专利名称：检测水体中是否存在杀虫剂及杀虫剂含量范围的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种检测水体中是否存在杀虫剂及杀虫剂含量范围的试剂盒。
背景技术：
施用农药防治农作物的病、虫、草、鼠害是保障我国“两高一优”农业持续稳定发展的重要措施之一。但是，农药的使用是一把双刃剑，由于农药的大量滥用，施用区的水质受污染，生态平衡被破坏，同时，不合理使用化学农药，引起害虫抗性的迅速发展增强，迫使农药的用量和次数相应增加，对农药的使用和依赖程度呈现出恶性循环状态，造成农药施用和残留超标现象日渐加重。农药使用中只有10-20%左右的剂量到达目标害虫，其余大部分的农药或附着于作物与土壤表面，或飘散在大气中，通过降雨等经地表径流进入地表水和地下水，污染水体、土壤和农业生态系统。在农药之中，有机磷农药对身体极为有害。低剂量的有机磷农药可使人产生慢性中毒，对人体致癌、致畸、致突变的危害是不容质疑的。急性中毒可引起肌肉痉挛、瞳孔收缩、呼吸困难，甚至引发死亡。目前，大多数污水中农药残留的检测需要运用大型仪器，费时费力。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测水体中是否存在杀虫剂及杀虫剂含量范围的试剂
品.ο本发明提供了一种确定待测水体中杀虫剂的试剂盒，包括如下组分XB1蛋白、固兰B盐和β-乙酸萘酯；所述XBl蛋白为如下(a)或(b)或(c)(a)序列表的序列1所示的蛋白质；(b)序列表的序列1自N末端第39至574位氨基酸残基所示的蛋白质；(c)序列表的序列1自N末端第1至574位氨基酸残基所示的蛋白质；所述确定待测水体中杀虫剂为确定待测水体中是否含有杀虫剂和/或确定待测水体中的杀虫剂含量范围。所述试剂盒具体可由酶管、底物管、显色剂管和pH7. 050mM磷酸缓冲液组成；所述酶管中装有所述XBl蛋白；所述底物管中装有所述乙酸萘酯；所述显色剂管中装有所述固兰B盐。所述pH7. 050mM磷酸缓冲液具体可为将磷酸氢二钠Na2HPO4 · 12H20和磷酸二氢钠 NaH2PO4 · 2H20溶于水得到的缓冲液。所述试剂盒可用于确定待测水体中的杀虫剂；所述确定待测水体中的杀虫剂为确定待测水体中是否含有杀虫剂和/或确定待测水体中的杀虫剂含量范围。本发明还保护一种辅助确定待测水体中的杀虫剂的方法，包括如下步骤(1)将取自待测水体的样本和蒸馏水样本分别用甲苯进行抽提，收集抽提液；
(2)将抽提液中的甲苯挥发后，剩余物质溶于乙醇水溶液；(3)在步骤⑵的溶液中加入XBl蛋白共孵育；所述XBl蛋白为如下(a)或(b)或 (c) (a)序列表的序列1所示的蛋白质；(b)序列表的序列1自N末端第39至574位氨基酸残基所示的蛋白质；(c)序列表的序列1自N末端第1至574位氨基酸残基所示的蛋白质；(4)在步骤(3)的溶液中加入β -乙酸萘酯共孵育；(5)将步骤(4)的溶液中加入固兰B盐，通过比较待测水体样本和蒸馏水样本的颜色确定待测水体中的杀虫剂；所述确定待测水体中的杀虫剂为确定待测水体中是否含有杀虫剂和/或确定待测水体中的杀虫剂含量范围(如果待测水体样本的颜色比蒸馏水样本颜色明显减弱，即可判定有杀虫剂的存在)。所述乙醇水溶液中乙醇的含量具体可为50% (体积百分含量)。所述步骤(3)中共孵育时间具体可为5分钟。所述步骤(4)中共孵育的时间具体可为3分钟。所述XBl蛋白的制备方法具体可包括如下步骤(1)将序列表的序列2自5’末端第115至1725位核苷酸所示的DNA分子插入载体pET28a的多克隆位点，得到重组表达载体；(2)将所述重组表达载体导入大肠杆菌BL21 (DE3)，得到重组菌；(3)将所述重组菌进行诱导表达，得到XBl蛋白。