专利名称：一种实现pcr的微流控芯片及实时pcr的病毒快速检测装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种实现聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)的微流控芯片及实时PCR的病毒快速检测装置。
背景技术：
自1990年提出微全分析系统概念以来，微流控芯片技术在化学、生命科学、环境科学和食品科学等领域开辟了广阔的发展空间。微流控芯片技术以微流体控制技术为基础，引导分析仪器向小型化、集成化、自动化、高通量快速定量分析方向发展，为生化环境样品的实时检测、现场分析提供了一种可能的策略，其在医疗诊断与农业养殖系统疫情监测方面具有广阔的市场前景。聚合酶链反应(Polymease Chain Reaction, PCR)又称无细胞分子克隆或特异性 DNA序列体外引物定向酶促扩增技术，是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增， 具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究，还可用于疾病的诊断、动物病毒与疫情快速检测或任何有DNA、RNA的地方。在临床医学和动物疫情监测系统中，PCR被用于鉴别遗传疾病和快速检测病毒、病菌感染。用传统的方法，要检测病毒、病菌的感染需要把病原体培养数周才能鉴定，而采用本发明成果，可以快速判断人体与动物细胞(比如血液细胞)中是否存在病毒、病菌的DNA而确诊。实时PCR(real-time PCR)，属于定量PCR^j-PCR)的一种，以一定时间内DNA的增幅量为基础进行DNA的定量分析。实时PCR定量使用荧光色素，目前有二种方法。一种是在DNA中插入特异的荧光色素；另一种使用能与增幅DNA序列中特定寡核酸序列相结合的一种荧光探针。Real time PCR与Reverse Transcription PCR相结合，能用微量的RNA来找出特定时间、细胞、组织内的特别表达的遗传基因。这两种RT-PCR的组合被称之为“定量 RT-PCR(quantitative RT-PCR)。由于该技术不仅实现了 PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，具有特异性更强、有效解决PCR污染、自动化程度高等特点。实时定量PCR 是指在PCR指数扩增期间通过连续监测荧光信号强弱的变化来即时测定特异性产物的量， 并据此推断目的基因的初始量，不需要取出PCR产物进行分离。目前实时定量PCR作为一个极有效的实验方法，已被广泛地应用于分子生物学研究的各个领域。TaqMan探针是在PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针， 该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时， 报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’ _3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光检测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，可实现荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
传统的PCR扩增仪存在着热容量大、加热和冷却速度慢、样品消耗量高等缺点。通常完成一次扩增过程需要花费数个小时，而且对于反应物的需求量大。随着MEMS和微流控芯片技术的发展，基于微流控芯片和实时PCR的病毒快速检测装置具有热容量低、扩增速度快、样品消耗量小、制作成本低、可抛弃和实时检测扩增产物等优点。
发明内容
本发明技术解决问题克服现有技术的不足，提供一种实现PCR的微流控芯片及实时PCR的病毒快速检测装置，可以在微流控环境下进行小样本量快速、准确检测，减少 PCR试剂用量和缩短实现一次PCR扩增所需温度循环的时间，并对PCR扩增产物进行实时检测。