专利名称：一种豇豆花叶病毒亚科病毒通用rt-pcr检测用简并引物、检测方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种豇豆花叶病毒亚科病毒通用RT-PCR检测用简并引物、检测方法及其应用。
背景技术：
豇豆花叶病毒亚科(Cbffloririaae)属于类小RNA病毒目QPicornavirales)、\牲豇豆病毒科中的一个亚科，包含豇豆花叶病毒属(Cbfflorirm)、蚕豆病毒属 (.Fabavirus)和线虫传多面体病毒属U^povirus)等3个病毒属，共有53种病毒。豇豆花叶病毒亚科病毒是一类对农业生产安全造成重要威胁的病毒，多种病毒具有十分广泛的寄主范围，并可造成多种作物严重损失。根据2007年公布的《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》，该病毒亚科中被列为检疫性病毒的种类有南芥菜花叶病毒UraZ^s mosaic virus, ArMV)、蚕豆染色病毒(^roat/ bean stain virus, BBSV)、菜豆荚斑驳病毒、Bean pod mottle virus, BPMV)、豆工豆重花口十病毒(CbfFpea severe mosaic virus, CPSMV)、桃丛簇花叶病毒{Peach rosette mosaic virus, PRMV)、烟草环斑病毒、Tobacco ringspot 口>狀，TRSV)、番茄黑环病毒(Jomato black ring virus, TBRV)、番茄环斑病毒 {Tomato ringspot virus, iToRSV),共 8 种。2004 年 Maliogka 等建立了豇豆花叶病毒科 iComoviridae)(即现在的豇豆花叶病毒亚科)病毒通用检测的巢式RT-PCR，但还未见常规的通用RT-PCR检测方法。本申请发明人重新寻找豇豆花叶病毒亚科的RNAl基因组上的保守区域，根据保守区域序列重新设计一对简并引物，通过反转录(reverse transcription, RT)和聚合酶链式反应技术(polymerase chain reaction, PCR)建立了豇豆花叶病毒亚科的通用RT-PCR检测方法，反应结束后根据特异性扩增DNA片段的位置判定结果，并根据序列测定结果进行病毒种类鉴定。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种豇豆花叶病毒亚科病毒通用RT-PCR检测用简并引物、检测方法及其应用。本发明引物通用性好，检测方法快速准确，为进出口安全提供了保证。为了达成上述目的，本发明的解决方案是
一种豇豆花叶病毒亚科病毒通用RT-PCR检测用简并引物，由正向和反向引物组成，其正向引物的核苷酸序列见SEQ IDNo. 1:5' -TGTGAYTAYWVNVVNTTYGATGG-3‘；反向引物的核苷酸序列见 SEQ ID No. 2 5' -YTTRTCHBTVCCATCVGTAAT-3‘；其中，Y=C/T，ff=A/T, V=G/ A/C, N=A/G/C/T, R=A/G, B=G/T/C, H=A/T/C。一种豇豆花叶病毒亚科病毒通用RT-PCR检测的检测方法，包括如下步骤以样品总RNA为模板，利用上述的引物进行RT-PCR扩增，反应结束后凝胶电泳检测扩增产物，根据扩增DNA片段的位置判定结果，病症叶片中均能检出407 451 bp的DNA片段。
所述的RT-PCR反应包括反转录和PCR扩增两个过程。所述的RT-PCR的反应过程中反转录反应的温度为42°C，PCR扩增的先用退火温度 42°C进行5个循环，然后用退火温度50°C进行30个循环，延伸温度为72°C。本发明的有益效果为本发明根据豇豆花叶病毒亚科病毒RNAl基因组序列设计引物，该引物可用于豇豆花叶病毒亚科病毒的通用RT-PCR检测。本发明检测方法能够快速准确地判断样品是否有豇豆花叶病毒亚科病毒，引物通用性好，检测方法快速准确，为进出口安全提供了保证。
