专利名称：丹参内生真菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及微生物技术领域，特别涉及丹参内生真菌及其应用。
背景技术：
丹参酮是具有活血化瘀作用的中药丹参主要的脂溶性成分，其中丹参酮I和丹参 酮IIA是其主要的有效成分。丹参酮I抗菌活性很强，比小檗碱强许多倍；丹参酮IIA具有天然抗氧化作用，临床在心脑血管疾病、肾脏疾病、肝脏疾病等方面应用广泛。目前，丹参酮I和丹参酮IIA主要来源于唇形科鼠尾草属植物丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)的根。虽然丹参资源区域广阔，且已进行大量的人工栽培；但是其分布星散，资源更新周期长，且人工栽培技术要求高，药材质量参差各异。随着丹参酮I和丹参酮IIA众多药理活性的发现，其市场需求增大，通过直接采收丹参天然和人工资源将不能满足市场需求。另一方面，丹参酮I和丹参酮IIA化学合成困难，难以实现产业化。研究者们试图通过生物技术方法获得丹参酮I和丹参酮IIA，因此，近年来这已成为人们关注的课题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种新的丹参内生真菌，并提出其用途，SP能够通过微生物发酵产生丹参酮类化合物丹参酮I和丹参酮IIA。为了解决前述技术问题，本发明提供了一种丹参内生真菌，命名为深绿木霉Trichoderma atroviride。本发明所述的丹参内生真菌是从唇形科鼠尾草属植物丹参(Salviamiltiorrhiza Bunge)植物活体中采用内生真菌分离纯化技术分离获得的,经微生物分类学鉴定为深绿木霉(Trichoderma atroviride)。该菌株已保藏,保藏日期为2011年03月27日，保藏号为CGMCC No. 4712，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路I号院，邮编100101。本发明所述的丹参内生真菌的固体培养特征为在马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基上26°C培养，生长迅速，菌落在3天内覆盖直径80mm的平板，呈辐射状，表面疏松、平坦，菌丝无色；在培养的第5天明显可见有孢子产生，最初为淡绿色，以后逐渐增多，呈现深绿色，产孢丛束排列成同心的轮纹；有椰子气味(甜味)。本发明所述的丹参内生真菌的液体培养特征为(I)培养基PDA，摇瓶培养10天，培养温度26± 1°C ;(2)发酵培养特征培养第1-2天有少许l_2mm白色菌丝球出现，培养液澄清；培养第3_4天，菌丝球直径增大至3-4mm，培养液开始变浑浊；培养第5_8天，菌球数量增多，培养液浑浊；培养第9-10天，白色菌球体直径为4-5_，培养液又变澄清。本发明所述的丹参内生真菌形态特征为培养的菌丝体无色、分枝繁复，由具有横隔的分枝菌丝构成，分枝角度为近似90° ;分生孢子梗的可育延伸物没有或者很少产生，没有不育的菌毛。虽然成对着生的分枝比较常见，但是分生孢子梗的典型分枝方式为单侧分枝；分生孢子绿色，亚球形至卵圆形，没有明显的脱落痕迹，光滑，成簇着生于分生孢子梗的顶端。本发明所述的丹参内生真菌的ITS和5. 8S rDNA碱基序列如SEQ ID NO. I所示为CCGAGTTTACAACTCCCAAACCCAATGTGAACCATACCAAACTGTTGCCTCGGCG
GGGTCACGCCCCGGGTGCGTCGCAGCCCCGGAACCAGGCGCCCGCCGGAGGGACCAACCAAACTCTTTTCTGTAGTCCCCTCGCGGACGTTATTTCTTACAGCTCTGAGCAAAAATTCAAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCAACCCTCGAACCCCTCCGGGGGGTCGGCGTTGGGGACCTCGGGAGCCCCTAAGACGGGATCCCGGCCCCGAAATACAGTGGCGGTCTCGCCGCAGCCTCTCCTGCGCAGTAGTTTGCACAACTCGCACCGGGAGCGCGGCGCGTCCACGTCCGTAAAACACCCAACTTCTGAAATG本发明还提供了丹参内生真菌的应用。本发明所述的丹参内生真菌，经发酵可得丹参酮类化合物，其工艺步骤如下菌种活化一种子培养一发酵培养一发酵产物甲醇匀浆一超声提取一减压浓缩一HPLC和LC-HRMS/MS分析一丹参酮类化合物。