本发明的技术解决方案如下一种实现PCR的微流控芯片，其特征在于所述微流控芯片由集成了微阀的三层聚二甲基硅氧烷(Polydimethylsiloxane，PDMS)材料键合封接而成，包括上层的气体控制通道，中间层的PDMS薄膜，下层的微流体通道；其中上层气体控制通道由四个微阀组成，其中两个微阀分别位于与反应腔对应的上层气体控制通道中的两端，另两个微阀与一端的一个微阀平行，所述三个平行的微阀组成一个微泵；每个微阀均由阀座和微阀气路通道组成，阀座与微阀气路通道之间垂直相连；当外界气体通过阀座进入微阀气路通道后，挤压中间层的PDMS薄膜，中间层的PDMS薄膜突起堵塞下层微流体通道，通过控制气体的压力，可以控制四个微阀的开启和关闭，微泵中的三个平行的微阀依次开启和关闭，可以驱动下层微流体通道中的流体；下层的微流体通道包括两个样品注入通道、微混合通道、PCR反应腔和废液排出通道；所述的两个样品注入通道分别用来注入样品和PCR反应液；所述的微混合通道用来对注入通道加入的样品和PCR反应液进行充分混合，以利于进行PCR反应；所述的PCR反应腔用来存储PCR反应液，完成PCR反应后，所述的废液排出通道用来排出PCR反应结束后的废液。 实验时，将PCR反应试剂和待扩增DNA样品分别从两个样品注入通道注入，在数据处理及控制单元的控制下，上层气体控制通道中的三个平行的微阀依次开启和关闭，驱动 PCR反应液和待扩增DNA样品分别通过两个样品注入通道进入微混合通道，在微混合通道中进行充分混合，流入PCR反应腔，此时关闭两端的两个微阀，使PCR反应液在温度控制单元的控制下完成PCR反应，反应完成后，打开两个微阀，开启微泵，将反应液从废液排出通道排出。一种实时PCR的病毒快速检测装置，包括微流控芯片、温度控制单元、信号探测单元和数据处理及控制单元，其中所述温度控制单元由半导体温控片和温度传感器组成，半导体温控片用来改变 PCR反应腔的温度，温度传感器用于检测PCR反应腔的温度并将温度转换为电信号，通过预先存储在数据处理及控制单元中的电信号和温度之间的相互关系，来确定PCR反应腔的温度并对半导体温控片进行反馈控制，可以实现高精度的温度控制；所述信号探测单元由激发光源、光学传输单元和光电探测器组成；激发光源发出的激发光照射PCR反应腔中PCR反应液的荧光染料或荧光探针，使荧光染料或荧光探针受激发产生荧光；光学传输单元用来传输激发光和收集样品的荧光；所述光电探测器用来探测荧光信号，并将光信号转换成电信号传输到数据处理及控制单元进行处理；所述数据处理及控制单元实现对温度控制单元和信号探测单元数据的采集、处理、存储和显示；数据处理及控制单元首先向温度控制单元发出命令，使半导体温控片对 PCR反应腔中的PCR反应试剂进行加热，温度传感器实时测量PCR反应腔中的PCR反应试剂的温度；当达到设定值时，数据处理及控制单元发出命令停止加热，从而实现高精度温度控制；当一次PCR扩增循环完成后，数据处理及控制单元向信号探测单元发出命令，打开激发光源，照射PCR反应腔，产生的荧光传输到光电探测器，经光电探测器转换成电信号传送到数据处理及控制单元进行处理和保存。本发明中只要能发出特定波长的激发光，激发光源可以是氙灯或发光二极管等光源。光学传输单元可以是自由空间或光波导，如光纤，采用全光纤传输结构可以大大减小探测系统体积，易于集成。光电探测器可以是光电倍增管、光电二极管、电荷耦合器件 (Charge-coupled Device, CCD)等。本发明与现有技术相比的优点在于本发明创造性设计了集成微阀的用于病毒检测的三层PDMS结构的微流控芯片及实时荧光PCR检测装置。本发明与传统方法相比，具有进样时间短、样品用量少、检测速度快、操作简便和集成化等优点。
图1本发明检测装置框图，1微流控芯片，2温度控制单元，3信号探测单元，4数据处理及控制单元；图2为本发明的集成微阀的三层PDMS微流控芯片结构图，11是上层气体控制通道，12是中间层的PDMS薄膜，13是下层微流体通道，111是阀座，112是微阀气路通道，131、 132是样品注入通道，133是微混合通道，134是PCR反应腔，135是废液排出通道；图3为本发明的集成微阀的三层PDMS微流控芯片结构图，141、142、143、144是微阀，三个平行的微阀142、143、144组成一个微泵15 ；图4为本发明中的微阀开启和关闭示意图，11上层气路控制层，12中间层PDMS薄膜，13微流体通道；图5为信号探测单元结构图，31激发光源，32光电探测器，33光学传输单元，1微流控芯片；图6为本发明中微阀开启和闭合的照片；图7为FITC荧光光谱图。
具体实施例方式下面的实例对本发明做出进一步说明，但并不因此而限制本发明，支持多种应用系统的技术创新与开发。如图2、3所示，本发明中的微流控芯片1由集成了微阀的PDMS材料键合封接而成，包括上层的气体控制通道11，中间层的PDMS薄膜12，下层的微流体通道13 ；中间层的 PDMS薄膜12厚度是80-120um，本发明此实施例中为lOOum。上层气体控制通道11由四个微阀141、142、143、144组成，其中两个微阀141、142 分别位于与反应腔134对应的上层气体控制通道11中的两端，另两个微阀143、144与一端的一个微阀142平行，三个平行的微阀142、143、144组成一个微泵15。