专利名称：一种木质纤维素类生物质高效酶水解的方法
技术领域：
本发明属于生物化学及化工领域的木质纤维素水解技术，具体涉及一种木质纤维素类生物质高效酶水解的方法。
背景技术：
随着社会的高度发展，化石燃料的消耗越来越大，由于化石燃料的不可再生性，寻找替代能源成为人们关注的焦点。燃料乙醇由于具有高的辛烷值、清洁及低(X)2排放而倍受青睐。制备乙醇的传统原料来自于玉米、小麦、甘蔗等粮食和糖类作物，生产技术成熟，但存在“与人争粮、与农争地”的问题。利用玉米秸秆、玉米芯、水稻秆等各种作物秸秆、木屑、 树枝等农林废弃物等木质纤维素类生物质制备纤维素乙醇，被称作“第二代燃料乙醇”，其在提高农林废弃物的附加值、降低环境污染，推动农村经济发展等方面有重要意义。纤维素乙醇制备的主流技术包括预处理、酶水解和发酵。这是因为木质纤维素类生物质主要由纤维素、半纤维素和木质素三大组分组成，各组分之间通过化学键连接形成致密的结构，其中纤维素和半纤维素是糖基高分子聚合物，将其通过预处理和纤维素酶水解，获得半纤维素和纤维素中的糖类产物，即可将其发酵制取乙醇。高效获取木质纤维素类生物质中的糖类产物，是纤维乙醇工艺中最关键的技术难点。糖类产物的获取主要来自预处理和酶水解。预处理的目的是降低木质素和半纤维素的含量，降低纤维素的结晶度，增加纤维素酶对预处理后纤维素原料的可及性，同时获得半纤维素中的糖；酶水解是以纤维素酶将预处理后的纤维素原料水解成葡萄糖。目前预处理技术存在的最主要问题是化学法工艺(酸、碱及有机溶剂等)过程往往存在污染，生物法预处理(利用白腐菌等降解木质素)效率低下，导致预处理成本高；酶水解中用到的纤维素酶成本较高，生成的糖类产物浓度较低，导致酶水解效率较低。与其他预处理方式相比，高温液态水处理属物理方法，被誉为绿色预处理工艺，其处理过程中除了水以外无需添加化学试剂，降低了对环境的污染，产生较少量的发酵抑制物，几乎不会对发酵产生负面影响，能将大部分的半纤维素转化为糖类产物，能去除部分木质素，促进了纤维素原料的酶的可及性。但该预处理方法不能大量去除木质素，导致高浓度的预处理物料酶解效率低，产糖浓度不高。以高浓度的原料进行酶水解，对提高产出的糖类产物浓度是非常有效的方法，但当预处理后的木质纤维素固体原料浓度较高时，必然带来黏度大，混合不均勻的问题，也会抑制酶水解的顺利进行。通过中华人民共和国国家知识产权局网站进行专利查询，目前国内有关木质纤维素类生物质经预处理后再酶解的相关专利如下(1)、一种高效预处理木质纤维素的工艺，公开(公告)号CN101736631A ；(2)、将纤维素材料转化成乙醇的方法和设备，公开(公告)号CN101268121A ；(3)、一种生物质绿色高效预处理方法，公开(公告)号CN101586136 ；(4)、一种甘蔗渣高效糖化的方法，公开(公告)号CN101619332A ；
(5)、一种高效水解木质纤维素类生物质同时制备多组分糖液及木质素的方法，公开(公告)号:CN101285106A ；(6)、一种使草浆类纤维素高效糖化的方法，公开(公告)号CN101613728A ；专利(1) ( 是有关高温液态水预处理木质纤维素再水解的专利。专利(1)对木质纤维素采取了两步预处理，高温液态水是其中的第一步，第二步是稀酸处理，这有别于本发明对木质纤维素的预处理。专利( 虽然也采取了高温液态水预处理，但对预处理后的木质纤维素的处理方式与本发明有着本质的区别。专利( 与本发明有着一定的相关性，但其侧重点在于提出一种新的预处理工艺，即两步分段变温高温液态水水解工艺，没有涉及后续的酶水解。专利(4) (6)采用的预处理方法是碱处理或酸处理，这与本发明有着本质的区别。当然，有关酶水解木质纤维素的相关专利不止这些。由于它们采取的预处理方法和酶水解方法与本发明存在本质上的区别，因此不一一罗列。
发明内容
