专利名称：免疫抑制剂微生物菌株的复合诱变的制作方法
技术领域：
本发明涉及微生物菌株的诱变技术，具体涉及吸水链霉菌、筑波链霉菌、茄病铼刀菌和短密青霉菌四个菌株的选育诱变技术。
背景技术：
免疫抑制剂是可以抑制免疫反应的药物，选择性免疫抑制剂对淋巴细胞有专ー性，而对红细胞生成几乎没有影响或毒性极低，不损害宿主对细菌和真菌的感染防御机制。目前已广泛用于器官移植抗排斥反应和自身免疫性疾病的治疗。国外对免疫抑制剂的研究由来已久，自1954年人类第一例同卵双生子间肾脏移植手术取得成功后，医学家在器官移 植方面的研究也取得了许多重大突破，近年来，国内外学者也正积极致力于新的免疫抑制剂的研究开发。发现了大批具有免疫抑制活性的微生物产物。微生物来源的免疫抑制剂是目前研究的热点，包括环孢菌素A、吗替麦考酚酯、他克莫司和雷帕霉素等新型免疫抑制剂。环孢菌素A(Cycl0Sp0rinA，CsA)，真菌茄病铼刀菌培养液中分离出来的ー种含11个氨基酸的环形多肽。特异性对T细胞(主要是Th细胞)有较好的选择性抑制作用，对其他的免疫细胞的抑制作用较弱，临床用于抗器官移植排斥和自身免疫病的治疗。吗替麦考酚酯(MycopHenolate Mofetil, MMF)是麦考酚酸(又名霉酚酸酷)的2-こ基酯类衍生物，从短密青霉中分离提取。在体内脱酯化后形成具有免疫抑制活性的代谢产物M P A，后者通过抑制鸟嘌呤的合成，选择性阻断T和B淋巴细胞的増殖，对移植排异和自身免疫性疾病均有显著疗效。临床上用于器官移植和自身免疫性疾病，且副作用少，显示了良好的应用前景。他克莫司(Tacrolimus, FK-506)是Kino等从日本筑波山近郊土壤中分离出的筑波链霉菌产生的大环内酯类代谢产物，临床用于预防各种器官移植所出现的排斥反应，其药物疗效是环胞霉素A的10-100倍。雷帕霉素(西罗莫司，Rapamycin, RPM), Ayerster实验室于1975年在太平洋的Ester岛上发现的ー种吸水链霉菌NRRL5491(ATCC 29253)所产生的ー种亲脂性三烯含氮大环内酯类抗真菌抗生素，为35元环内酯化合物。对外周血单核细胞的有效抗増殖作用比环孢素A强50 500倍，肾毒性比环孢素和他克罗司低。1999年应用于临床，是ー种疗效好、低毒、无肾毒性的新型免疫抑制剂。这些新型免疫抑制剂可以通过大规模エ业发酵的方法获得，能有效地降低药物成本，提高药物制剂的安全性，对促进器官移植的发展，提高患者的生命质量具有重要的意义。良好的菌种是微生物发酵エ业的基础。从自然界直接分离的菌种，一般而言其发酵活力往往是比较低的，不能达到エ业生产的要求。因此，需要根据菌种的形态、生理特点来改变菌种。以微生物菌株的自然变异为基础的生产选种的几率并不高，因为这种变异率太小，仅为10_6 10_1(1。为加大其变异率，通常采用物理和化学因素促进其诱变，这种诱发突变为基础的育种就是诱变育种，他是国内外提高菌种产量、性能的主要手段。诱变育种是利用物理化学诱变剂处理均匀而分散的微生物细胞群，促进其突变率显著提高，而后采用快速和高效的筛选方法，从中挑选少数符号育种目的的突变株。微生物常用的诱变方法主要为化学、物理以及复合诱变，其中化学诱变剂主要是烷化剂(如NTG(亚硝基呱)、EMS(甲基磺酸こ酯)、NMU(亚硝基甲基腮)、DES(硫酸ニこ酷)、氮芥和环氧こ烷等)、简介类似物和吖啶类化合物；物理诱变物理诱变剂主要有紫外线，X-射线，Y-射线，快中子，激光，微波，离子束等。复合诱变包括两种或多种诱变剂的先后使用，同一种诱变剂的重复作用和两种或多种诱变剂的同时使用。复合诱变具有协同效应.如果两种或两种以上诱变剂合理搭配使用复合诱变较单ー诱变效果好。本发明采用复合诱变技术分别对吸水链霉菌、筑波链霉菌、茄病铼刀菌和短密青霉菌四个菌株进行诱变育种，诱变育种后的菌株可使环孢菌素A、吗替麦考酚酯、他克莫司和雷帕霉素的产量分别提高35 60%。
