专利名称：一种与鸭生长和屠宰性状相关的分子标记及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于畜禽基因工程技术领域，具体涉及一种与鸭生长和屠宰性状相关的分子标记、其制备方法及应用，该分子标记可应用于鸭标记辅助选择育种。
背景技术：
鸭肉属红肉，低胆固醇，低脂肪，高蛋白含量，具有更高的营养价值，在欧美日等国，属高档肉类，价格昂贵；在国内，人们的饮食观念正在发生着变化，随着肉鸭烹饪水平不断提高，鸭肉消费呈上升趋势。培育生长速度快、肉质优良的鸭品种是满足消费者对鸭肉需求增长的有效途径。生长性状和屠宰性状均属于数量性状，由多基因控制。根据表型生长性状进行选择虽然取得了较大的遗传进展，但是随着表型值的提高，通过直接表型选择进一步提高鸭生长速度取得的遗传进展有限，而且表型选择存在遗传改良时距长的缺点，抑制了鸭生长速度改良的遗传进展。另外，有研究表明，随着生长速度的提高，鸭肉品质存在下降的趋势，主要表现在肌内脂肪含量下降、水分含量上升，鸭生长速度和肌肉品质性状间存在负相关。因此，如何在进一步提高鸭生长速度的同时，使肌肉品质保持在一定水平，是目前亟需解决的问题。随着分子生物学技术的发展，人们可以通过寻找控制生长或肉质性状的主基因(major gene) 或与其连锁的分子标记，从而通过分子标记实施早期选择及间接选择。同时，基因的多效性也决定了通过基因型的选择达到选择鸭生长速度的同时，使肉质性状保持在一定的水平具有可行性。目前，尽管在鸭肌肉生长和肉质性状相关候选基因鉴定和应用方面取得了一些进展，但能够真正用于育种实践的影响生长和肉质的分子标记还很有限，进一步寻找鸭生长和肉质相关的候选基因及分子标记是非常必要的。GH基因是位于脑垂体生长通路中又一个关键基因，处于脑垂体生长轴上游发挥作用，能促进细胞的增生与分化、提高动物瘦肉率以及降低脂肪沉积。到目前为止，现有技术没有研究鸭GH基因功能的报道。由于生长激素对机体的生长发育具有重要意义，因此研究 GH基因在鸭生长中的作用关系，并寻找其与鸭生长和屠宰相关的DNA分子标记，具有非常重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于通过克隆鸭GH基因部分序列(内含子2与部分外显子序列)， 提供一种与鸭生长和屠宰性状相关的分子标记及其制备方法，从而实现为鸭标记辅助育种提供分子标记。本发明通过以下技术方案实现—种与鸭生长和屠宰性状相关的分子标记,它的核苷酸序列为SEQ ID N0:1。所述的与鸭生长和屠宰性状相关的分子标记，其中SEQ ID NO :1所示序列的第170位碱基处有一个C170-T170的碱基突变，导致BsmFI-RFLP酶切多态性。一种扩增权利要求2所述分子标记的引物对，它的核苷酸序列为如下所示正向引物5’ -GTACAAAGAGTTCGTAAGTGTC-3，反向引物5’ -GGGAATTTCTTTTGGTGTG-3，。一种上述与鸭生长和屠宰性状相关的分子标记的制备方法，包括如下步骤根据已克隆的鸭GH基因cDNA序列，与鸡GH基因基因组序列进行比对，划分外显子与内含子区域，然后根据划分的鸭GH基因外显子2和外显子3序列设计引物，进行鸭外显子2、3与内含子2序列的扩增；对扩增后所得目的片段进行回收测序、查找突变位点与相应的内切酶；然后对实验群体每个个体的DNA进行扩增与酶切鉴定；最后分析酶切多态位点与生长与屠宰性状之间的相关性，获得SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列。所述的与鸭生长和屠宰性状相关的分子标记可以应用于鸭标记辅助选择育种中。本发明具有如下优点和显著的进步(I)为鸭标记辅助育种提供了一种新的分子标记。(2)提供了一种与鸭生长和屠宰性状相关的分子标记的制备方法及引物对，便于鸭标记辅助育种，丰富了现有技术。
图I :是本发明分子标记的BsmF I-RFLPs的三种基因型(TT、CT、CC)电泳检测结果图。其中M为DNA分子量标准(DS 2000)，1、3、7均为突变纯合子个体，4、6、9、10为野生型纯合子个体，5、8为杂合子个体。此检测结果与测序结果完全相符。图2 :是本发明中鸭GH基因内含子2区T170C多态位点测序峰图。
