72°C延伸7min。本实施例中，SSR扩增反应在ABI公司Gene Amp PCR System 9700上进行。本发明的第四个实施例，在实施例一中操作流程步骤3为把8个甜樱桃品种的基 因组DNA分别稀释成75ng · μ L—1。SSR 扩增反应体系(20 μ L)中含有 10XPCR buffer 2· 0μ L，2. 5mmol · L_1dNTPs 1. 6 μ LjMgCl2 (2. 5mmol .Γ1) 1. 6μ L,0. 8U Taq DNA 聚合酶，SSR 上、下游引物(5pmol · μ Γ1) 各 0· 8μ L。PCR参数为94°C预变性5min，然后94°C变性45s，52°C退火45s，72°C延伸55s，共28个循环，最后72°C延伸7min。本实施例中，SSR扩增反应在ABI公司Gene Amp PCR System 9700上进行。本发明的第五个实施例，在实施例一中操作流程步骤3为把8个甜樱桃品种的基 因组DNA分别稀释成50ng · μ L—1。SSR 扩增反应体系(20yL)中含有 10XPCR buffer 1. 8 μ L， 2. 5mmol 'L^dNTPsl. 44 μ L, MgCl2 (2. 5mmol · Γ1) 1· 44 μ L，0· 8U Taq DNA 聚合酶，SSR 上、下 游引物(5pmol · μ Γ1)各 0. 72 μ L。PCR参数为94°C预变性3min，然后94°C变性40s，51°C退火40s，72°C延伸50s，共 28个循环，最后72°C延伸7min。本实施例中，SSR扩增反应在ABI公司Gene Amp PCR System 9700上进行。本发明的第六个实施例，在实施例一中操作流程步骤3为把8个甜樱桃品种的基 因组DNA分别稀释成IOOng · μ L—1。SSR 扩增反应体系(20 μ L)中含有 10XPCR buffer 2. 2 μ L, 2. 5mmol 'L^dNTPsl. 76 μ L, MgCl2 (2. 5mmol · Γ1) 1· 76 μ L，0· 8U Taq DNA 聚合酶，SSR 上、下 游引物(5pmol · μ Γ1)各 0. 88 μ L。PCR参数为94°C预变性7min，然后94°C变性50s，53°C退火50s，72°C延伸60s，共 28个循环，最后72°C延伸7min。本实施例中，SSR扩增反应在ABI公司Gene Amp PCR System 9700上进行。本发明的第七个实施例，在实施例一中操作流程步骤3为把8个甜樱桃品种的基 因组DNA分别稀释成50ng · μ L—1。SSR 扩增反应体系(15 μ L)中含有 10XPCR buffer 1· 5μ L，2. 5mmol · I^dNTPs 1. 2 μ LjMgCl2 (2. 5mmol .Γ1) 1. 2μ L,0. 6U Taq DNA 聚合酶，SSR 上、下游引物(5pmol · μ Γ1) 各 0· 6μ L。PCR参数为94°C预变性5min，然后94°C变性45s，52°C退火45s，72°C延伸55s，共 28个循环，最后72°C延伸7min。本实施例中，SSR扩增反应在ABI公司Gene Amp PCR System 9700上进行。本发明的第八个实施例，在实施例一中操作流程步骤3为把8个甜樱桃品种的基 因组DNA分别稀释成50ng · μ L—1。SSR 扩增反应体系(15 μ L)中含有 10XPCR bufferl. 35 μ L, 2. 5mmol ‘ L_1dNTPs 1. 08 μ L, MgCl2 (2. 5mmol ‘ L-1) 1. 08 μ L, 0. 6U Taq DNA 聚合酶，SSR 上、下游引物 (5pmol · μ L-1)各 0. 54 μ L0PCR参数为94°C预变性3min，然后94°C变性40s，51°C退火40s，72°C延伸50s，共 28个循环，最后72°C延伸7min。本实施例中，SSR扩增反应在ABI公司Gene Amp PCR System 9700上进行。本发明的第九个实施例，在实施例一中操作流程步骤3为把8个甜樱桃品种的基因组DNA分别稀释成IOOng · μ L—1。SSR 扩增反应体系(15 μ L)中含有 10XPCR buffer 1. 65μ L，2. 5mmol · L_1dNTPs 1. 32 μ L, MgCl2 (2. 5mmol ‘ L-1) 1. 32 μ L, 0. 6U Taq DNA 聚合酶，SSR 上、下游引物 (5pmol · μ L-1)各 0. 66 μ L0
