专利名称：黑青斑河鲀干扰素IFNγ2及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种黑青斑河飩II型干扰素IFNY2的编码基因、蛋白及其制备方法和应用。
背景技术：
细胞免疫因子Y干扰素(IFN Y)，作为干扰素系统中重要的II型IFN，是主要的巨噬细胞刺激因子和调控免疫反应的关键信号分子，能激活效应细胞，提高自然杀伤细胞 (NK)和巨噬细胞活性，促进免疫球蛋白的转换，具有抗肿瘤、抗病毒、调节和增强机体免疫功能等作用。干扰素IFNyI和IFNY2基因是鱼类IFNY基因的两个亚型，其氨基酸序列的特征是含有两个保守结构，包括氨基酸序列中的6个α-螺旋和在靠近其氨基酸序列C 端的F螺旋中均存在[IV]-Q-X-[KQ]-A-X2-E-[LF]-X2-[IV]这个保守结构，这与已研究过的其他区中的IFNy 二级结构类似。IFNY具有广泛的生物学活性。目前已知干扰素作为细胞因子的重要类型，是细胞和机体受到病毒感染或受核酸、细菌内毒素等诱导时，由受体细胞分泌的一种具有广谱抗病毒活性的糖蛋白，能诱导细胞进入抗病毒状态。IFNy是由Thl细胞产生的细胞因子。 它主要通过与其受体结合，活化JAK-STAT信号通路，激活下游基因的转录，包括相关转录因子和免疫分子，如STATl、IRFl、ICSBP和MHC II等，从而诱导巨噬细胞产生毒性物质消灭胞内细菌，诱导宿主内一些抗病毒蛋白的合成，调节T细胞的增殖和分化以及增强抗原提呈作用，达到保护宿主的目的。IFNy抗病毒机理主要是能提高细胞表面MHC类分子表达，有助于向细胞毒性T 细胞递呈抗原，引起靶细胞的溶解，此外还可以通过下游基因的转录及抗病毒效应基因表达而达到抗病毒作用。对于表达MHC I类抗原的细胞，IFN γ可以诱导I类抗原以更高的水平表达；对于无法检测到的I类抗原基本表达水平的细胞，IFNy也可以诱导I类抗原的表达，且一般比I型干扰素IFNa/β具有更强的作用。在体注射IFNY可以导致许多组织中I类抗原表达水平的广泛增高。IFNy对MHC II类分子表达的调节作用MHC II类分子仅存在于专职的抗原呈递细胞(如树突状细胞及B细胞)，其他细胞中MHC II类分子均可由IFNy 诱导产生。II类抗原呈递途径的所有关键基因的正常表达都是必需的，它们受一个单一的受IFNy诱导的转录因子II类反式激活蛋白(c II TA)的调节。IFNy能够激活吞噬细胞的杀菌活性。活化的巨噬细胞表现最突出的是对许多细胞内的和吞噬的生物体如分支杆菌、刚地弓形虫、锥虫和利什曼原虫的杀菌活性大大增强。与哺乳动物相似，鱼类IFN γ重组蛋白能够影响刺激免疫细胞的增殖，增加IFN γ 自身的基因表达，以及诱导下游免疫基因，如MHC II和Mx基因的表达。Mx是IFN系统中熟为人知的抗病毒蛋白，作为一种GTP酶，它主要通过干扰病毒的聚合酶来抑制RNA的复制， 从而发挥抗病毒的作用。它主要受I型IFN诱导大量表达发挥其作用，II型IFN对其有一定的诱导作用。重组的IFNy可影响鱼类的细胞免疫反应。初步研究的结果表明，一定浓度的重组虹鳟IFNy在RTS-Il cells中会促进下游免疫基因IPlO和MHC II β的表达。
近年来鱼类病害发生频繁，其中某些疾病给水产养殖业造成灾难性的危害，这就使得免疫防治技术在鱼病防治中呈现出日趋广阔的应用前景。IFNy由于其抗肿瘤、抗病毒、调节和增强机体免疫功能等作用在哺乳动物中的应用已非常广泛，对人的临床应用治疗疾病方面也已很普遍。而其在鱼类的研究与应用才开始起步，可以预测其具有广阔的应用前景。
发明内容
本发明的目的在于根据现有技术中鱼类免疫防治中没有IFNy的缺陷，提供一种黑青斑河飩干扰素IFN γ 2。本发明的另一目的是提供黑青斑河飩干扰素IFNY2的编码基因。本发明的又一目的是提供黑青斑河飩干扰素IFNY2的制备方法。本发明的再一目的是提供黑青斑河飩干扰素IFN γ 2的应用。、 本发明通过以下技术方案实现上述目的
