专利名称：一种检测鸭群体中屠体性状的方法及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及检测鸭群体中屠体性状的方法及试剂
品.O
背景技术：
屠体性状一直都是畜牧业生产中重要的经济性状，也是肉鸭品种选育中的重要指 标。长期以来，肉鸭屠体产量得到了显著的增加，主要归功于遗传选育。而随着家禽生产性 状相关的遗传学研究的深入，大量的性状已经定位到染色体上较小的区间，为候选基因的 研究以及后续遗传标记辅助育种的应用奠定了良好的基础。SNP(Single Nucleotide Polymorphism，单核苷酸多态性)主要是指在基因组 DNA序列上发生的单个核苷酸碱基的变异，包括(1)转换(Transition)，是指同型碱基(嘌 呤与嘌呤，或嘧啶与嘧啶)之间发生的变化，如G/A，T/C;(2)、颠换(Transversion)，是指 嘌呤与嘧啶之间发生的变化，如A/T，A/C，G/T，G/C ； (3)插入或缺失突变(Insertion and Deletion, InDel)。在基因组中含有大量的SNP，禽类基因组大约100个碱基存在一个SNP， 由于其分布广泛，同时适合大量快速筛查和基因分型分析，SNP标记已广泛的应用于基因定 位、序列进化分析等研究，对在农业动物中进行的分子标记辅助育种选择也有巨大的促进 作用。胰岛素样生长因子结合蛋白7(Insulin-like Growth Factor bindingprotein 7，IGFBP7)是IGFBP超家族的一个成员，该基因家族的一个特点是编码蛋白质的N末端具有 高度的相似性。IGFBP7能结合IGF-I、IGF-II和胰岛素，但亲和力相对较低[Oh Y5Nagalla SR, Yamanaka Y, Kim H-S, Wilson EM, Rosenfeld RG. Synthesis andcharacterization of insulin-like growth factor-binding protein(IGFBP-7). J Biol Chem(1996)271 30322-30325]，同时在衰老和肿瘤抑制中也发挥着功能[Sprenger CC，Damon SE，Hwa V, Rosenfeld RG, Plymate SR.Insulin-like growth factor binding protein-related protein 1(IGFBP-rP 1) is a potential tumor suppressor protein for prostate cancer. CancerRes (1999) 59 =2370-2375]。已知，IGF等激素对机体的生长起着极其重要的 调控作用，因此，将IGFBP7基因作为候选基因研究其与生长性状(屠体性状)的关系对肉 鸭的育种有很大的价值和意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于检测鸭群体屠体性状的方法以及用于该屠体性状 检测的试剂盒。本发明发现鸭的IGFBP7基因的该单倍型或其中任一 SNP作为标签与屠体性状具 有显著相关的特性，可以作为鸭的遗传标记。进而，本发明提供一种检测鸭群体屠体性状的方法，其是通过检测鸭IGFBP7基因 的自 5，端第 11、97、114、216、221、367、371、390、392、400、和/或403-404位的核苷酸，来确定鸭群体的屠体性状。所述的鸭IGFBP7基因的核苷酸序列如SEQ ID No. 1或2所示。如 果待测鸭为具有SEQ ID No. 1所示核苷酸序列的纯合体，其单倍型基因型为HlHl ；如果待 测鸭为具有SEQ ID Nol和2所示核苷酸序列的杂合体，其单倍型基因型为H1H2 ；如果待测 鸭为具有SEQ IDNo. 2所示核苷酸序列的纯合体，其单倍型基因型为H2H2。在心重和腹脂重中；H2H2基因型群体性状均值大于HlHl和HlHl基因型群体性状 均值，H2H2型为优势基因型；而在其他不同的屠宰分割性状性状中，则HlHl基因型群体性 状均值均大于H1H2和H2H2基因型群体性状均值，HlHl型为优势基因型。因而所述基因型 可作为鸭群体屠体性状育种的辅助选择标记。上述SNP位点可以通过扩增该段序列直接进行测序检测，或者用特异探针检测。 本发明进一步包括用于鸭IGFBP7基因的自5，端第11、97、114、216、221、367、371、390、392、 400、403-404位的核苷酸鉴定的探针或引物。在本发明实施例中，优选的鉴定引物的核苷酸序列如SEQ IDNo. 3和4所示。