其中发酵原料为马铃薯培养基(PDA)，发酵方式为液体摇瓶培养；菌种活化采用平板固体培养基，培养基为PDA;种子培养为马铃薯液体培养基(TOB);发酵培养基为马铃薯液体培养基O3DB)。培养时间菌种平板培养活化72小时，种子液摇床培养72小时，发酵培养10天。培养温度平板活化、种子摇床培养和发酵培养均为26土 1°C。摇床转速种子摇床培养和发酵培养均为180rpm。发酵物提取发酵完毕,收集发酵产物，甲醇重悬匀浆，超声提取，减压浓缩即得发酵物甲醇提取物，甲醇溶解残留物采用HPLC、LC-MS/MS和LC-HRMS/MS等分析方法分析得到丹参酮类化合物其中丹参酮I和丹参酮IIA。本发明所述的丹参内生真菌，通过菌株液体发酵能够产生丹参酮类化合物其中丹参酮I和丹参酮IIA，是寻找丹参酮类化合物丹参酮I和丹参酮IIA新资源的重要微生物，具有较大的应用价值。
图I本发明所述丹参内生真菌在PDA平板培养基上的形态图。图2本发明所述丹参内生真菌在PDA液体培养基中的形态图。图3本发明所述丹参内生真菌菌丝体甲醇提取物(B)中丹参酮IIA(I)和丹参酮1(2)与标准品㈧HPLC比对图谱。图4本发明所述丹参内生真菌菌丝体甲醇提取物⑶中丹参酮I与标准品(C)的LC-HRMS/MS比对图谱。图5本发明所述丹参内生真菌菌丝体甲醇提取物(F)中丹参酮IIA与标准品(E)LC-HRMS/MS比对图谱。
具体实施例方式下面结合附图和具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例应理解为仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等效变化和修饰同样落入本发明权利要求所限定的范围。实施例I本发明的丹参内生真菌为从陕西商洛栽培丹参根中得到的菌株。本发明的丹参内生真菌按以下步骤分离获得自来水冲洗30min去净泥沙后，用去离子水洗3次。将根切成2cm长的根段后按一下程序进行表面消毒75%乙醇，30s — I. 3M次氯酸钠(3_5%有效氯)，3min — 75%乙醇，30s —无菌去离子水洗3次。滤纸吸干残留水份后，用灭过菌的手术刀将根段切成5mm厚，置于含有100mg/L青霉素的PDA (土豆200g/L，葡萄糖20g/L，琼月旨，15g/L)培养基上26±2°C培养。每天观察样品真菌生长的情况。5-7天后有菌丝长出，挑取菌丝尖端转移到新的PDA培养基上纯化培养，并按形态合并，最终得到本发明的丹参内生真菌菌株。实施例2(I)取本发明的丹参内生真菌菌种，在无菌条件下，用接种针挑取少量菌丝，接入已灭菌的固体PDA培养基平板，于26± 1°C活化培养72小时。丹参内生真菌在PDA平板培养基上的形态如图I所示。(2)取活化培养后的菌种，在无菌条件下，转接入已灭菌的液体培PDA种子培养基中，26±1°C下180rpm摇床培养72小时，得种子。(3)配制好的PDA液体培养基，分装入250ml的三角瓶中(每瓶约100ml)，灭菌处理，冷却备用。无菌条件下，按照10%的接种量接种入种子，26±1°C下ISOrpm摇床培养10天。丹参内生真菌在PDA液体培养基中的形态如图2所示。(4)发酵完毕，收集培养物过滤后，将菌丝体悬于5倍体积的甲醇中匀浆5min，超声处理45min ;而后过滤减压蒸干，甲醇复溶残留物即得丹参酮类化合物丹参酮I和丹参酮IIA。(5) HPLC色谱条件如下色谱柱——ZORBAX-C18反相柱(4· 6Χ250_Χ5 μ m);流
动相-H2O (+0. I % H3PO4) HCN,梯度洗脱-[time (min) : D (HCN) ] = [O. 0:20% ]-[20. O
:40%]-[21. 0:80%]-[40. 0:80%]-[45. 0:20%];柱温:30°C;流速0. 8ml/min ;检测波长280nm。(6) LC-HRMS/MS 色谱条件如下色谱柱-Column Technology C18
column (5 μ m，2. I X 150mm);流动相-H2O (+0. 5 % HC00H) HCN (+0. 5% HC00H)，梯度洗
脱-[time (min) :D(HCN)] =
-[5. 0:30% ]-[8. 0:50% ]-[20. 0:70% ]-[25. 0:9
0%]-[27. 0:95%]-[30. 0:95%],流速-0. 4ml/min,进样量-0. 2 μ L0HRMS/MS 参数-