本发明的目的是提供一种简单、环保、酶水解处理原料浓度高、产糖浓度高和水解效率高的木质纤维素类生物质高效酶水解的方法。本发明采用高温液态水预处理方法对木质纤维素类生物质进行预处理后，获得木质纤维素原料，以一定浓度分散于乙酸-乙酸钠缓冲液中，再加入一定比例的非离子表面活性剂和纤维素酶，采取搅拌的物料混合方式水解一段时间后，再分二次向反应体系中加入一定量的物料，同时按一定比例加入非离子表面活性剂和纤维素酶继续水解，获得主要来自于纤维素的糖类化合物和木质纤维素残渣，从而实现在提高酶解原料浓度同时，产出高浓度糖，提高酶解效率的目的。本发明的木质纤维素类生物质高效酶水解的方法，其特征在于，包括以下步骤在pH4. 5 4. 8，温度为45 55°C的条件下，起初以质量体积分数为10% 15% g/mL的比率，将木质纤维素类生物质经高温液态水预处理后获得的木质纤维素原料，添加至0. 05 0. IM乙酸-乙酸钠的缓冲溶液中，按10 20FPU/g纤维素的量加入纤维素酶， 按0. 075 0. 2mL/g木质纤维素原料的比率加入非离子表面活性剂，水解12 M小时后， 再按起始加入量的一半加入木质纤维素原料，同时按10 20FPU/g纤维素的量加入纤维素酶，按0. 075 0. 2mL/g木质纤维素原料的比率加入非离子表面活性剂，水解36 48小时后，再加入木质纤维素原料，使三次加入的木质纤维素原料的总计质量体积分数为20% 30% g/ml,同时按10 20FPU/g纤维素的量加入纤维素酶，按0. 075 0. 2mL/g木质纤维素原料的比率加入非离子表面活性剂，继续水解到108 120小时，整个水解过程以搅拌的方式混勻物料。所述的木质纤维素类生物质高效酶水解的方法，优选步骤为在PH4.8，温度为 50°C的条件下，起初以质量体积分数为10% g/mL的比率，将木质纤维素类生物质经高温液态水预处理后获得的木质纤维素原料，添加至0. 05M乙酸-乙酸钠的缓冲溶液中，按20FPU/ g纤维素的量加入纤维素酶，按0. 075mL/g木质纤维素原料的比率加入Tween 80，水解M 小时后，再按起始加入量的一半加入木质纤维素原料，按20FPU/g纤维素的量加入纤维素酶，按0.075mL/g木质纤维素原料的比率加入Tween 80，水解48小时后，再加入木质纤维素原料，使三次加入的木质纤维素原料的总计质量体积分数为20% g/ml，按20FPU/g纤维素的量加入纤维素酶，按0. 075mL/g木质纤维素原料的比率加入Tween 80，继续水解到120 小时，整个水解过程以搅拌的方式混勻物料。所述的将木质纤维素类生物质经高温液态水预处理后获得的木质纤维素原料，优选步骤为将木质纤维素类生物质粉碎至40 60目，按物料干基固液比为1 10 20g/ mL的比率，加水到反应系统中，反应条件为2 4MPa，170 190°C，300 500rpm，15 30min，处理结束后，固液分离，将预处理残渣用水洗净，获得木质纤维素原料。所述的木质纤维素类生物质优选包括甜高粱秆渣、甘蔗渣、玉米秸秆、玉米芯、稻草杆和木屑等农林废弃物和速生能源林等主要成分为半纤维素、纤维素和木质素的木质纤维素类生物质。所述的非离子表面活性剂优选为Tween 80。Tween 80不会对环境造成污染，且对微生物无害。搅拌方式可为磁力搅拌或机械搅拌。以搅拌的方式可以更好的混勻物料，增加酶和底物的反应机率，从而提高酶解效率。本发明的有益效果如下高温液态水预处理具有价廉、环保、易于操作等优点，无需对预处理后的残渣进行脱毒处理，简化工艺，节约成本。酶水解过程中加入的非离子表面活性剂，可显著提高物料酶解效率，这是因为非离子表面活性剂可通过疏水作用与木质素结合，屏蔽木质素上的纤维素酶结合位点，降低木质素对纤维素酶的无效吸附，增加游离酶的量，从而促进纤维素酶水解反应进程，提高酶解效率，而且有利于降低酶的用量，从而降低酶解反应成本。