PCR参数为94°C预变性7min，然后94°C变性50s，53°C退火50s，72°C延伸60s，共 28个循环，最后72°C延伸7min。本实施例中，SSR扩增反应在ABI公司Gene Amp PCR System 9700上进行。本发明的第十个实施例，在实施例一中操作流程步骤3为把8个甜樱桃品种的基因组DNA分别稀释成75ng · μ L—1。SSR 扩增反应体系(10 μ L)中含有 10XPCR buffer 1· 0μ L，2. 5mmol · L_1dNTPs 0. 8 μ LjMgCl2(2. 5mmol .Γ1)。· 8μ L，0. 4U Taq DNA聚合酶，SSR上、下游引物(5pmol · μ Γ1) 各 0.4 μ L。PCR参数为94°C预变性5min，然后94°C变性45s，52°C退火45s，72°C延伸55s，共 28个循环，最后72°C延伸7min。本实施例中，SSR扩增反应在ABI公司Gene Amp PCR System 9700上进行。本发明的第十一个实施例，在实施例一中操作流程步骤3为把8个甜樱桃品种的 基因组DNA分别稀释成50ng · μ L—1。SSR 扩增反应体系(10 μ L)中含有 10XPCR buffer 0· 9μ L，2. 5mmol · L_1dNTPs 0. 72 μ L, MgCl2 (2. 5mmol ‘ L-1) 0. 72 μ L, 0. 4U Taq DNA 聚合酶，SSR 上、下游引物 (5pmol · μ L-1)各 0. 36 μ L0PCR参数为94°C预变性3min，然后94°C变性40s，51°C退火40s，72°C延伸50s，共 28个循环，最后72°C延伸7min。本实施例中，SSR扩增反应在ABI公司Gene Amp PCR System 9700上进行。本发明的第十二个实施例，在实施例一中操作流程步骤3为把8个甜樱桃品种的 基因组DNA分别稀释成IOOng · μ L—1。SSR 扩增反应体系(10 μ L)中含有 10XPCR buffer 1. 1 μ L,2. 5mmol ‘ L_1dNTPs 0. 88 μ L, MgCl2 (2. 5mmol ‘ L-1) 0. 88 μ L, 0. 4U Taq DNA 聚合酶，SSR 上、下游弓丨物 (5pmol · μ L-1)各 0. 44 μ L0PCR参数为94°C预变性7min，然后94°C变性50s，53°C退火50s，72°C延伸60s，共 28个循环，最后72°C延伸7min。本实施例中，SSR扩增反应在ABI公司Gene Amp PCR System 9700上进行。首先采用CTAB法提取甜樱桃基因组总DNA，利用SAM法开发甜樱桃SSR标记 PTCR4，然后用标记引物PTCR4对不同甜樱桃品种(系)进行PCR扩增，根据不同品种(系) S基因间表现出不同的酶切谱带，确定各品种(系)的S基因型。本发明具有以下特点1、利用SAM法从蔷薇科果树高度保守区设计甜樱桃SSR引物，SSR标记的获得，对 于甜樱桃自交不亲和S基因型的鉴定提供了便利条件。2、利用SSR技术鉴定甜樱桃品种(系)的S基因型，解决了甜樱桃生产中田间授 粉人工工作量大，鉴定周期长，效率低的问题。3、指导了育种亲本的选择及其授粉品种的配置，提高自交不亲和基因型的检测效率，缩短育种进程，节约生产成本。
权利要求