一种黑青斑河飩干扰素IFN γ 2，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示，共188个氨基酸； 等电点为10. 131，分子量为21. 55千道尔顿。黑青斑河飩干扰素IFN γ 2氨基酸编码序列含有一段N段信号肽序列，使用Jpred方法预测其蛋白的二级结构，发现它含有6个α-螺旋结构，且在靠近其氨基酸序列C端的F螺旋中存在[IV]-Q-X-[KQ]-A-X2-E-[LF]-X2-[ IV]这个保守结构，这与其他已鉴定的IFNy —样。此外，对IFN γ 2进行糖基化位点的预测发现其含有一个糖基化位点。同时，通过对氨基酸序列的C末端进行分析，发现在黑青斑河飩IFN γ 2氨基酸序列的C末端具有类似核定位序列(NLS)的RRRR序列。上述黑青斑河飩干扰素IFN γ 2的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 2所示。上述黑青斑河飩干扰素IFNY2的编码基因的制备方法，其特征在于以黑青斑河飩总mRNA为模板，以RNA Oligo dT，其序列如SEQ ID NO: 3为引物，进行反转录，得到cDNA ； 再以cDNA为模板，设计上游引物SEQ ID N0:4，下游引物SEQ ID NO: 5，进行PCR，得到黑青斑河飩干扰素IFN γ 2的编码基因。黑青斑河飩干扰素IFN γ 2可以通过表达载体在大肠杆菌中以胞内可溶的形式表达，具体制备方法是将黑青斑河飩IFN γ 2的编码基因克隆至表达载体，得到重组表达质粒，转化大肠杆菌，培养转化的大肠杆菌，经诱导后收集菌体，纯化、酶切，得到黑青斑河飩干扰素IFN γ 2ο所述表达载体为大肠杆菌表达载体pET3h，重组表达质粒的构建包括以下步骤以含黑青斑河飩干扰素IFN γ 2编码基因的质粒为模板，设计含有ife H
I酶切位点的上游引物SEQ ID N0:6，含历idIII酶切位点的下游引物SEQ ID N0:7进行PCR，
PCR产物克隆到原核融合表达载体pET3h上，得到重组表达质粒，该质粒含有6 XHis亲和标记位点。该表达载体是以T7为启动子，获得的蛋白的C端有6XHis结构，便于利用固定化金属配体亲和层析进行纯化。所述培养转化的大肠杆菌的培养条件为接单菌落至含氨苄青霉素LB液体培养基中，37°C，250 rpm，振荡培养过夜，按1: 50体积比接种到37°C预热的含氨苄青霉素TB液体培养基中，37 °C，250 rpm，培养至0D600达到0. 6。大肠杆菌优选BL21 (DE3)。
所述诱导为加入IPTG至终浓度为0. 5mmol/L，经诱导后收集菌体。诱导时间优选为7小时，可以获得最大的可溶性重组蛋白表达量。所述纯化是将总菌体用Native Binding Buffer洗涤，再用Native Binding Buffer重悬，超声处理后，高速离心获得裂解上清液，经固定化金属配体亲和层析纯化，收集洗脱的蛋白。所述酶切是用rEK酶，上述步骤获得的重组蛋白N端含有Trx融合蛋白，根据融合蛋白上含有S-tag标签，可以结合到S-protein Agarose上，而目的蛋白IFN γ 2不结合，可被洗脱，在经过EKapture Agarose去除目的蛋白中的rEK酶，可得到单一的IFN γ 2重组目的蛋白。通过对培养时间、诱导时间和温度等条件的摸索和优化，使得到的融合蛋白的表达量较高，IFNY2大部分处于可溶状态；优化了重组蛋白的纯化条件后，表达产物的超声裂解液经固定化金属配体亲和层析，得到的蛋白纯度在90%以上。黑青斑河飩干扰素IFN γ 2在制备鱼类免疫调节添加剂或鱼类免疫佐剂中的应用。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果