图1是豇豆花叶病毒亚科病毒通用RT-PCR方法对各种亚科病毒的特异性试验结果，包括9种线虫传多面体病毒属QN印ovirus)病毒、7种豇豆花叶病毒属、Comovirus、病毒、和1种蚕豆萎蔫病毒属0 如)病毒。S卩，1为南芥菜花叶病毒(ArMV)分离物1病叶、2为烟草环斑病毒(TRSV)病叶、3为番茄环斑病毒(ToRSV)分离物1病叶、4为樱桃卷叶病毒(CLRV)病叶、5为烟草黑环病毒(TBRV)病叶、6为桃丛簇花叶病毒(PRMV)病叶、7为葡萄扇叶病毒(GFLV)病叶、8为乌饭树叶斑驳病毒(BLMoV)病叶、9为悬钩子环斑病毒(RpRSV) 病叶、10为菜豆荚斑驳病毒(BPMV)病叶、11为豇豆花叶病毒(CPMV)分离物1病叶、12为豇豆重花叶病毒(CPSMV)分离物1病叶、13为蚕豆染色病毒(BBSV)病叶、14为南瓜花叶病毒 (SqMV)病叶、15为红三叶草斑驳病毒(RCMV)病叶、16为蚕豆萎蔫病毒1号(BBWVl)病叶、 17为萝卜花叶病毒(RaMV)病叶、18为番茄环斑病毒(ToRSV)分离物2病叶、19为番茄环斑病毒(ToRSV)分离物3病叶、20为豇豆花叶病毒(CPMV)分离物2病叶、21为豇豆重花叶病毒(CPSMV)分离物2病叶、22为南芥菜花叶病毒(ArMV)分离物2病叶、23为南芥菜花叶病毒(ArMV)分离物3病叶，M为100 bp的DNA Mark。图2是应用豇豆花叶病毒亚科病毒通用RT-PCR方法检测健康寄主植物的结果。 1-10分别为蒲瓜、普通烟、番茄、黄瓜、南瓜、鹊豆、蚕豆、豇豆、西瓜、百合的健康叶片。图3是应用豇豆花叶病毒亚科病毒通用RT-PCR方法检测百合病叶的结果。1为健康百合叶片的检测结果，2 - 6为发病百合叶片的检测结果，7为空白对照，M为100 bp的 DNA Mark。
具体实施例方式下面实施例用于对本发明的进一步说明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
1.引物设计与合成
根据豇豆花叶病毒亚科中苏铁坏死矮化病毒(CNSV)、葡萄铬黄花叶病毒(GCMV)、 GFLV、黑醋栗退化病毒(BRV)、RaMV, SqMV, BPMV, RCMV, CPMV, CPSMV, BBWVl、蚕豆萎蔫病毒 2 号(BBWV2)、ArMV、TRSV、GFLV、RpRSV、TBRV、甜菜环斑病毒(BRSV)、PRMVjoRSV 病毒的 RNAl 基因组序列设计引物，引物序列为
SEQ ID No. 1 (上游)5' -TGTGAYTAYWVNVVNTTYGATGG-3‘； SEQ ID No. 2 (下游)5' -YTTRTCHBTVCCATCVGTAAT-3‘。
为便于测序，在引物中分别引入通用测序引物BCABESTTM Sequencing Primer RV-M和M13-47 (下划线)，引物序列为:
SEQ ID No. 1 (Comov-sf-F2) 5 ‘ -GAGCGGATAACAATTTCACACAGG TGTGAYTAYWVNVVNTTYGATGG-3‘
SEQ ID No. 2 (Comov-sf-R2) 5 ‘ -CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC YTTRTCHBTVCCATCVGTAAT-3‘ 2.总RNA的提取
1)取0.1 g植物发病叶片，加入1 ml的TRIzol (美国hvitrogen公司)试剂，移入灭菌的1. 5 ml离心管中，室温下保持5 min ；