发明内容
本发明是通过复合诱变的技术方法，分别对吸水链霉菌、筑波链霉菌、茄病铼刀菌和短密青霉菌四个菌株进行诱变育种，使得诱变育种后的菌株可使环孢菌素A、吗替麦考酚酷、他克莫司和雷帕霉素的产量分别提高35 60%。本发明中吸水链霉菌和筑波链霉菌的复合诱变方法是紫外线诱变、NTG诱变和离子注入复合诱变组合。DNA和RNA的嘌呤和嘧啶有很强的紫外光吸收能力，最大的吸收峰在260nm，因此波长260nm的紫外辐射是最有效的诱变剂。紫外线的作用是使DNA分子形成嘧啶ニ聚体，即两个相邻的嘧啶共价连接，ニ聚体出现会减弱双键间氢键的作用，并引起双链结构扭曲变形，阻碍碱基间的正常配对，从而有可能引起突变或死亡。另外ニ聚体的形成，会妨碍双链的解开，因而影响DNA的复制和转录。总之紫外辐射可以引起碱基转换、颠换、移码突变或缺失等。NTG诱发的突变主要是GC-AT转换，另外还有小范围切除、移码突变及GC对的缺失.在自然条件下NTG容易分解，而在酸性(PH5. 5)条件下会产生HN02。虽然HN02本身就是诱变剂，但在NTG有活性时(PH6 9)，它却无诱变效果。在碱性条件下，NTG会形成重氮甲烷(CH2N2)，它是引起致死和突变的主要原因。它的效应很可能是CH2N2对DNA的烷化作用引起的。离子注入诱变技术是ー种集理化诱变因子于一体的综合方法。离子注入诱变和其它常规的辐射诱变有明显的差异，它包括能量沉积、动量传递、离子注入及电荷交换四种作用机制，能够引起染色体的畸变，导致DNA链碱基的损伤、断裂，从而使遗传物质在基因水平或分子水平上发生改变或缺失，提高变异的频率。本发明中对吸水链霉菌和筑波链霉菌的复合诱变方法为首先对吸水链霉菌和筑波链霉菌进行紫外线诱变，取制备好的菌悬液5mL移入直径为90mm的无菌培养皿中,放入无菌磁力搅拌棒，置于磁力搅拌器上，功率15W,波长260nm紫外灯下30cm处打开皿盖边搅拌边照射，剂量分别为10、15、20、25、30min。收集菌悬液。再对该菌株进行亚硝基胍(NTG)诱变，具体方法为用O. lmol/L, pH6. O的磷酸盐缓冲液制备孢子悬液，使浓度为IO8个/mL，分别用1、2、3和4mg/mL浓度的NTG处理紫外诱变后的突变株单孢子悬液，于28°C震荡30min，用生理盐水离心洗涤孢子3次，收集菌悬液。再对该菌株进行离子注入诱变，具体方法为用能量为10、15、20、25kev，剂量分别为O. 5、1、1.5、
2(IO1Vcm2)的N+注入菌体内，每次脉冲时间分别为5、10、15、20s，间隔时间为55s。收集菌悬液。然后对突变体筛选，最终获得高产突变株。本发明还提供了采用NTG诱变、离子注入诱变及加压诱变复合诱变技术对茄病铼刀菌和短密青霉菌进行复合诱变育种。其中的加压诱变采用的是平阳霉素(Pinyangmycin，PYM)，PYM是ー种抗生素，属于博莱霉素的ー类，具有高度选择性，能抑制细胞的生长。作为一种新的诱变剂，平阳霉素能直接作用于DNA，高浓度时可使DNA链断开，低浓度时能抑制连接酶，阻止胸腺嘧啶核苷酸聚合入DNA，故抑制DNA的修复合成，PYM在许多实验中均被证明具有安全、高效、诱变频率高、范围大等特点。
本发明中对茄病铼刀菌和短密青霉菌的复合诱变方法为首先对茄病铼刀菌和短密青霉菌进行亚硝基胍(NTG)诱变，具体方法为，用