min range-100m/z, max range-1lOOm/z,scan rate-1. 5,gas temp-350°C, gas flow-111/min, Nebulizer-50psio(7)如图3-5所示，经以上HPLC和LC-HRMS/MS分析，表明本发明的丹参内生真菌 菌种液体发酵能够产生丹参酮类化合物丹参酮I和丹参酮IIA。
权利要求
1.一种丹參内生真菌，其特征在于，它的命名为深绿木霉Trichoderma atroviride,其保藏登记号为CGMCC No. 4712。
2.根据权利要求I所述的丹參内生真菌，其特征在于，它的显微形态为培养的菌丝体无色、分枝繁复，由具有横隔的分枝菌丝构成，分枝角度为近似90° ;分生孢子梗的可育延伸物没有或者很少产生，没有不育的菌毛；虽然成对着生的分枝比较常见，但是分生孢子梗的典型分枝方式为单侧分枝；分生孢子绿色，亚球形至卵圆形，没有明显的脱落痕迹，光滑，成簇着生于分生孢子梗的顶端。
3.根据权利要求I所述的丹參内生真菌，其特征在于，它的固体培养为PDA培养基上26°C培养，生长迅速，菌落在3天内覆盖直径80mm的平板，呈辐射状，表面疏松、平坦，菌丝无色；在培养的第5天明显可见有孢子产生，最初为淡緑色，以后逐渐增多，呈现深緑色，产孢丛束排列成同心的轮纹；有椰子气味。
4.根据权利要求I所述的丹參内生真菌,其特征在于,它的液体培养为 (1)培养基PDA，摇瓶培养10天，培养温度26±1°C; (2)发酵培养特征 培养第1-2天有少许l_2mm白色菌丝球出现，培养液澄清；培养第3_4天，菌丝球直径增大至3-4mm，培养液开始变浑浊；培养第5_8天，菌球数量增多，培养液浑浊；培养第9_10天，白色菌球体直径为4-5_，培养液又变澄清。
5.根据权利要求I所述的丹參内生真菌，其特征在于，它的ITS和5.8S rDNA碱基序列如SEQ ID NO. I所示为CCGAGTTTACAACTCCCAAACCCAATGTGAACCATACCAAACTGTTGCCTCGGCGGGGTCACGCCCCGGGTGCGTCGCAGCCCCGGAACCAGGCGCCCGCCGGAGGGACCAACCAAACTCTTTTCTGTAGTCCCCTCGCGGACGTTATTTCTTACAGCTCTGAGCAAAAATTCAAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCAACCCTCGAACCCCTCCGGGGGGTCGGCGTTGGGGACCTCGGGAGCCCCTAAGACGGGATCCCGGCCCCGAAATACAGTGGCGGTCTCGCCGCAGCCTCTCCTGCGCAGTAGTTTGCACAACTCGCACCGGGAGCGCGGCGCGTCCACGTCCGTAAAACACCCAACTTCTGAAATG。
6.如权利要求1-5中任何一项所述的丹參内生真菌在制备丹參酮类化合物丹參酮I和丹參酮II A中的应用。
7.根据根据要求6所述的应用，其特征在于，丹參内生真菌制备丹參酮类化合物丹參酮I和丹參酮IIA包括下列步骤 (1)取丹參内生真菌菌种，在无菌条件下，用接种针挑取少量菌丝，接入已灭菌的固体PDA培养基试管，于26± 1°C活化培养72小时； (2)取活化培养后的菌种，在无菌条件下，转接入已灭菌的液体培PDA种子培养基中，26±1°C下180rpm摇床培养72小时，得种子； (3)配制好的PDA液体培养基，分装入250ml的三角瓶中，每瓶约100ml，灭菌处理，冷却备用；无菌条件下，按照10%的接种量接种入种子，26±1°C下ISOrpm摇床培养10天；(4)发酵完毕，收集培养物过滤后，将菌丝体悬于5倍体积的甲醇中匀浆5min，超声处理45min ;而后 过滤减压蒸干，甲醇复溶残留物既得丹參酮类化合物丹參酮I和丹參酮IIA0
全文摘要
本发明公开了一种丹参内生真菌，它是从唇形科鼠尾草属植物丹参(Salvia miltiorrhizaBunge)植物活体中采用内生真菌分离纯化技术分离获得的，经微生物分类学鉴定为木霉Trichoderma atroviride。该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.4712。本发明还通过丹参内生真菌菌株液体发酵，产生了丹参酮化合物丹参酮I和丹参酮II A，是寻找丹参酮类化学成分丹参酮I和丹参酮II A新资源的重要微生物。
文档编号C12R1/885GK102676392SQ20111008797
公开日2012年9月19日 申请日期2011年4月8日 优先权日2011年4月8日
发明者张宏, 张巧艳, 明乾良, 秦路平, 郑承剑, 韩婷, 黄宝康, 黄芳 申请人:中国人民解放军第二军医大学