2)加0.2ml氯仿，剧烈振荡15 s，然后在室温下保持2_15 min后，4°C，12000 g离心 15 min ；
3)将上层水相转移到新的1.5ml离心管中，加0.5 ml异丙醇，颠倒混勻，室温下保持 15 min ；
4)4 °C, 12000 g离心10 min, RNA就会在管的侧壁和底部形成沉淀；
5)倒掉上清液，加入75%的乙醇洗涤沉淀，然后4°C, 7500 g离心5 min (如沉淀悬浮起来，则用12000 g离心)，弃去乙醇；
6)沉淀于室温下充分干燥后，溶于40μ 1 dH20 (DEPC处理)中，_20°C保存备用。3. RT-PCR扩增方法的建立
以总RNA为模板，进行RT-PCR反应。20 μ L反应体系进行反转录反应，即在0. 2 mL 的反应管中加入6. 75 μ L DEPC处理水，4 μ L总RNA，1 μ L Woligo (d T)15引物(10 ymol/L)(宝生物工程(大连)有限公司)，1 μ L dNTP混合物(10 mmol/L)(具体为dATP、 dGTP、dTTP和dCTP四种混合物，宝生物工程(大连)有限公司)，混勻后于65 V保持5 min, 迅速转移到冰上骤冷5min ；然后向反应管中加入2 μ L DTT (二硫苏糖醇，美国普洛麦格公司)(0. 1 mmol/L)，4 μ L 5X反转录缓冲液(美国普洛麦格公司)，1 μ L RNA酶抑制剂(40 U/UL)(宝生物工程(大连)有限公司)，0. 25 μ L反转录酶(200 U/yL)(美国普洛麦格公司)，42°C反应50 min ；72 V 15 min灭活反转录酶后获得反转录产物cDNA。PCR反应体系为25 μ L，即在0.2 mL的PCR反应管中加入13. 25 μ L DEPC处理水，3 μ L cDNA, 2 μ L 正向引物SEQ ID No. 1(10 ymol/L)、2 μ L 反向引物SEQ ID No. 2 (10 ymol/DaOXPCR缓冲液2. 5 μ L (宝生物工程(大连)有限公司)，2 μ L dNTP混合物 (2.5 mmol/L), 0. 25 μ L Taq DNA聚合酶(5 U/μ L)宝生物工程(大连)有限公司)。反应条件为95°C预变性3 min ；94°C变性50 s、42°C退火50 s、72°C延伸50 s，5个循环；接着 94°C变性50 s、50°C退火50 s、72°C延伸50 s，30个循环；最后72°C延伸7 min。在PCR仪上完成。PCR反应结束后进行琼脂糖凝胶电泳检测，根据是否扩增到407 451 bp的DNA片段判定样品中是否含有豇豆花叶病毒亚科病毒。本实施例检测方法能够快速准确地判断样品是否有豇豆花叶病毒亚科病毒，根据序列进行种类鉴定，为进出口安全提供了保证。豇豆花叶病毒亚科病毒通用RT-PCR检测用简并引物进一步可做成豇豆花叶病毒亚科病毒通用 RT-PCR检测试剂盒。实施例2
5豇豆花叶病毒亚科通用RT-PCR方法的通用性检测
取南芥菜花叶病毒(ArMV)、烟草环斑病毒(TRSV)、番茄环斑病毒(ToRSV)、樱桃卷叶病毒(CLRV)、烟草黑环病毒(TBRV)、桃丛簇花叶病毒(PRMV)、葡萄扇叶病毒(GFLV)、悬钩子环斑病毒(RpRSV)、乌饭树叶斑驳病毒(BLMoV)、菜豆荚斑驳病毒(BPMV)、豇豆花叶病毒 (CPMV)、豇豆重花叶病毒(CPSMV)、蚕豆染色病毒(BBSV)、南瓜花叶病毒(SqMV)、红三叶草斑驳病毒(RCMV)、萝卜花叶病毒(RaMV)、蚕豆萎蔫病毒1 (BBWV1)等17种病毒、M个分离物病叶，按实施例1方法分别提取总RNA，再按实施例1的方法进行RT-PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测结果。结果感染病毒的叶片中均检出407 451 bp的DNA片段。检测结果如图1 所示。表明建立的RT-PCR方法可用于该亚科中不同病毒种类的检测，具有良好的通用性， 可用于豇豆花叶病毒亚科病毒的通用检测。实施例3