本发明利用黑青斑河飩基因组数据库结合分子生物学方法设计了特异性引物，PCR扩增克隆得到IFN γ 2基因的ORF序列，并构建表达载体，转化到大肠杆菌中培养，可大量表达黑青斑河飩干扰素IFN γ 2基因所编码的蛋白。本发明黑青斑河飩干扰素IFN γ 2基因所编码的蛋白能够诱导河飩头肾细胞中的MX和ISG15基因的表达，丰富了鱼类干扰素系统信号通路的理论，并能有效促进疫苗产生的免疫佐剂，还可作为增强鱼类免疫的饵料添加剂。
图1.黑青斑河飩干扰素IFN γ 2氨基酸序列与部分脊椎动物IFN γ氨基酸序列的比较结果图，其中，在比较中采用空格以获得最大的同源性序列，“——”表示此位置无此
氨基酸；
图2.黑青斑河飩干扰素IFNY2成熟肽编码序列PCR扩增产物电泳结果，其中，M为 100 bp DNA Marker, NC为阴性对照，1为带有酶切位点的IFN γ 2核苷酸目的片段； 图3.基因IFN γ 2的重组表达质粒构建图4.在N端含有Trx融合蛋白的黑青斑河飩干扰素IFN γ 2重组蛋白表达和纯化的 SDS-PAGE (A)及Western杂交(B)分析图，其中，M为蛋白质分子量标准，1为未诱导总菌蛋白，2为诱导后总菌蛋白，3为经纯化脱盐后的蛋白样品；
图5.切除黑青斑河飩干扰素IFNY2重组蛋白上的Trx融合蛋白后的IFNY2的 SDS-PAGE分析图，M为蛋白质分子量标准，1为IFN γ 2，2为Trx融合蛋白；
图6.黑青斑河飩干扰素IFN γ 2对头肾免疫细胞中ISG15和MX基因表达的影响，A为 IFN γ 2对ISG15基因表达的影响，B为IFN γ 2对MX基因表达的影响，*表示与对照组有显著差异(Ρ<0. 05)。
具体实施例方式实施例1.黑青斑河飩干扰素IFN γ 2编码基因的制备1.黑青斑河飩头肾总RNA的提取
取健康黑青斑河飩(Tfeiraoi/o/ nigriviridis、八救物3 5cm，体重约4 6g，以20 300C循环过滤的水饲养，每天以赤虫喂食一次。驯养2周后取健康的鱼进行实验。以冰浴麻醉约2 min后，杀鱼取样，分离出肝、脾、肠、头肾、腮、心脏、皮肤及肌肉，存放于-80°C 冰箱备用。采用Trizol试剂法提取获得黑青斑河飩头肾总RNA，其OD26W = 1.85。2. cDNA第一链的合成
取5 μ g黑青斑河飩头肾总RNA样品进行DNA酶处理以去除基因组DNA的污染，与RNA Oligo dT (序列如SEQ ID NO:3所示)混合，进行反转录，所得产物置于-20°C保存备用。3.黑青斑河飩干扰素IFN γ 2基因cDNA全序列的克隆
根据^isembl及NCBI的Tetraodon nigriviridis基因组数据库中的数据，在 IFNy开放读码框两端设计特异引物，上游引物序列如SEQ ID NO:4，下游引物序列如SEQ ID NO: 5，以步骤2合成的第一链cDNA为模板，进行PCR扩增，扩增片段大小为567 bp。所得PCR产物上样至1. 8%琼脂糖凝胶，以低电压电泳分离DNA片段，从凝胶中纯化回收目的产物。将纯化后的目的产物连接至PTZ57 R/T载体转化DH5ci大肠杆菌，挑选阳性克隆测序。Blast同源分析表明，目的产物为干扰素IFN γ 2基因的cDNA序列片段。实施例2黑青斑河飩干扰素IFN γ 2的制备 1.重组表达质粒的构建
根据干扰素IFN γ 2重组蛋白编码基因的两端序列合成一对引物，上游引物含有ife H I切割位点，序列如SEQ ID NO:6所示，下游引物含有历·/ d III切割位点，其序列如SEQ ID NO:7所示。以含有干扰素IFN γ 2编码基因的pTZ57R/T质粒为模板，进行PCR扩增，得到特异扩增的单一条带，产物大小在570 bp左右，电泳结果如图2。将PCR扩增产物克隆至原核表达载体pET22b上，得到重组表达载体(其构建过程如图3所示)。表达载体中的外源基因序列经测序鉴定正确。2.黑青斑河飩干扰素IFN γ 2重组蛋白基因的表达