具体实施例方式以下通过实施例形式对本发明的上述内容再作进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。 实施例IGH基因内含子2SNP位点的检测及PCR-RFLP诊断方法建立(I)引物设计根据已克隆的鸭GH基因序列(GenBank accession no. AB158760. 2)与鸡GH基因基因组序列进行比对，划分出鸭GH基因的不同外显子区域；根据划分的外显子2和外显子 3序列设计引物扩增内含子2序列，设计的引物序列如下F5’ -GTACAAAGAGTTCGTAAGTGTC-3’R5’ -GGGAATTTCTTTTGGTGTG-3’该引物扩增片段长度763bp。(2) PCR扩增条件PCR 反应总体积 15 μ I，其中鸭基因组 DNA 约 lOOng，含 I X buffer, I. 5mmol/ LMgCl2，dNTP 终浓度为 O. 25mmol/L，引物终浓度为 O. 2ymol/L，2U Taq DNA 聚合酶。PCR 扩增程序是95°C 5min，然后再循环 34 次 94°C 30s, 53°C 35s，72°C 45s，最后 72°C延伸 lOmin。 PCR反应产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测并拍照。(3)PCR产物的纯化、克隆和测序
随机抽取100个个体所提的DNA，每个样本吸取I μ I混匀组成池DNA，以该DNA为模板，按照上述(2)中的扩增条件进行PCR扩增，对扩增的PCR产物进行纯化。PCR产物的纯化用凝胶回收纯化试剂盒通过切胶纯化PCR产物，按照试剂盒说明书操作，具体步骤是在紫外灯下从琼脂糖凝胶上切下含目的片段的凝胶，放入I. 5mL离心管中，称重，然后向胶块中加入3倍体积的溶胶液，70°C水浴放置10分钟至胶完全溶解。将所得溶液加入一个吸附柱中，12，OOOrpm离心30秒，弃废液。吸附柱放回收集管并加入700 μ L漂洗液，12000rpm离心30秒，弃废液。再次向吸附柱中加入500 μ L漂洗液， 12000rpm离心30秒，倒掉废液后将吸附柱放回收集管中，12，OOOrpm离心I分钟。将吸附柱放入一干净的离心管中，向吸附柱膜中间加入洗脱缓冲液，室温放置2分钟后，12，OOOrpm 离心I分钟收集纯化产物。连接反应将纯化PCR产物与pMD18-T载体的连接，连接反应总体积是5 μ 1，其中包括2·5μ I 2 X buffer, O. 5 μ I的T载体，O. 5μ I的纯化PCR产物，O. 5 μ I的T4连接酶， 最后加入I μ I灭菌水置4°C水浴过夜。感受态细胞的制备 从37°C培养了 16 20h的新鲜平板上挑取一个DH5 α单菌落接种于2ml LB中，于37°C振荡培养3h，转接Iml菌液于含有30ml LB的盐水瓶中，继续在37 °C振荡培养约4h，待OD6tltl达到O. 3 O. 4时将盐水瓶从摇床取出置冰浴冷却10 15min，然后将菌液转入离心管中于4°C 4，OOOg离心IOmin以收集细胞，将离心管倒置以弃净培养液，用IOml冰预冷的O. lmol/L的CaCl2重悬沉淀，冰浴30min,重复4°C 4，OOOg离心IOmin —次，用4ml冰预冷的O. lmol/L的CaCl2重悬沉淀，置4°C保存备用。转化无菌状态下取100 120 μ I感受态细胞于I. 5ml Ependorff管中，将5 μ I 的连接产物加入混匀，在冰上放置30min，42°C热激90s，其间不要摇动Ependorff管，取出后冰浴3 4min，加入400 μ I无抗生素的LB液体培养基，37°C振荡培养45min。取100 μ I 涂布于已提前4h涂布了 IPTG(Isopropylthio-β -D-galactoside,异丙基硫代-β -D-半乳糖苷)和X-gal的琼脂平板上，37°C平放Ih后倒置培养。阳性克隆鉴定序列测定策略是每个片段均同时采用PCR产物直接测序和克隆测序两种方法。克隆测序是挑取单个克隆子用于测序，序列测定由北京奥科鼎盛生物科技有限公司完成。(4) SNP位点检测通过美国国家生物技术信息中心(NCBI, National Center for Biotechnology Information, http://www. ncbi. nlm. nih. gov)网站 StJ BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)软件，将测序后获得的DNA序列与GenBank数据库中公布的基因序列进行序列同源性比较，以鉴定该DNA序列是否为目的序列。利用BioEdit软件根据测序结果的峰图查找双峰，出现双峰即有可能该位点存在突变；针对突变前后的序列，利用在线软件NBEcutter V2. O查找合适的酶切位点。(5) RFLP 检测条件PCR产物酶切反应体积是10 μ 1，其中IOXbuffer I μ 1，PCR产物3 5 μ 1，限制性内切酶BsmFI为101用H2O补足10 μ 1，将样品混匀后离心，65°C水浴4h，用2%琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，记录基因型，在紫外灯下拍照。送不同基因型个体进行测序，并对测序结果进行序列比对分析。