用该引物鉴定的方法是以待测鸭的基因组DNA为模板，用所述引物进行PCR扩 增，得到的PCR产物即为序列表的序列1或序列表的序列2所示的DNA片段。序列1和 序列2所示DNA片段存在10个核苷酸的差异和1个插入缺失突变，序列1所示DNA片段 自 5，端第 11、97、114、216、221、367、371、390、392、400、403-404 位核苷酸组成的单倍型为 CGTTGCGCCA (缺失CA)，序列2相应单倍型为TACGATATTT (插入CA)。以上所述的方法，待测鸭具体可为CAU北京鸭资源家系的个体，更具体可为CAU北 京鸭资源家系的F2代个体。以上所述的方法，屠体性状具体可为屠宰前活重、屠体重、半净膛、全净膛、腿重、 肝重、肌胃重和翅重、腿肌重、胫蹼重、头重和心重。本发明还包括含有上述探针或引物的试剂盒。当该试剂盒包含上述引物时，其还 可以包括以下试剂中的一种或多种PCR缓冲液、Mg2+、DNA聚合酶、dNTPs。本发明提供的方法和试剂盒可进行辅助育种，快速准确的辅助筛选，具有早期筛 选、节省时间、成本低廉、准确性高的优点。
图1为PCR扩增产物电泳图谱示意图；M IOObp Marker ； 1-6泳道CAU北京鸭资 源家系的6个不同个体；CK 空白对照。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂商店购买得到的。下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。CAU北京鸭资源家系由中国农业大学李宁教授课题组建立的用于定位研究 影响鸭重要经济性状QTL、寻找克隆主效基因的F2杂交实验群体，亲本分别为北京鸭 IV系(肉用型)和V系(蛋用型)；资源群体参考文献Yinhua Huang, Yonghui Zhao, Chris S. Haley, Shengqiang Hu, Jinping Hao, Changxin Wu and Ning Li. [A Genetic andCytogenetic Map for the Duck (Anas platyrhynchos)]. Genetics 173 :287_296(May
42006)。实施例1由于鸭的全基因组序列未测，根据QTL初步定位结果，通过比较基因组学分析，获 得已测序的鸟类——鸡染色体上的同源区域，分析这一区域的基因信息可以找到一些基因 作为影响鸭屠体性状的候选基因进行深入研究，再通过文献检索分析，我们选择了能结合 IGF和胰岛素的IGFBP7基因作为候选基因。根据已公布的鸡IGFBP7基因序列(NC_006091)，比对得到鸭IGFBP7基因序列，并 对其结构进行分析。针对序列设计引物(正向引物5' -ACTAAAACAGAGGTGGTCCTTC-3‘； 反向引物5 ‘ -GAAAAGGAGCGAGTGTTAGAAC-3 ‘)，对CAU北京鸭资源家系Fl代个体进行测 序分析，查找SNP。我们发现在第四外显子及相邻的第三、四内含子部分序列富含SNP，且组 成了一致的单倍型。利用试剂盒检测资源群体F2代个体，进行基因型判定，并与屠体性状 进行关联分析，分析其作为标记辅助育种的价值。一、IGFBP7基因在F2代个体中的序列分析实验材料CAU北京鸭资源家系F2代个体，224个样本。1、基因组DNA的提取鸭7周龄时翅静脉采血，抗凝处理后裂解，经蛋白酶K消化后，用酚仿抽提，TE溶 解-20°C保存。2、利用试剂盒进行PCR扩增反应该试剂盒包括PCR扩增的一对引物，正向引物序列为序列表中的序列3，反向引 物序列为序列表中的序列4 ；其他PCR扩增试剂。PCR反应体系(20 μ 1)模板2 μ 1 (40ng步骤1提取的基因组DNA)，扩增缓冲液 (10Xbuffer) 2 μ 1，IOmM dNTP 1 μ 1，正向引物 0. 3pm/ul，反向引物 0. 3pm/ul, DNA 聚合酶 (TaqE，高保真)0. 2 μ 1，加水补至20 μ 1。PCR 反应条件94°C、3min 预变性；94°C、30sec，60°C、30sec，72°C、30sec，35 循环； 72°C、7min 延伸。PCR产物进行2%琼脂糖凝胶(见图1)，CAU北京鸭资源家系F2代个体均得到一 条清晰的PCR扩增产物，大小约500bp (实际为497bp)，回收目的DNA片段。3、测序分析分别将各样本PCR产物纯化回收片段进行测序。结果表明(表1)，此段序列区 间存在15个SNP和1个插入缺失突变(InDel)，其中最小等位基因频率(Minor Allele Frequency, MAF)大于0. 01的SNP有10个，和1个InDel (加粗、斜体显示)。表1鸭IGFBP7基因测序获得的SNP信息 同时这11个SNP在F2代个体中组成了一致的单倍型，Hl :CGTTGCGCCA (缺失CA)； H2 :TACGATATTT (插入CA)。单倍型基因型频率和单倍型频率见表2，可见，HlHl和H1H2为 两种主要的单倍型基因型。表2IGFBP7单倍型组成的基因型频率和单倍型频率 二、关联分析采用SAS(9.0版)统计分析软件包的PR0C_GLM(广义线性模型)过程进行统计分 析，对供试鸭群体的基因型和屠体性状进行方差统计分析。