将步骤1中所构建的质粒转化大肠杆菌BL21 (DE3)。基因工程菌超声裂解上清经 SDS-PAGE电泳分析表明，工程菌在受IPTG诱导后与无IPTG诱导的总菌蛋白相比在约35 kDa的地方出现一条蛋白条带，与软件估算的含有Trx融合蛋白的IFN γ 2重组蛋白分子量大小相近(图4)。经rEK酶切除1Trx融合蛋白后，SDS-PAGE电泳分析表明，IFN γ 2重组目的蛋白约在18.0—25.0 kDa之间的地方出现一条蛋白条带，与软件估算的重组IFN γ 2蛋白分子量大小相近(图5)。对培养时间，诱导浓度，温度等条件的优化得出基因工程菌的最佳培养条件为接单菌落至5 ml的含氨苄青霉素LB加富液体培养基中，37°C，250 rpm，振荡培养过夜；按1 50体积比接种到200 ml 37°C预热的含氨苄青霉素TB液体培养基中，37°C，250 rpm，培养至0D600达到0. 6 ；在30°C，加入IPTG至终浓度0. 5mM,对IFN γ 2蛋白表达工程菌诱导7h， 可获得最大的可溶性重组蛋白表达量。3.重组黑青斑河飩干扰素IFN γ 2的纯化
将IFN γ 2蛋白表达工程菌总菌体用Native Binding Buffer洗涤，再用结合缓冲液重悬，超声处理后，高速离心获得裂解上清液，经固定化金属配体亲和层析纯化，收集洗脱的蛋白，SDS-PAGE分析重组蛋白的表达和层析的结果。从SDS-PAGE结果可以得出6 XHis-黑青斑河飩干扰素IFNY2重组蛋白基因编码的蛋白能被固定化镍金属亲和层析柱所吸附， 用洗脱缓冲液洗镍层析柱时，能把目的蛋白洗下(如图4中3)。IFNY2重组蛋白的洗脱峰经过G25凝胶柱更换缓冲液，去除所含咪唑。获得的IFN γ 2重组蛋白N端含有Trx融合蛋白，经rEK酶切除融合蛋白后，获得单一的IFNY2目的蛋白(图5中1)。实施例3.黑青斑河飩干扰素IFN γ 2对免疫相关基因表达影响的活性分析
用剪刀分离黑青斑河飩的头肾组织，用烘好的磨砂玻片磨砂面进行研磨，磨至末状; 将磨好的细胞与培养基一起过细胞滤网(BD Falcon, 70 μ m，Nylon)转移至50 ml离心管中；洗涤、离心后使用完全培养基(RPMI 1640含2 mM L-glutamine, 10% FBS和1% penicillin /streptomycin)2 ml重悬细胞，计数后将细胞数调整至1 X IO7 /mL，分别向 6孔培养板各孔中加入2 mL上述细胞悬浮液；分别向各分组孔中加入终浓度为1 ng/mL，10 ng/mL和100 ng/mLIFN γ 2重组蛋白的完全培养基2 mL，并设置阴性对照组(细胞悬浮液和完全培养基各2 mL)。将细胞培养板置于27°C，5% CO2培养箱中培养，孵育4 h后收集各孔细胞，Real Time-PCR检测重组蛋白对ISG15和MX基因表达的影响。其中ISG15基因表达所用引物上游引物序列如SEQ ID NO: 10，下游引物序列如SEQ ID NO: 11 ;MX基因表达所用引物上游引物序列如SEQ ID NO: 12，下游引物序列如SEQ ID N0:13。18s rRNA作为内参基因来调节各样品模板cDNA量，反映重组蛋白的活化能力及对下游基因表达的影响。18s rRNA基因的上游引物序列如SEQ ID N0:8，下游引物序列如SEQ ID N0:9。每组六个重复， 数据用平均值士标准误表示，*表示与对照组有显著差异(P<0. 05)，结果如图6所示。结果表明，在头肾细胞中，10 ng/ml的重组IFN γ 2孵育头肾细胞4小时后能显著上调ISG15 mRNA水平，而高浓度的重组蛋白则对ISG15转录本没有显著影响。对于I型IFN的标志性因子MX基因，与之前研究相似，与其他物种II型IFN同源性较高的IFN γ 2对该基因无显著性影响。