O.lmol/L, pH6. O的磷酸盐缓冲液制备孢子悬液，使浓度为IO8个/mL，分别用O. 5、1、1. 5、2、3和4mg/mL浓度的NTG处理悬液，于28°C震荡30min，用生理盐水离心洗涤孢子3次，收集菌悬液。再对该菌株进行离子注入诱变，具体方法为，用能量为5、10、15、20、25kev，剂量分别为O. 5、I、1. 5、2 (IO1Vcm2)的N+注入菌体内，每次脉冲时间分别为5、IO、15、20 s，间隔时间为55s。收集菌悬液。然后再对该菌株进行平阳霉素诱变，具体方法为，用5、10、15、20、和25μ g/ml的平阳霉素处理经NTG和离子注入诱变后获得的高产突变菌株，然后对突变体 筛选，最终获得高产突变株。本发明采用上述方法对吸水链霉菌、筑波链霉菌、茄病铼刀菌和短密青霉菌进行复合诱变后，雷帕霉素产量由324mg/L提高到519mg/L，提高60. 1% ;他克莫司产量由385mg/L提闻到531mg/L,提闻37. 9 % ;环抱囷素A广量由8. 5g/L提闻到12. 8g/L,提闻50.5% ;霉酚酸产量由7. 9g/L提高到11.4g/L，提高44.3%。
图I为雷帕霉素的HPLC分析图谱。图2为他克莫司的HPLC分析图谱。图3为环孢菌素A的HPLC分析图谱。图4为霉酚酸的HPLC分析图谱。
具体实施例方式实例I、吸水链霉菌的复合诱变吸水链霉菌的培养将吸水链霉菌接入摇瓶培养基(摇瓶培养基组成(g/L):可溶性淀粉10，蛋白胨6，酵母浸粉2，磷酸ニ氢钾1，甘油2，调pH至7. O)中，250ml摇瓶装培养液55ml，28度，200rpm，培养2天。吸水链霉菌的紫外线诱变取上述培养的吸水链霉菌悬液5mL移入直径为90mm的无菌培养皿中，放入无菌磁カ搅拌棒，置于磁力搅拌器上，功率15W，波长260nm紫外灯下30cm处打开皿盖边搅拌边照射，剂量分别为10、15、20、25、30min。收集菌悬液。吸水链霉菌的亚硝基胍(NTG)诱变用O. lmol/L, pH6. O的磷酸盐缓冲液制备孢子悬液，使浓度为108个/mL，分别用I、2、3和4mg/mL浓度的NTG处理紫外诱变后的突变株单孢子悬液，于28°C震荡30min，用生理盐水离心洗涤孢子3次，收集菌悬液。吸水链霉菌的离子注入诱变用能量为10、15、20、251 ^，剂量分别为0.5、1、1.5、2(1017/0112)的 N+注入菌体内，每次脉冲时间分别为5、10、15、20s，间隔时间为55s。收集菌悬液。突变体筛选方法 将培养基20mL倒入培养皿中，凝固后将经过UV、NTG和离子注入复合诱变的孢子液均匀涂布在筛选平板上，在28°C条件下培养7天，筛选菌落形态变化较大的突变株进行摇瓶测试(发酵培养基(g/L):葡萄糖40，豆柏粉50，蛋白胨10，磷酸ニ氢钾2，磷酸氢ニ钾2，レ蛋氨酸2，0 104 1.0。调 pH 至 7. O。250ml 摇瓶装液 55ml，接种量 10%，28 度，220rpm，6天)，通过对培养基中雷帕霉素的HPLC(图I)分析(取适量培养液上清，用こ酸こ酯萃取，离心后取上清200微升，抽干后，加入200微升こ腈，进样，C18反应柱，lml/min, 270nm, 55度)，筛选高产菌株。结果显示，采用上述方法对吸水链霉菌进行复合诱变后，雷帕霉素产量由未诱变的 324mg/L 提闻到 519mg/L,提闻 60. I % 0实例2、筑波链霉菌的复合诱变筑波链霉菌的培养刮取种子平板上适量孢子接种摇瓶培养基(摇瓶培养基组成糊精1.5%，玉米浆 I. 5%，甘油 O. 5%，无水葡萄糖 I. 0%，(NH4)2SO4 O. 3%, CaCO3 O. 2%, pH7. O)中，28°C，200rpm振荡培养3天。