每个微阀均由阀座 111、微阀气路通道112组成，阀座111与微阀气路通道112之间垂直相连。当外界气体通过阀座111进入微阀气路通道112后，挤压中间层的PDMS薄膜12，中间层的PDMS薄膜12突起堵塞下层微流体通道13，通过控制气体的压力，可以控制四个微阀141、142、143、144的开启和关闭，微泵15中的三个平行的微阀142、143、144依次开启和关闭，可以驱动下层微流体通道13中的流体。下层的微流体通道13包括两个样品注入通道131、132、微混合通道133、PCR反应腔134和废液排出通道135，两个样品注入通道131、132分别用来注入样品和PCR试剂。PCR 反应腔134用来存储PCR反应液。废液排出通道35用来排出PCR反应结束后的废液。实验时，将PCR反应试剂和待扩增DNA样品分别从样品注入通道131、132注入芯片中，在数据处理及控制单元4的控制下，上层气体控制通道11中的微阀142、143、144依次开启和关闭，驱动PCR反应试剂盒和待扩增DNA样品进入微混合通道133，在微混合通道 133中进行充分混合，流入PCR反应腔134，此时关闭微阀141、142，使PCR反应液在温度控制单元2的控制下完成PCR反应，反应完成后，打开微阀141、142，开启微泵15，将反应液从废液排出通道135排出。如图4所示，微流控芯片1上的微阀包括上层气路控制层11，中间层PDMS薄膜12， 下层的微流体通道13。当气体进入气路控制层11，中间层PDMS薄膜12受压向下突起阻塞下层的微流体通道13，继续增加气压，可完全切断下层的微流体通道13，此时微阀处于关闭状态。如图1所示，微流控芯片和实时荧光PCR病毒快速检测装置由微流控芯片1、温度控制单元2、信号探测单元3和数据处理及控制单元4构成。如图5所示，信号检测单元由激发光源31，光电探测器32，光学传输单元33组成， 激发光源发出的光通过光学传输单元照射到微流控芯片1中的PCR反应腔134，产生的荧光由光学传输单元33传送到光电探测器32进行检测。微流控通道宽度lOOum，深度75um，气体控制通道宽度200um，深度75um，范围宽度与深度比小于20即可。本发明的工作过程PCR反应试剂和待扩增样品分别从微流控芯片入口 131、132 注入微流体通道，数据处理及控制单元4发出命令使微泵15开始工作，在数据处理及控制单元4的控制下，上层气体控制通道11中的微阀142、143、144依次开启和关闭，驱动PCR反应试剂盒和待扩增DNA样品进入微混合通道133，在微混合通道133中进行充分混合，流入 PCR反应腔134，此时数据处理及控制单元4发出命令关闭微阀141、142，温度控制单元2开始工作，半导体温控片21通电加热，首先将PCR反应液加热到95°C变性，保持一定时间后， 通过改变半导体温控片21的输入电流方向将温度降到55°C退火，然后再加热到72°C进行延伸，这样一个循环完成目标DNA片段的一次扩增，整个PCR过程需要完成约30 35次循环，反应完成后，反应液从废液排出通道135排出。在每个PCR循环完成后，数据处理及控制单元4发出命令使信号探测单元3工作，打开激发光源31，激发光通过光学传输单元32 照射到PCR扩增产物，产生的荧光由光学传输单元32传输到光电探测器33，光电探测器33 将光信号转换为电信号，电信号传送到数据处理及控制单元4进行数据处理、存储和显示。实施例1 三层PDMS微流控芯片的制作
微流控芯片是由上层控制通道11、中间的PDMS薄膜层12和下层微流体通道层13 可逆封接而成。PDMS薄膜厚度lOOum，微流体通道的宽度和深度分别为IOOum和75um，气路控制通道的宽度和深度分别为200um，75um。微流控芯片在洁净室中显微镜下进行对准封接，并保证微阀141、142、143、144和微泵15正常工作。通过数据处理与控制单元4控制组成微泵15的三个微阀142、143、144的开启和关闭来实现驱动微流体的功能，图6是在显微镜下拍摄的微阀开启和闭合的照片，左边一幅图是微阀开启时显微镜下拍摄的上层气路通道和下层微流体通道照片，右边是微阀关闭时显微镜下拍摄的上层气路通道和下层微流体通道照片，可见此时上层通道向下突起已经关闭了微阀。实施例2 微流控芯片通道中异硫氰酸荧光素(Fluoresceinisothiocyanate， FITC)荧光信号的探测将加有异硫氰酸荧光素(Fluoresceinisothiocyanate，FITC)的待测样品从样品入口 131、132注入微流控芯片1，数据处理与控制单元4控制微泵15中的三个微阀142、 143、144依次开启或闭合驱动样品流动进入微混合器133，在微混合器133中进行充分混合后，样品进入PCR反应室134，数据处理与控制单元4发出命令打开信号探测单元3，信号探测单元3中的激发光源31发出激发光，通过光学传输单元32照射PCR反应室134，在480nm 的激发光照射下，FITC将产生520nm为中心波长的荧光，荧光仍然由光学传输单元收集传输到光电探测器33进行探测，荧光光谱如图7所示，可见FITC的荧光发射峰值在520nm附近，结果证明信号探测单元3可成功探测到PCR反应腔内的荧光。