所述诱导表达的方法具体可为在0D_ = 0. 6的重组农杆菌菌液中加入终浓度为 ImM的IPTG诱导培养16-18h。所述方法还可包括将诱导表达后的重组菌进行超声破碎并离心取上清液的步骤。所述超声破碎的参数优选为超声频率14HZ、间隔10秒进行一次超声处理、每次超声处理的时间为5秒、超声处理20次。所述离心的参数优选为4°C、12000g、15分钟。所述用甲苯进行抽提具体可为将甲苯与所述样本震荡混勻，静置分层后取甲苯相。以上任一所述杀虫剂具体可为有机磷杀虫剂(有机磷类杀虫剂)、氨基甲酸酯杀虫剂(氨基甲酸酯类杀虫剂)或拟除虫菊酯杀虫剂(拟除虫菊酯类杀虫剂)。所述氨基甲酸酯杀虫剂具体可为残杀威或巴沙。所述有机磷杀虫剂具体可为马拉硫磷、敌敌畏或敌百虫)。所述拟除虫菊酯杀虫剂具体可为胺菊酯、溴氰菊酯或氯菊酯。本发明可以快速检测水体中的杀虫剂残留，以确定水体是否被污染，平均检测限可以达到小于lyg/ml。本发明发现来自斜纹夜蛾的XBl蛋白(或XBl融合蛋白)具有羧酸酯酶活性，可与天然底物β -乙酸萘酯反应生成β -萘酚，经固蓝B盐显色而成红色；而当羧酸酯酶被有机磷类、氨基甲酸酯类或拟除虫菊酯类杀虫剂抑制后，则失去或部分失去上述酶学反应能力而红色减弱，其减弱的程度和杀虫剂种类和浓度成正比，可实现对水中杀虫剂的快速检测。本发明具有如下优点(1)样品进行显色反应前用甲苯初步提取，可以提高检测的灵敏度，并消除污水中重金属及其它无机盐离子等对酶的影响；(2)对多数杀虫剂检测浓度可低于ι μ g/ml ； (3)成本低，可实现快速检测。
图1为实施例3的步骤三的显色结果；1、2 阴性对照样本；3、4 :0. 5 μ g/ml残杀威水溶液。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。残杀威、马拉硫磷、敌敌畏、敌百虫、巴沙、胺菊酯、溴氰菊酯和氯菊酯均购自北京市农药检定所，均为标样(纯度在95%以上)。pGEM-T easy vector =Promega公司产品，产品目录号A1380。斜纹夜蛾(Spodoptera litura)公众可以从中国科学院动物研究所获得；参考文献:Feng Cui, Zhe Lin a, Hongsheng Wang, Silu Liu, Haijing Chang, Gerald Reeck, Chuanling Qiao, Michel Raymond, Le Kang, Two single mutations commonly cause qualitative change of nonspecific carboxylesterases in insects.Insect Biochemistry and Molecular Biology,2011,41 :1_8。实施例1、xbl融合基因的表达一、xbl基因的克隆1、提取斜纹夜蛾的总RNA，并反转录为cDNA。2、以步骤1提取的cDNA为模板，用Fl和Rl组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR 扩增产物(约1611bp)。Fl (上游引物)5，-ATGGTGCAAGTGAGAGTGAATGA-3，；Rl (下游引物)5，-TCACAATACATATTTTTCATACAATTT-3，。PCR 反应体系(50 μ 1) 10Xbuffer 5 μ 1，dNTP (IOmM) 1 μ 1，Fl (IOuM) 1· 25 μ 1， Rl (IOuM) 1. 25 μ 1，Taq(Expand High Fidelity)。· 75 μ 1，水 39. 