筑波链霉菌的紫外线诱变取上述培养的筑波链霉菌悬液5mL移入直径为90mm的无菌培养皿中，放入无菌磁カ搅拌棒，置于磁力搅拌器上，功率15W，波长260nm紫外灯下30cm处打开皿盖边搅拌边照射，剂量分别为10、15、20、25、30min。收集菌悬液。筑波链霉菌的亚硝基胍(NTG)诱变用O. lmol/L, pH6. O的磷酸盐缓冲液制备孢子悬液，使浓度为108个/mL，分别用I、2、3和4mg/mL浓度的NTG处理紫外诱变后的突变株单孢子悬液，于28°C震荡30min，用生理盐水离心洗涤孢子3次，收集菌悬液。筑波链霉菌的离子注入诱变用能量为10、15、20、251 ^，剂量分别为0.5、1、1.5、2(1017/0112)的 N+注入菌体内，每次脉冲时间分别为5、10、15、20s，间隔时间为55s。收集菌悬液。突变体筛选方法将摇瓶培养基20mL倒入培养皿中，凝固后将经过UV、NTG和离子注入复合诱变的孢子液均匀涂布在筛选平板上，在28°C条件下培养7天，筛选菌落形态变化较大的突变株进行摇瓶测试(发酵培养基组成糊精4. O %，酵母粉2.0%，K2HPO4 O. 1%, CaCO3 O. I %，哌啶ニ甲酸 O. 1%，L-Leu O. 3%，消泡剂 O. 1%，Mg3(PO4)2 O. 6%, pH6. 8 接种量 1%，25°C，220rpm振荡培养7-9天)，通过对培养基中他克莫司的HPLC (图2)分析(取发酵液400微升，加入甲醇800微升，混匀后室温放置I小时，期间振荡均匀几次，IOOOOrpm离心10分钟后取上清进样20微升。C18柱，柱温60度，流动相0. I %磷酸水溶液こ腈=35 70，
I.Oml/min等度流速)，筛选高产菌株。结果显示，采用上述方法对筑波链霉菌进行复合诱变后，他克莫司产量由未诱变的 385mg/L 提高到 531mg/L，提高 37. 9% 实例3、茄病铼刀菌的复合诱变茄病铼刀菌的培养将茄病铼刀菌接入摇瓶培养基(摇瓶培养基组成(g/L):葡萄糖10，果糖10，玉米浆8，豆粉8，ρΗ5·6)中，摇瓶装液量为100ml/500ml摇瓶，26°C、250rpm、培养55h左右。 茄病铼刀菌的NTG诱变用O. lmol/L, pH6. O的磷酸盐缓冲液制备孢子悬液，使浓度为IO8个/mL，分别用O. 5、I、I. 5、2、3和4mg/mL浓度的NTG处理悬液，于28°C震荡30min，用生理盐水离心洗涤孢子3次，收集菌悬液。茄病铼刀菌的离子注入诱变用能量为5、10、15、20、25kev,剂量分别为 O. 5、I、I. 5、2 (IO1Vcm2)的 N+ 注入菌体内，每次脉冲时间分别为5、10、15、20s，间隔时间为55s。收集菌悬液。茄病铼刀菌的平阳
霉素诱变用5、10、15、20、和25 μ g/ml的平阳霉素处理经NTG和离子注入诱变后菌株悬液10小吋。收集菌悬液。突变体筛选方法将摇瓶培养基20mL倒入培养皿中，凝固后将经过NTG、离子注入和平阳霉素复合诱变的孢子液均匀涂布在筛选平板上，在28°C条件下培养7天，筛选菌落形态变化较大的突变株进行摇瓶测试(发酵培养基组成(g/L):果糖50，L-Valine 25，(NH4)2HP0430,MgSO4. 7H200. 5, ZnSO4. 7H20 O. 1，NaNO3 3，KH2PO4, 2，接种量为 10%，ρΗ5· 9，26°C、250rpm，培养11天)，通过对培养基中环孢菌素A的HPLC(图3)分析(取发酵液5g左右，加入丙酮IOml,室温下,在摇床上摇30min, 250rpm,用丙酮定容至50ml,摇勻，然后用滤纸过滤,所得滤液即为待测样品溶液。