豇豆花叶病毒亚科通用RT-PCR方法的的特异性检测
取蒲瓜、普通烟叶、番茄、黄瓜、南瓜、鹊豆、蚕豆、豇豆、西瓜、百合等植物的健康叶片， 按实施例1方法分别提取总RNA，再按实施例1的方法进行RT-PCR扩增，进行特异性检测。 检测结果如图2所示。表明建立的通用RT-PCR方法并不会与病毒的寄主植物产生交叉反应，具有良好的特异性，符合检测的要求。实施例4
豇豆花叶病毒亚科通用RT-PCR方法的的在百合病毒检测中的应用取具有类似病毒症状的百合叶片，按实施例1方法分别提取总RNA，使用引物 Comov-sf-F2和ComoV-Sf-R2，按实施例1的方法进行RT-PCR扩增，进行检测应用。检测结果如图3所示。对扩增的DNA片段进行直接测序，序列分析表明为南芥菜花叶病毒(ArMV)。 表明建立的通用RT-PCR方法可用于百合等样品中豇豆花叶病毒亚科病毒的快速检测鉴定。
权利要求
1.一种豇豆花叶病毒亚科病毒通用RT-PCR检测用简并引物，其特征在于由正向和反向引物组成，其正向引物的核苷酸序列见SEQ ID No. 1 5 ‘ -TGTGAYTAYWVNVVNTTYGATGG-3 ‘；反向引物的核苷酸序列见 SEQ ID No. 2 5 ‘ -YTTRTCHBTVCCATCVGTAAT-3 ‘；其中，Y=C/T，ff=A/T，V=G/A/C，N=A/G/C/T，R=A/G，B=G/ T/C, H=A/T/C。
2.一种如权利要求1所述的豇豆花叶病毒亚科病毒通用RT-PCR检测的检测方法，其特征在于包括如下步骤以样品总RNA为模板，利用上述的引物进行RT-PCR扩增，反应结束后凝胶电泳检测扩增产物，根据扩增DNA片段的位置判定结果，病症叶片中均能检出407、51 bp的DNA片段。
3.如权利要求2所述的一种豇豆花叶病毒亚科病毒通用RT-PCR检测的检测方法，其特征在于所述的RT-PCR反应包括反转录和PCR扩增两个过程。
4.如权利要求3所述的一种豇豆花叶病毒亚科病毒通用RT-PCR检测的检测方法，其特征在于所述的RT-PCR的反应过程中反转录反应的温度为42°C，PCR扩增时先用退火温度 42°C进行5个循环，然后用退火温度50°C进行30个循环，延伸温度为72°C。
5.一种如权利要求1所述豇豆花叶病毒亚科病毒通用RT-PCR检测用简并引物的应用， 其特征在于所述的弓I物对样品总RNA进行RT-PCR扩增后对所扩增的DNA片段进一步序列测定后，能快速鉴定豇豆花叶病毒亚科病毒的种类。
6.一种如权利要求1所述豇豆花叶病毒亚科病毒通用RT-PCR检测用简并引物的应用， 其特征在于所述豇豆花叶病毒亚科病毒通用RT-PCR检测用简并引物能应用于豇豆花叶病毒亚科病毒通用RT-PCR检测试剂盒。
全文摘要
本发明公开了一种豇豆花叶病毒亚科病毒通用RT-PCR检测用简并引物、检测方法及其应用，由正向和反向引物组成，其正向引物的核苷酸序列见SEQIDNo.15′-TGTGAYTAYWVNVVNTTYGATGG-3′；反向引物的核苷酸序列见SEQIDNo.25′-YTTRTCHBTVCCATCVGTAAT-3′；其中，Y=C/T，W=A/T，V=G/A/C，N=A/G/C/T，R=A/G，B=G/T/C，H=A/T/C。本发明引物通用性好，检测方法快速准确，为进出口安全提供了保证。
文档编号C12Q1/70GK102206714SQ20111008790
公开日2011年10月5日 申请日期2011年4月8日 优先权日2011年4月8日
发明者廖富荣, 林石明, 黄蓬英 申请人:厦门出入境检验检疫局检验检疫技术中心