75 μ 1，cDNA 模板 1μ 1。PCR反应条件94 °C预变性^iiin ；然后进行30个循环94 °C 15s，55 °C 30s， 68 °C 2min ；最后 68°C 延伸 7min，4°C 保存。3、用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(Tiangen，产品号DP208)回收纯化步骤2的PCR 扩增产物，在T4DNA连接酶的作用下与pGEM-T easy vector进行连接(室温放置lh，然后 4°C过夜)，得到连接产物。4、将2 μ 1步骤3的连接产物加入50ul大肠杆菌DH5 α (天根公司产品)感受态细胞中，冰浴20mim，42°C热激45s，冰浴aiiin ；加入500 μ 1液体LB培养基(不含抗生素)， 37°C下200rpm复苏Ih ；3600rpm离心菌液90s，在超净工作台中吸除400 μ 1上清液，用剩余的上清液悬浮沉淀的菌体，用涂布器将悬浮液均勻的涂在筛选平板上(固体LB培养基中含有50 μ g/ml氨苄青霉素，然后将40 μ 1 20mg/ml X-gal和40 μ 120mg/ml IPTG涂到固体平板上)，37°C恒温箱中培养IMi左右；挑取白斑放到3ml液体LB培养基(含有50 μ g/ml 氨苄青霉素)中，37°C下220rpm摇菌过夜。
5、将步骤4的菌液用Fl和Rl组成的引物对进行PCR鉴定(PCR产物约161 Ibp的为阳性)，PCR鉴定阳性的菌液提取质粒进行酶切鉴定(Mcl和B10I双酶切；获得约3015bp 和约1611bp的酶切产物的为阳性)，酶切鉴定阳性的质粒送至华大公司测序。测序结果表明，在pGEM-T easy vector中插入了序列表的序列2所示的DNA(序列表的序列2自5’末端第115至1722位核苷酸所示的xbl基因，编码序列表的序列1自N末端第39至574位氨基酸残基所示的XBl蛋白)，即得到了重组质粒pT-xbl。二、重组表达载体和重组菌的构建1、用限制性内切酶Mel和BioI双酶切重组质粒pT-xbl，用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(Tiangen，产品号DP208)纯化回收小片段(约1611bp)。2、用限制性内切酶Mel和BioI双酶切载体pET28a (Novagen)，用琼脂糖凝胶DNA 回收试剂盒(Tiangen，产品号DP208)纯化回收载体骨架(约5369bp)。3、将步骤1的小片段和步骤2的载体骨架连接(37°C水浴他)，得到连接产物。4、将2 μ 1步骤3的连接产物加入50ul大肠杆菌BL21 (DE3)(天根公司产品)感受态细胞中，冰浴20mim，42°C热激45s，冰浴aiiin ；加入500 μ 1液体LB培养基(不含抗生素)，37°C下170rpm复苏Ih ；3600rpm离心菌液90s，在超净工作台中吸除400 μ 1上清液， 用剩余的上清液悬浮沉淀的菌体，用涂布器将悬浮液均勻的涂在LK平板上(含有50μ g/ml 卡那霉素的固体LB培养基)，37°C恒温箱中培养IMi左右。5、挑取平板上的单菌落，接种到LK液体培养基(含有50 μ g/ml卡那霉素的液体 LB培养基)中37°C振荡培养12t^200-250rpm)。6、将步骤5的菌液用Fl和Rl组成的引物对进行PCR鉴定(PCR产物约1611bp 的为阳性)，PCR鉴定阳性的菌液提取质粒进行酶切鉴定(Mcl和B10I双酶切；获得约 3015bp和约1611bp的酶切产物的为阳性)。