统计分析模型Yijkl = μ +G^Sj+H^F^e,^Yijkl为个体的表型性状(屠体)观察值；μ为群体均值；Gi为基因型对表型性状的效应值；Sj为性别对表型性状的效应值；Hk为不同批次对表型性状的效应值；F1为家系对表型性状的效应值；eigkl为对应于观察值的随机残差效应。分析结果见表2。表2IGFBP7基因不同单倍型组成的基因型与鸭群体屠体性状的最小二乘均数 注上标a、b表示差异显著(P < 0. 05)产β表示差异极显著(P < 0. 01)其中在屠宰前活重、屠体重、半净膛、全净膛、腿重、肝重、肌胃重和翅重中，HlHl型 对H1H2型达到差异显著(P <0.05)；在腿肌重、胫蹼重和头重中，HlHl型对H1H2型达到差 异极显著(P <0.01)；在心重中，H2H2型对HlHl和H1H2型都达到差异极显著(P < 0. 01)。同时分析结果表明在心重和腹脂重中；H2H2基因型群体性状均值大于HlHl和 HlHl基因型群体性状均值，H2H2型为优势基因型；而在其他不同的屠宰分割性状性状中， 则HlHl基因型群体性状均值均大于H1H2和H2H2基因型群体性状均值，HlHl型为优势基因 型。这些SNP位点组成的单倍型，或者挑选其中任一 SNP做标签，可以作为一个遗传标记， 应用于鸭屠体性状的分子遗传标记辅助选择，提高肉鸭的选种速度和育种准确性。
权利要求
一种检测鸭群体屠体性状的方法，其通过检测待测鸭IGFBP7基因的自5’端第11、97、114、216、221、367、371、390、392、400、和/或403 404位的核苷酸，来确定鸭群体的屠体性状。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述IGFBP7基因的核苷酸序列如SEQID No. 1或2所示。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，如果待测鸭为具有SEQID No. 1所示核 苷酸序列的纯合体，其单倍型基因型为HlHl ；如果待测鸭为具有SEQ ID Nol和2所示核苷 酸序列的杂合体，其单倍型基因型为H1H2;如果待测鸭为具有SEQ ID No. 2所示核苷酸序 列的纯合体，其单倍型基因型为H2H2。
4.用于鉴定鸭IGFBP7 基因的自 5，端第 11、97、114、216、221、367、371、390、392、400 或 403-404位的核苷酸的探针。
5.用于鉴定鸭IGFBP7 基因的自 5，端第 11、97、114、216、221、367、371、390、392、400 或 403-404位的核苷酸的引物。
6.如权利要求5所述的引物，其为Pf :ACTAAAACAGAGGTGGTCCTTCPr :GAAAAGGAGCGAGTGTTAGAAC。
7.含有权利要求4所述探针或含有权利要求5或6所述引物的试剂盒。
8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，但该试剂盒包含权利要求5所述的引物 时，其还包括以下试剂中的一种或多种PCR缓冲液、Mg2+、DNA聚合酶、dNTPs。
9.权利要求4所述的探针、权利要求5或6所述的引物或权利要求7或8所述试剂盒 在鸭选育中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种检测鸭群体中屠体性状的方法及试剂盒。本发明提供的检测鸭群体中屠体性状的方法是检测鸭IGFBP7基因的SNP所组成的单倍型，判定待测鸭样本的单倍型基因型，以确定其屠体性状。本发明所提供的试剂盒，包括特异扩增IGFBP7基因的PCR扩增引物及其他PCR扩增试剂。本发明方法及试剂盒操作简单快捷，结果稳定可靠，用于辅助育种筛选，具有早期筛选、节省时间、成本低廉、准确性高的优点，在肉鸭育种实践中将有广阔的应用前景。
文档编号C12Q1/68GK101892316SQ201010234950
公开日2010年11月24日 申请日期2010年7月23日 优先权日2010年7月23日
发明者吴非, 李宁, 黄银花 申请人:李宁