液相条件流动相こ腈水磷酸=700 300 0.1，检测波长215nm，色谱柱SB-C18，柱温70°C，进样量20. Oul，流速I. Oml/min)，筛选高产菌株。结果显示，采用上述方法对茄病铼刀菌进行复合诱变后，环孢菌素A产量由未诱变的8. 5g/L提闻到12. 8g/L,提闻50. 5% 实例4、短密青霉菌的复合诱变短密青霉菌的培养将短密青霉菌接入摇瓶培养基(摇瓶培养基组成(g/L):葡萄糖60，蛋白胨30，酵母浸粉10，磷酸ニ氢钾6，七水硫酸镁2，调pH至6. O)中，250ml摇瓶装液50ml，25°C，230rpm，培养3天。短密青霉菌的NTG诱变用O. lmol/L, pH6. O的磷酸盐缓冲液制备孢子悬液，使浓度为IO8个/mL，分别用
O.5、I、I. 5、2、3和4mg/mL浓度的NTG处理悬液，于28°C震荡30min，用生理盐水离心洗涤孢子3次，收集菌悬液。短密青霉菌的离子注入诱变用能量为5、10、15、20、25kev,剂量分别为 O. 5、I、I. 5、2 (1017/cm2)的 N+ 注入菌体内，每次脉冲时间分别为5、10、15、20s，间隔时间为55s。收集菌悬液。短密青霉菌的平阳霉素诱变用5、10、15、20、和25 μ g/ml的平阳霉素处理经NTG和离子注入诱变后菌株悬液10小吋。收集菌悬液。突变体筛选方法
将摇瓶培养基20mL倒入培养皿中，凝固后将经过NTG、离子注入和平阳霉素复合诱变的孢子液均匀涂布在筛选平板上，在28°C条件下培养7天，筛选菌落形态变化较大的突变株进行摇瓶测试(发酵培养基组成(g/L):葡萄糖120，豆柏粉10，甘氨酸10，磷酸ニ氢钾6，七水硫酸镁2，七水硫酸亚铁O. 2，调pH至6. 0，250ml摇瓶装液50ml，27°C，280rpm, 7天)，通过对培养基中霉酚酸的HPLC (图4)分析(取IOml混匀的发酵液，加入IOml纯水稀释，用浓氢氧化钠溶液调PH至11，搅拌30min，抽滤。滤液用浓盐酸调pH至2. O,混匀。取Iml滤液，加入15mlこ酸异戊酯，震荡5min，静置。取萃取液进行液相色谱分析。液相条件流动相こ腈水磷酸=520 480 1，调ρΗ3· 0，检测波长304nm，色谱柱SB-C18， 柱温40°C，进样量10. Oul，流速I. Oml/min)，筛选高产菌株。结果显示，采用上述方法对短密青霉菌进行复合诱变后，霉酚酸产量由未诱变的7. 9g/L 提闻到 11. 4g/L,提闻 44. 3%
权利要求
1.本专利涉及四种免疫抑制剂微生物菌株复合诱变的方法，从而使复合诱变后的菌株的产量提高35%以上。
2.权利要求I中四种免疫抑制剂微生物菌株主要指吸水链霉菌、筑波链霉菌、茄病铼刀菌和短密青霉菌。
3.权利要求I中复合诱变方法主要指化学和物理诱变的组合诱变。
4.权利要求3中的化学诱变主要指NTG(亚硝基呱)、EMS(甲基磺酸こ酯)和环氧こ烧的诱变。
5.权利要求3中的物理诱变主要指紫外线(UV)诱变和离子注入诱变。
6.吸水链霉菌和筑波链霉菌的复合诱变方法是紫外线诱变、NTG诱变和离子注入复合诱变组合。
7.茄病铼刀菌和短密青霉菌复合诱变方法是NTG诱变、离子注入诱变及加压(平阳霉素)诱变组合。
全文摘要
本发明涉及免疫抑制剂微生物菌株包括吸水链霉菌、筑波链霉菌、茄病镰刀菌和短密青霉菌的物理和化学复合诱变的方法及筛选，采用本发明的复合诱变及加压诱变可使其产量分别提高35～60％。
文档编号C12R1/55GK102676495SQ20111006379
公开日2012年9月19日 申请日期2011年3月17日 优先权日2011年3月17日
发明者张益 , 范开, 薛国希, 马鲁南 申请人:重庆富进生物医药有限公司