权利要求
1.一种实现PCR的微流控芯片，其特征在于所述微流控芯片(1)由集成了微阀的 PDMS材料键合封接而成，包括上层的气体控制通道(11)，中间层的PDMS薄膜(12)，下层的微流体通道(1 ；其中上层气体控制通道(11)由四个微阀(141、142、143、144)组成，其中两个微阀(141、 142)分别位于与反应腔(134)对应的上层气体控制通道(11)中的两端，另两个微阀(143、 144)与一端的一个微阀(142)平行，所述三个平行的微阀(142、143、144)组成一个微泵 (15)；每个微阀均由阀座(111)、微阀气路通道(112)组成，阀座(111)与微阀气路通道 (112)之间垂直相连；当外界气体通过阀座(111)进入微阀气路通道(112)后，挤压中间层的PDMS薄膜(12)，中间层的PDMS薄膜(12)突起堵塞下层微流体通道(13)，通过控制气体的压力，可以控制四个微阀(141、142、143、144)的开启和关闭，微泵(15)中的三个平行的微阀(142、143、144)依次开启和关闭，可以驱动下层微流体通道(13)中的流体；下层的微流体通道(13)包括两个样品注入通道(131、132)、微混合通道(133)、PCR反应腔(134)和废液排出通道(13 ；所述两个样品注入通道(131、13幻分别用来注入样品和PCR反应液；所述的微混合通道(13 用来对注入通道加入的样品和PCR反应液进行充分混合，以利于进行PCR反应；所述的PCR反应腔(134)用来存储PCR反应液，完成PCR反应后，所述的废液排出通道(35)用来排出PCR反应结束后的废液。
2.根据权利要求1所述的实现PCR的微流控芯片，其特征在于所述中间层的PDMS薄膜(12)厚度是 80-120um。
3.一种实时PCR的病毒快速检测装置，其特征在于包括权利要求1所述的微流控芯片(1)、温度控制单元O)、信号探测单元C3)和数据处理及控制单元，其中所述温度控制单元O)由半导体温控片和温度传感器0 组成，半导体温控片 (21)用来改变PCR反应腔(134)的温度，温度传感器02)用于检测PCR反应腔(134)的温度并将温度转换为电信号，通过预先存储在数据处理及控制单元中的电信号和温度之间的相互关系，来确定PCR反应腔(134)的温度并对半导体温控片进行反馈控制，可以实现高精度的温度控制；所述信号探测单元⑶由激发光源(31)、光学传输单元(32)和光电探测器(33)组成； 激发光源(31)发出的激发光照射PCR反应腔(134)中PCR反应液中的荧光染料或荧光探针，使荧光染料或荧光探针受激发产生荧光；光学传输单元(3 用来传输激发光和收集样品的荧光；所述光电探测器(3 用来探测荧光信号，并将光信号转换成电信号传输到数据处理及控制单元(4)进行处理；所述数据处理及控制单元(4)实现对温度控制单元和信号探测单元数据的采集、处理、存储和显示；数据处理及控制单元(4)首先向温度控制单元( 发出命令，使半导体温控片对PCR反应腔(134)中的PCR反应液进行加热，温度传感器Q2)实时测量PCR 反应腔(134)中的PCR反应液的温度；当达到设定值时，数据处理及控制单元(4)发出命令停止加热，从而实现高精度温度控制；当一次PCR扩增循环完成后，数据处理及控制单元 (4)向信号探测单元(3)发出命令，打开激发光源(31)，照射PCR反应腔(134)，产生的荧光传输到光电探测器(33)，经光电探测器(3 转换成电信号传送到数据处理及控制单元(4) 进行处理和保存。
4.根据权利要求3所述实时PCR的病毒快速检测装置，其特征在于所述光电探测器(33)为光电倍增管、光电二极管或CCD探测器。
全文摘要
一种实现PCR的微流控芯片由集成了微阀的PDMS材料键合封接而成，包括上层的气体控制通道、中间层的PDMS薄膜和下层的微流体通道；实时PCR的病毒快速检测装置包括微流控芯片、温度控制单元、信号探测单元和数据处理及控制单元。本发明设计了集成微阀的用于病毒检测的三层PDMS结构的微流控芯片及实时荧光PCR检测装置，与传统方法相比，具有进样时间短、样品用量少、检测速度快、操作简便和集成化等优点。
文档编号C12M1/38GK102286358SQ20111014466
公开日2011年12月21日 申请日期2011年5月31日 优先权日2011年5月31日
发明者刘勇, 张弓, 张龙, 朱灵, 李志刚, 王贻坤 申请人:中国科学院合肥物质科学研究院