(6)结果与分析PCR扩增所得的产物经电泳检测后发现均为特异的PCR产物。将PCR产物回收纯化后克隆测序，进行比对分析及酶切位点查找分析后发现，在所测的序列中共发现一个突变位点C —T，位于该序列第170bp处，该位点可被BsmF I内切酶识别。测序结果见核苷酸序列表SEQ ID NO =I0对鸭群体进行BsmF I-RFLP分析发现，在肉鸭群体中出现三条电泳条带，详见图
I。M为Marker由广州东盛生物科技有限公司提供，从上至下的条带依次为100bp、250bp、 500bp、750bp、IOOObp和2000bp ;三条目的条带由下至上分别为170bp、593bp和763bp ;结果表明，对群体中个体的琼脂糖凝胶电泳检测结果与测序结果完全相符，其中1、3、7均为突变纯合子个体，4、6、9、10为野生型纯合子个体，5、8为杂合子个体。实施例2本发明克隆的分子标记在与鸭生长和屠宰性状关联分析中的应用在由樱桃谷鸭、荆江鸭和番鸭共393只个体组成的群体中进行了 GH基因内含子2 区BsmFI-RFLP与部分生长和屠宰性状的关联分析，所分析的性状包括0、2、4、6、8周龄重、 屠体重、全净膛重、胸肌重、腿肌重、腹脂重、皮脂重，并计算屠宰率、全净膛率、胸肌率、腿肌率、腹脂率、皮脂率等生长和屠宰性状。基因型检测结果表明，在检测的393个个体重，CC基因型较少，有97个个体，TT 和CT基因型占多数，分别为157和139。不同基因型间性状的分析结果见表1，分析结果表明，TT和CT基因型个体在4周龄体重、腹脂重、屠宰率上呈极显著差异(P < O. 01)，CC与 TT基因型在8周龄体重、腿肌重、瘦肉率、全净膛率和胸肌率几个性状上呈极显著差异(P < O. 01)。同时，TT与CT基因型在2周龄体重、6周龄体重、屠体重、胸肌重、全净膛重等性状上呈显著差异(P < O. 05)。上述分析说明该位点的多态性与上述性状间存在显著或极显著的关联。表IGH基因内含子2区多态与生长及屠宰性状的关联分析
权利要求
1.一种与鸭生长和屠宰性状相关的分子标记，它的核苷酸序列为SEQ ID N0:1。
2.根据权利要求I所述的与鸭生长和屠宰性状相关的分子标记，其特征在于SEQID NO 1所示序列的第170位碱基处有一个C170 - T170的碱基突变，导致^s /Y-RFLP酶切多态性。
3.扩增权利要求2所述分子标记的引物对，它的核苷酸序列为如下所示正向引物5’ - GTACAAAGAGTTCGTAAGTGTC - 3’反向引物:5’ - gggaatttcttttggtgtg - 3’。
4.一种根据权利要求I或2所述的分子标记的制备方法，包括如下步骤根据已克隆的鸭GH基因cDNA序列，与鸡GH基因基因组序列进行比对，划分外显子与内含子区域，然后根据划分的鸭GH基因外显子2和外显子3序列设计引物，进行鸭外显子2、3与内含子2序列的扩增；对扩增后所得目的片段进行回收测序、查找突变位点与相应的内切酶；然后对实验群体每个个体的DNA进行扩增与酶切鉴定；最后分析酶切多态位点与生长与屠宰性状之间的相关性，获得SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列。
5.权利要求I或2所述的分子标记在鸭标记辅助选择育种中的应用。
6.权利要求3所述的引物对在鸭标记辅助选择育种中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种作为鸭标记辅助选择应用的与鸭生长和屠宰性状相关的分子标记及其应用。所述的分子标记由GH基因内含子2克隆得到，它的DNA序列如序列表SEQIDNO1所述。在序列表SEQIDNO1的第170bp处有一个C170-T170的碱基替换，将该位点命名为C170T，该替换导致BsmFI-RFLP酶切多态性。本发明还公开了扩增GH基因部分DNA序列所用的引物以及用于多态性检测的方法，为肉鸭的标记辅助选择提供了一个新的分子标记。
文档编号C12N15/11GK102604939SQ201210046938
公开日2012年7月25日 申请日期2012年2月28日 优先权日2012年2月28日
发明者吴艳, 孙静, 杜金平, 梁振华, 潘爱銮, 申杰, 皮劲松, 蒲跃进, 陈志华 申请人:湖北省农业科学院畜牧兽医研究所