结果表明，得到了重组质粒ρΕΤΧΒ1(在载体 pET28a中插入了序列表的序列2自5’末端第115至1725位核苷酸所示的xbl基因，xbl 基因与载体pET28a中的核苷酸融合形成xbl融合基因；xbl融合基因如序列表的序列2所示，编码序列表的序列1所示的XBl融合蛋白)和重组菌(含有重组质粒pETXBl的大肠杆菌 BL21(DE3))。三、xbl基因的诱导表达1、挑取步骤二制备的重组菌的单菌落，加入LB培养基(含50yg/ml卡那霉素)中，37°C下200rpm震荡培养至OD6tltl = 0. 6，然后加入终浓度为ImM的IPTG诱导培养 16h(16-18h 均可)。2、将步骤1的菌液4000rpm/min离心IOmin (离心半径9cm)，取沉淀，加入十分之一菌液体积的0.05M磷酸缓冲液(pH7.0)重悬细胞，在冰浴上进行超声破碎(超声频率 14HZ ；间隔10秒进行一次超声处理，每次超声处理的时间为5秒，超声处理20次)，离心 (40C，12000g) 15分钟，收集上清液。3、取若干支1. 5ml离心管，每支离心管加入10 μ 1步骤2的上清液，在冰冻干燥机上冻干过夜，即为酶管(含有XBl融合蛋白)。四、对照管的制备1、将载体pET28a转化大肠杆菌BL21 (DE3)，得到对照菌。2、将对照菌进行诱导表达，方法同步骤三的1。
7
3、取步骤2的菌液进行超声破碎，方法同步骤三的2。4、取若干支1. 5ml离心管，每支离心管加入10 μ 1步骤2的上清液，在冰冻干燥机上冻干过夜，即为对照管。实施例2、试剂盒的组装试剂盒(100次)由22支酶管、22支底物管、22支显色剂管、1瓶缓冲液00ml)和 250只0. 2ml离心管组成。缓冲液由为50mM磷酸缓冲液(pH7. 0)；是将磷酸氢二钠Na2HPO4 · 12H20(国药集团化学试剂公司；产品编号10020318)和磷酸二氢钠NaH2PO4 ·2Η20(国药集团化学试剂公司； 产品编号20040718)溶于水得到的。显色剂管内含5mg固兰B盐(国药集团化学试剂有限公司，产品目录号 70117082)的 1. 5ml 离心管。底物管内含Imgii-乙酸萘酯(国药集团化学试剂有限公司，产品目录号 30127624)的 1. 5ml 离心管。酶管实施例1的步骤三制备的酶管。试剂盒的储存条件酶管在4°C干燥条件下储存，其它组分均在室温(15_25°C )、 避光、干燥条件下储存。实施例3、试剂盒的使用一、试剂盒中各组分的预处理将实施例2制备的试剂盒中的组分分别进行如下处理在每支酶管中加入Iml预冷的试剂盒提供的缓冲液，得到酶溶液(酶溶液中的XBl 融合蛋白浓度约20yg/ml)。在每支显色剂管中加入Iml蒸馏水，得到显色剂溶液(固蓝B盐的质量百分含量为 0. 5% )。在每支底物管中加入0. 4ml无水乙醇和0. 6ml试剂盒提供的缓冲液，得到底物溶液(β -乙酸萘酯的质量百分含量为0. )。酶溶液、底物管溶液和显色剂溶液均应现用现配；从节省成本考虑，每次最好至少 5个待测样品一起做。二、试剂盒的应用(检测残杀威)1、样本的制备将残杀威用无水乙醇配成ΙΟΟΟμ g/ml的母液，再取适量母液溶于蒸馏水，使其终浓度为0. 5 μ g/ml，作为待测样本(0. 5 μ g/ml残杀威水溶液)。将蒸馏水作为阴性对照样本。2、试剂盒的应用(1)将20ml待测样本和阴性对照样本分别加到25ml容量瓶中(每个样本设置两
瓶重复)。(2)每个容量瓶中各加入100 μ 1甲苯(国药集团化学试剂有限公司，产品目录号1002^94)，震荡3分钟，静置分层，加入蒸馏水至管口(不定量，只是为了方便吸取上相液)，上相液即为IX样品。(3)取10 μ 1 IX样品于一支0. 5ml离心管盖子上晾干。