权利要求
1.一种黑青斑河飩干扰素IFN γ 2，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
2.权利要求1所述黑青斑河飩干扰素IFNY2的编码基因，其核苷酸序列如SEQID N0:2所示。
3.权利要求2所述黑青斑河飩干扰素IFNγ 2的编码基因的制备方法，其特征在于以黑青斑河飩总mRNA为模板，以RNA Oligo dT，其序列如SEQ ID NO:3为引物，进行反转录，得到cDNA ；再以cDNA为模板，设计上游引物SEQ ID N0:4，下游引物SEQ ID N0:5，进行PCR， 得到权利要求2所述黑青斑河飩干扰素IFN γ 2的编码基因。
4.权利要求1所述黑青斑河飩干扰素IFNγ 2的制备方法，是将黑青斑河飩干扰素 IFN γ 2的编码基因克隆至表达载体，得到重组表达质粒，转化大肠杆菌，培养转化的大肠杆菌，经诱导后收集菌体，纯化、酶切，得到黑青斑河飩干扰素IFN γ 2。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于所述表达载体为大肠杆菌表达载体 pET3h，重组表达质粒的构建包括以下步骤以含黑青斑河飩干扰素IFNY2编码基因的质粒为模板，设计上游引物SEQ ID N0:6，下游引物SEQ ID NO: 7进行PCR，PCR产物克隆到 pET32a上，得到重组表达质粒。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于所述培养转化的大肠杆菌的培养条件为含氨苄青霉素LB液体培养基，300C，250rpm振荡培养过夜，再接种到37°C预热的含氨苄青霉素TB液体培养基中，培养至0D600达到0. 6。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于所述诱导为加入IPTG至终浓度为 0. 5mmol/L，诱导时间为7小时。
8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于所述纯化是将总菌体用Native Binding Buffer洗涤，再用Native Binding Buffer重悬，超声处理后，高速离心获得裂解上清液，经固定化金属配体亲和层析纯化，收集洗脱的蛋白。
9.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于所述酶切是用rEK酶。
10.权利要求1所述黑青斑河飩干扰素IFNγ 2在制备鱼类免疫调节添加剂或鱼类免疫佐剂中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种黑青斑河鲀干扰素蛋白IFNγ2，其氨基酸序列如SEQIDNO:1所示，该蛋白的编码基因，核苷酸序列如SEQIDNO:2所示，编码基因的制备方法，是用序列用SEQIDNO:4和SEQIDNO:5序列为引物克隆得到干扰素蛋白IFNγ2的编码基因；同时还公开了干扰素蛋白IFNγ2的制备方法，是将黑青斑河鲀干扰素IFNγ2的编码基因克隆至表达载体，得到重组表达质粒，转化大肠杆菌，培养转化的大肠杆菌，经诱导后收集菌体，纯化、酶切，得到黑青斑河鲀干扰素IFNγ2。本发明的黑青斑河鲀干扰素IFNγ2可以用于制备鱼类免疫调节添加剂或免疫佐剂，具有诱导鱼类免疫基因表达的作用。
文档编号C12R1/19GK102180961SQ20111006444
公开日2011年9月14日 申请日期2011年3月17日 优先权日2011年3月17日
发明者卢丹琪, 张勇, 张旭, 林浩然, 汪婷, 贝锦新, 陈洁琳 申请人:中山大学