一种甜樱桃品种自交不亲和S基因型的SSR分子标记鉴定方法；其特征是用PTCR4 SSR标记，其SSR引物序列上游引物5′-CATAGGTTCAAACCATACCCGTG-3′下游引物5′-CTCATCTTTGTAGGGTATAATACC-3′扩增不同甜樱桃品种(系)的DNA，可扩增出255bp的扩增片段，标志着花粉S基因存在，通过琼脂糖电泳检测获得电泳图；根据琼脂糖电泳图，确定各品种的自交不亲和基因型相同谱带为同一S基因型，反之为不同S基因型。
2.根据权利要求1所述的甜樱桃品种自交不亲和S基因型的SSR分子标记鉴定方法； 其特征是25yL SSR扩增反应体系中含有IOXPCR buffer 2. 5士0. 25 μ L，2. 5mmol ·厂1 dNTPs 2. 0 士 0· 2μ L，MgCl2(2. 5mmol .L-1) 2· 0 士 0· 2 μ L，IU Taq DNA 聚合酶 1 士 0. 1 μ L, SSR 上、下游引物(5pmol · μ Lll士0.1 μ L。
3.根据权利要求1所述的甜樱桃品种自交不亲和S基因型的SSR分子标记鉴定方 法；其特征是:20 μ LSSR扩增反应体系中含有10XPCR buffer2. 0士0. 2μ L，2. 5mmol ·厂1 dNTPs 1.6 + 0. 16yL, MgCl2 (2. 5mmol ‘ Γ1) 1.6 + 0. 16yL,0.8U Taq DNA 聚合酶 0. 8士0. 08 μ L, SSR 上、下游引物(5pmol · μ Γ1) 0· 8士0· 08 μ L。
4.根据权利要求1所述的甜樱桃品种自交不亲和S基因型的SSR分子标记鉴定方 法；其特征是15 μ LSSR扩增反应体系中含有IOXPCRbuffer 1. 5 士0. 15μ L，2. 5mmol ·厂1 dNTPs 1. 2 + 0. 12 μ L, MgCl2 (2. 5mmol ‘ Γ1) 1. 2 + 0. 12 μ L,0. 6U Taq DNA 聚合酶 0. 6士0. 06 μ L, SSR 上、下游引物(5pmol · μ Γ1) 0· 6士0· 06 μ L。
5.根据权利要求1所述的甜樱桃品种自交不亲和S基因型的SSR分子标记鉴定方 法；其特征是10 μ LSSR扩增反应体系中含有10XPCR buffer 1. 0 士0. 1 μ L，2. 5mmol ·厂1 dNTPs 0. 8 + 0. 08μ L, MgCl2(2. 5mmol ‘ L_1)0. 8 + 0. 08 μ L,0. 4U Taq DNA 聚合酶 0. 4士0· 04 μ L, SSR 上、下游引物(5pmol · μ Γ1) 0· 4士0· 04 μ L。
6.根据权利要求1所述的甜樱桃品种自交不亲和S基因型的SSR分子标记鉴定方法； 其特征是扩增热循环参数为94°C预变性3 7min，然后94°C变性40 50s，51 53°C 退火40-50s，72°C延伸0 60s，共28个循环，最后72°C延伸7min。
7.根据权利要求1所述的甜樱桃品种自交不亲和S基因型的SSR分子标记鉴定方法； 其特征是标记引物PTCR4PCR扩增产物经2. 5%的琼脂糖凝胶电泳检测。
全文摘要
一种甜樱桃品种自交不亲和S基因型的SSR分子标记鉴定方法，用PTCR4SSR标记，其SSR引物序列上游引物5′-CATAGGTTCAAACCATACCCGTG-3′，下游引物5′-CTCATCTTTGTAGGGTATAATACC-3′，扩增不同甜樱桃品种(系)的DNA，可扩增出255bp的扩增片段，标志着花粉S基因存在，再通过琼脂糖电泳检测获得电泳图；根据琼脂糖电泳图，确定各品种(系)的自交不亲和基因型相同谱带为同一S基因型，反之为不同S基因型，由于使用了SAM法开发了甜樱桃SSR标记PTCR4，用于鉴定不同甜樱桃自交不亲和性基因型品种(系)的S基因型，指导了育种亲本的选择及其授粉品种的配置，可提高自交不亲和基因型的检测效率，缩短了甜樱桃育种进程，节约了生产成本。
文档编号C12Q1/68GK101838701SQ201010189428
公开日2010年9月22日 申请日期2010年5月20日 优先权日2010年5月20日
发明者余贤美, 刘庆忠, 张力思, 李国田, 艾呈祥, 苑克俊 申请人:山东省果树研究所