(4)向晾干的离心管盖子上加入10μ 1溶液甲(将无水乙醇和试剂盒提供的缓冲液等体积混合；无水乙醇为国药集团化学试剂有限公司，产品目录号10009297)，吹打混勻。(5)向离心管管底加入20 μ 1酶溶液，稍许离心使溶液混勻并集中到管底，室温静置5分钟。(6)向离心管盖子上加入20 μ 1底物溶液，稍许离心使溶液混勻并集中到管底，室温静置3分钟。(7)向离心管盖子上加入20 μ 1显色剂溶液，轻甩使之与管底溶液混合，观察显色情况。阴性对照样本的显色结果见图1的1和2。待测样本的显色结果见图1的3禾口 4。 阴性对照样本和待测样本均显示红色，但待测样本显色比阴性对照样本明显减弱。将实施例1制备的对照管代替酶管进行步骤二的处理，得到对照溶液，将对照溶液代替酶溶液进行步骤1至7的操作，待测样本和阴性对照样本的颜色一致，没有显著差已升。三、试剂盒的应用(检测残其它杀虫剂)1、样本的制备将马拉硫磷、敌敌畏、敌百虫、巴沙、胺菊酯、溴氰菊酯和氯菊酯分别用无水乙醇配成1000 μ g/ml的母液，再取适量母液溶于蒸馏水，使其终浓度为0. 5 μ g/ml，作为各个待测样本。将蒸馏水作为阴性对照样本。2、试剂盒的应用分别将各个待测样本和阴性对照样本进行检测，方法同步骤三的2。阴性对照样本和待测样本均显示红色，但待测样本显色比阴性对照样本明显减弱。将实施例1制备的对照管代替酶管进行步骤二的处理，得到对照溶液，将对照溶液代替酶溶液进行步骤1至7的操作，各个待测样本和阴性对照样本的颜色一致，没有显著差异。四、试剂盒的推荐使用方法应用本发明的试剂盒检测待测污水时，可采用如下操作步骤1、测试组取待测污水20ml (如有固体杂质请先过滤)加到25ml容量瓶中；阴性对照组取20ml蒸馏水加到25ml容量瓶中；每个样本建议设置两个重复。2、测试组和阴性对照组的容量瓶中各加入100 μ 1甲苯，震荡3分钟，静置分层，加入蒸馏水至管口(不定量，只是为了方便吸取上相液)，上相液即为IX样品，IX样品根据需要可用甲苯稀释至10倍体积(10Χ样品)、100倍体积(100Χ样品)等。3、取10 μ 1样品于一支0. 5ml离心管盖子上晾干。4、向晾干的离心管盖子上加入10 μ 1含溶液甲(将无水乙醇和试剂盒提供的缓冲液等体积混合)，吹打混勻。5、向离心管管底加入20μ 1酶溶液，稍许离心使溶液混勻并集中到管底，室温静置5分钟。6、向离心管盖子上加入20 μ 1底物溶液，稍许离心使溶液混勻并集中到管底，室温静置3分钟。7、向离心管盖子上加入20 μ 1显色剂溶液，轻甩使之与管底溶液混合，观察显色情况。如果测试组比阴性对照组颜色明显减弱，即可判定有杀虫剂的存在。对于待测污水的1Χ、10Χ、100Χ……样品，显色比阴性对照组明显减弱的，分别判定为< lyg/ml， < 10μ g/ml, < 100 μ g/ml......。
权利要求
1.确定待测水体中杀虫剂的试剂盒，包括如下组分XB1蛋白、固兰B盐和β-乙酸萘酯；所述XBl蛋白为如下(a)或(b)或(c)(a)序列表的序列1所示的蛋白质；(b)序列表的序列1自N末端第39至574位氨基酸残基所示的蛋白质；(c)序列表的序列1自N末端第1至574位氨基酸残基所示的蛋白质；所述确定待测水体中杀虫剂为确定待测水体中是否含有杀虫剂和/或确定待测水体中的杀虫剂含量范围。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒由酶管、底物管、显色剂管和 pH7. 050mM磷酸缓冲液组成；所述酶管中装有所述XBl蛋白；所述底物管中装有所述β-乙酸萘酯；所述显色剂管中装有所述固兰B盐。