酶水解过程中，采取分3个批次，每次添加一定量的木质纤维素原料，加入一定量的纤维素酶和非离子表面活性剂，水解一定的时间，优化酶解条件，从而有效的降低了酶解物料的粘度，提高了产糖率，从而提高了水解效率。本发明将高温液态水预处理和特定条件下的分批酶水解工艺耦合，水解效率高， 并且极大的提高了酶水解处理的木质纤维素原料浓度，浓度可达30% g/ml (质量体积分数)，在高浓度的木质纤维素原料的情况下，经过本发明的工艺，其产糖浓度高，水解效率也高，从而成功的解决了在高浓度的木质纤维素原料所引起的粘度大，混合不均勻，抑制酶水解的顺利进行，而造成产糖浓度低，水解效率低的难题，实现在提高酶解原料浓度同时，产出高浓度糖，提高酶解效率的目的，从而实现了木质纤维素类生物质的高效酶水解。
图1是本发明的工艺流程图。
具体实施例方式以下实施例是对本发明的进一步阐述，而不是对本发明的限制。如图1所示，将木质纤维素类生物质除去粉尘和砂石等杂质，粉碎至40 60目， 按物料干基固液比为1 10 20g/mL的比率，加入去离子水到反应系统中，反应条件为 2 4MPa，170 190°C，300 500rpm，15 30min，处理完后，固液分离，获得半纤维素水解液和预处理残渣，将预处理残渣用水洗涤干净，目的是去掉少量的糠醛、乙酸等影响酶解和发酵的抑制物，获得酶水解的原料-木质纤维素原料。将此原料按以下操作加入到酶水解罐中，在pH4. 5 4. 8，温度为45 55°C的条件下，起初以质量体积分数为10% 15% g/mL的比率，将木质纤维素原料，添加至0. 05 0. IM乙酸-乙酸钠的缓冲溶液中，按10 20FPU/g纤维素即葡聚糖的量加入纤维素酶，按0. 075 0. 2mL/g木质纤维素原料的比率加入非离子表面活性剂，以10 200rpm的搅拌速度水解12 M小时后，再按起始加入量的一半加入木质纤维素原料至酶解罐中，同时按10 20FPU/g纤维素的量加入纤维素酶， 按0. 075 0. 2mL/g木质纤维素原料的比率加入非离子表面活性剂，同样的反应条件下，水解36 48小时后，再加入木质纤维素原料，使三次加入的木质纤维素原料的总计质量体积分数为20% 30% g/mL,按10 20FPU/g纤维素的量加入纤维素酶，按0. 075 0. 2mL/ g木质纤维素原料的比率加入非离子表面活性剂，在相同的反应条件下，继续水解到108 120小时，整个水解过程以搅拌的方式混勻物料，酶解结束后，固液分离，获得主要来自于纤维素的糖类产物和木质素残渣。对比例1取粉碎至60目的榨汁后无糖的甜高粱秆渣2g，加入IOmL 0. 05M乙酸-乙酸钠缓冲液(pH4.8)中，以20FPU/g葡聚糖的比率加入纤维素酶，在50°C下进行振荡水解120h，用 DNS法测定总还原糖浓度，得到总还原糖浓度为15. :3mg/mL，总糖回收率为13.7%。实施例1把榨汁后无糖的甜高粱秆渣粉碎到40目，按固液比1 10g/mL的比率，加入到高温液态水反应釜中，在2Mpa、170°C、300rpm的高温液态水环境下，处理15min，完成预处理，固液分离，获得半纤维素水解产物和预处理后的甜高粱秆渣底物。用清水洗净，除去酶水解及发酵抑制物，作为酶水解原料。取Ig甜高粱秆渣底物作为酶水解原料，加入IOmL 0. 05M乙酸-乙酸钠缓冲液(pH4.幻中，以10FPU/g纤维素即葡聚糖的比率加入纤维素酶， 同时加入0. 075mL Tween80，在45°C下搅拌水解12小时后，再加入0. 5g甜高粱秆渣底物， 以10FPU/g葡聚糖的比率加入纤维素酶，同时加入0. 0375mL Tween80，搅拌水解3 后，再加入0. 5g预处理后的甜高粱秆渣底物，以10FPU/g葡聚糖的比率加入纤维素酶，同时加入 0. 0375mLTween80，水解至108h，用DNS法测定总还原糖浓度，得到总还原糖浓度为52. Img/ mL，总糖回收率为30.4%。实施例2把榨汁后的甜高粱秆渣粉碎到60目，按固液比1 20g/mL加入到高温液态水反应釜中，在4Mpa、190°C、500rpm的高温液态水环境下，处理30min，完成预处理，固液分离， 获得半纤维素水解产物和预处理后的甜高粱秆渣底物，用清水洗净，除去酶水解及发酵抑制物，作为酶水解原料。取1. 5g作为酶水解原料，加入IOmL 0. IM乙酸-乙酸钠缓冲液 (PH4.8)中，以20FPU/g葡聚糖的比率加入纤维素酶，同时加入0. 3mL Tween80，在55°C下磁力搅拌水解M小时后，再加入0. 75g底物，以20FPU/g葡聚糖的比率加入纤维素酶，同时加入0. 15mLTween80，磁力搅拌水解48h后，再加入0. 75g预处理料，以20FPU/g葡聚糖的比率加入纤维素酶，同时加入0. 15mL Tween80，水解至120h，用DNS法测定总还原糖浓度，得到总还原糖浓度为92. :3mg/mL，总糖回收率为58. 2%。实施例3把榨汁后的甜高粱秆渣粉碎到60目，按固液比1 20g/mL加入到高温液态水反应釜中，在4Mpa、180°C、400rpm的高温液态水环境下处理20min，完成预处理，固液分离，获得半纤维素水解产物和预处理后的甜高粱秆渣底物，用清水洗净，除去酶水解及发酵抑制物，作为酶水解原料。取Ig做为酶水解原料，加入IOmL 0. 05M乙酸-乙酸钠缓冲液 (pH4. 8)，以20FPU/g葡聚糖的比率加入纤维素酶，同时加入0. 075mL/g Tween80，在50°C下磁力搅拌水解M小时后，再加入0. 5g预处理料，以20FPU/g葡聚糖的比率加入纤维素酶， 同时加入0. 0375mL Tween80,磁力搅拌水解48h后，再加入0. 5g预处理的底物，以20FPU/ g葡聚糖的比率加入纤维素酶，同时加入0. 0375mL Tween80，水解至120h，用DNS法测定总还原糖浓度，得到总还原糖浓度为120. ang/mL，总糖回收率为89. 3%。对比例2把榨汁后的甜高粱秆渣粉碎到60目，按固液比1 20g/mL加入到高温液态水反应釜中，在4Mpa、180°C、400rpm的高温液态水环境下处理20min，完成预处理，固液分离，获得半纤维素水解产物和预处理后的甜高粱秆渣底物，用清水洗净，除去酶水解及发酵抑制物，作为酶水解原料。取2g做为酶水解原料，加入IOmL 0. 05M乙酸-乙酸钠缓冲液 (pH4. 8)，以20FPU/g葡聚糖的比率加入纤维素酶，同时加入0. 15mL Tween80，在50°C下进行磁力搅拌水解120h，用DNS法测定总还原糖浓度，得到总还原糖浓度为105. 5mg/mL,总糖回收率为64. 9% ο由实施例1-3与对比例1可见，原料经高温液态水预处理后采用分批加料搅拌及添加非离子表面活性剂水解，无论在糖产物浓度和糖回收率上，都高于只用纤维酶水解的工艺。由实施例3和对比例2可见，以同样的甜高粱秆渣底物为原料，经过本发明的实施例3的处理工艺后，与一次性水解的对比例2的处理工艺后相比，其总还原糖浓度和总糖回收率得到了很大的提高，表明其水解效率也得到了很大的提高。从以上实施例中可以看出，木质纤维素类生物质在经过高温液态水预处理后，采取添加TweenSO、搅拌方式以及分批水解工艺相结合的工艺进行水解，可提高酶解原料的浓度到30%，并可大幅提高总还原糖浓度和总糖回收率。
权利要求