3.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于所述pH7.050mM磷酸缓冲液是将磷酸氢二钠Na2HPO4 · 12H20和磷酸二氢钠NaH2PO4 · 2H20溶于水得到的。
4.如权利要求1至3中任一所述的试剂盒，其特征在于所述XBl蛋白的制备方法包括如下步骤(1)将序列表的序列2自5’末端第115至1725位核苷酸所示的DNA分子插入载体 pET28a的多克隆位点，得到重组表达载体；(2)将所述重组表达载体导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌；(3)将所述重组菌进行诱导表达，得到XBl蛋白。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于所述诱导表达的方法为在0D_= 0. 6的重组农杆菌菌液中加入终浓度为ImM的IPTG诱导培养16-1他。
6.如权利要求4或5所述的试剂盒，其特征在于所述方法还包括将诱导表达后的重组菌进行超声破碎并离心取上清液的步骤；所述超声破碎为参数优选为超声频率14HZ、 间隔10秒进行一次超声处理、每次超声处理的时间为5秒、超声处理20次；所述离心的参数优选为:4°C、12000g、15分钟。
7.权利要求1至6中任一所述试剂盒在确定待测水体中杀虫剂中的应用；所述确定待测水体中杀虫剂为确定待测水体中是否含有杀虫剂和/或确定待测水体中的杀虫剂含量范围。
8.一种辅助确定待测水体中杀虫剂的方法，包括如下步骤(1)将取自待测水体的样本和蒸馏水样本分别用甲苯进行抽提，收集抽提液；(2)将抽提液中的甲苯挥发后，剩余物质溶于乙醇水溶液；(3)在步骤⑵的溶液中加入XBl蛋白共孵育；所述XBl蛋白为如下(a)或(b)或(c) (a)序列表的序列1所示的蛋白质；(b)序列表的序列1自N末端第39至574位氨基酸残基所示的蛋白质；(c)序列表的序列1自N末端第1至574位氨基酸残基所示的蛋白质；(4)在步骤(3)的溶液中加入β-乙酸萘酯共孵育；(5)将步骤(4)的溶液中加入固兰B盐，通过比较待测水体样本和蒸馏水样本的颜色辅助确定待测水体中杀虫剂；所述确定待测水体中杀虫剂为确定待测水体中是否含有杀虫剂和/或确定待测水体中的杀虫剂含量范围。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于所述乙醇水溶液中乙醇的含量为50%(体积百分含量)。
10.如权利要求8或9所述的方法，其特征在于所述步骤(3)中孵育时间为5分钟； 所述步骤中共孵育的时间为3分钟。
全文摘要
本发明公开了一种检测水体中是否存在杀虫剂及杀虫剂含量范围的试剂盒。本发明提供的试剂盒，包括如下组分XB1蛋白、固兰B盐、β-乙酸萘酯和pH7.050mM磷酸缓冲液；所述XB1蛋白为如下(a)或(b)(a)序列表的序列1所示的蛋白质；(b)序列表的序列1自N末端第39至574位氨基酸残基所示的蛋白质。本发明发现来自斜纹夜蛾的XB1蛋白具有羧酸酯酶活性，可与天然底物β-乙酸萘酯反应生成β-萘酚，经固蓝B盐显色而成红色；而当羧酸酯酶被有机磷类、氨基甲酸酯类或拟除虫菊酯类杀虫剂抑制后，则失去或部分失去上述酶学反应能力而红色减弱，其减弱的程度和杀虫剂种类和浓度成正比，可实现对水中杀虫剂的快速检测。
文档编号C12N15/55GK102305790SQ20111013690
公开日2012年1月4日 申请日期2011年5月24日 优先权日2011年5月24日
发明者乔传令, 兰文升, 崔峰, 江红 申请人:中国科学院动物研究所, 深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心