1.一种木质纤维素类生物质高效酶水解的方法，其特征在于，包括以下步骤在pH4. 5 4. 8，温度为45 55°C的条件下，起初以质量体积分数为10% 15% g/ mL的比率，将木质纤维素类生物质经高温液态水预处理后获得的木质纤维素原料，添加至 0. 05 0. IM乙酸-乙酸钠的缓冲溶液中，按10 20FPU/g纤维素的量加入纤维素酶，按 0. 075 0. 2mL/g木质纤维素原料的比率加入非离子表面活性剂，水解12 M小时后，再按起始加入量的一半加入木质纤维素原料，同时按10 20FPU/g纤维素的量加入纤维素酶，按0. 075 0. 2mL/g木质纤维素原料的比率加入非离子表面活性剂，水解36 48小时后，再加入木质纤维素原料，使三次加入的木质纤维素原料的总计质量体积分数为20% 30% g/ml,同时按10 20FPU/g纤维素的量加入纤维素酶，按0. 075 0. 2mL/g木质纤维素原料的比率加入非离子表面活性剂，继续水解到108 120小时，整个水解过程以搅拌的方式混勻物料。
2.根据权利要求1所述的木质纤维素类生物质高效酶水解的方法，其特征在于，所述的木质纤维素类生物质高效酶水解的方法，步骤为在PH4.8，温度为50°C的条件下，起初以质量体积分数为10% g/mL的比率，将木质纤维素类生物质经高温液态水预处理后获得的木质纤维素原料，添加至0. 05M乙酸-乙酸钠的缓冲溶液中，按20FPU/g纤维素的量加入纤维素酶，按0. 075mL/g木质纤维素原料的比率加入Tween 80，水解M小时后，再按起始加入量的一半加入木质纤维素原料，按20FPU/g纤维素的量加入纤维素酶，按0. 075mL/g木质纤维素原料的比率加入Tween 80，水解48小时后，再加入木质纤维素原料，使三次加入的木质纤维素原料的总计质量体积分数为20% g/ml，按20FPU/g纤维素的量加入纤维素酶， 按0. 075mL/g木质纤维素原料的比率加入Tween 80，继续水解到120小时，整个水解过程以搅拌的方式混勻物料。
3.根据权利要求1或2所述的木质纤维素类生物质高效酶水解的方法，其特征在于，所述的将木质纤维素类生物质经高温液态水预处理后获得的木质纤维素原料，步骤为将木质纤维素类生物质粉碎至40 60目，按物料干基固液比为1 10 20g/mL的比率，加水到反应系统中，反应条件为2 4MPa，170 190°C，300 500rpm，15 30min，处理结束后，固液分离，将预处理残渣用水洗净，获得木质纤维素原料。
4.根据权利要求1或2所述的木质纤维素类生物质高效酶水解的方法，其特征在于，所述的木质纤维素类生物质选自甜高粱秆渣、甘蔗渣、玉米秸秆、玉米芯、稻草杆、木屑和速生能源林。
5.根据权利要求1所述的木质纤维素类生物质高效酶水解的方法，其特征在于，所述的非离子表面活性剂为Tween 80。
6.根据权利要求1所述的木质纤维素类生物质高效酶水解的方法，其特征在于，所述的搅拌方式包括磁力搅拌和机械搅拌。
全文摘要
本发明公开一种木质纤维素类生物质高效酶水解的方法。它以木质纤维素类生物质经高温液态水预处理后获得的木质纤维素原料为底物，一定浓度分散于乙酸-乙酸钠缓冲液，再加入非离子表面活性剂和纤维素酶，搅拌物料水解一段时间后，再分二次加入一定量的物料，同时加入非离子表面活性剂和纤维素酶继续水解，获得糖类化合物和木质纤维素残渣。本发明将高温液态水预处理和分批加料、添加非离子表面活性剂搅拌酶水解工艺耦合，水解效率高，极大地提高了酶水解的木质纤维素原料浓度，浓度达30％。在高浓度的木质纤维素原料的情况下，产糖浓度、水解效率高，在提高酶解原料浓度的同时产出高浓度糖，提高了酶解效率，实现了木质纤维素类生物质的高效酶水解。
文档编号C12P7/10GK102174594SQ201110063789
公开日2011年9月7日 申请日期2011年3月16日 优先权日2011年3月16日
发明者亓伟, 庄新姝, 徐惠娟, 王琼, 王闻, 袁振宏, 许敬亮, 谭雪松, 马隆龙 申请人:中国科学院广州能源研究所