专利名称：Hpv58型治疗性复合基因疫苗及其构建方法
技术领域：
本发明涉及宫颈癌防治领域，尤其是人乳头瘤病毒58型(以下简称HPV58型)治疗性复合基因疫苗及其构建方法。
背景技术：
子宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤之一，发病率在女性恶性肿瘤中居第二位，仅次于乳腺癌。我国每年有新发病例约13. 15万，占世界宫颈癌新发病例总数的观.8%，每年死于宫颈癌的患者约5万人，大部分位于经济欠发达的西部地区如广西。目前，晚期宫颈癌患者采用外科手术、放疗、化疗等传统模式疗效欠佳，5年生存率仅有50%。宫颈癌的病因学研究表明高危型HPV感染是宫颈癌发生的首要因素且为始动因素。由于几乎所有宫颈癌细胞中都有HPV DNA和病毒转化蛋白的表达，HPV病毒蛋白作为一种抗原可刺激机体产生针对HPV的免疫反应，这就促使人们希望通过疫苗免疫治疗的方法来治疗和预防宫颈癌。HPV58型是1988年先后由中国和日本学者发现。我国最近完成的两项中国与亚洲妇女子宫颈中HPV型别分布的Meta研究结果显示HPV58是在我国子宫颈癌妇女中继HPV16 和18之后的另一重要的HPV优势型别，是我国北方和南方乃至亚洲地区子宫颈癌标本中均为第3位最常见的HPV型别。由于全球HPV16和18分布广泛而58型仅在亚洲各国比较常见，使西方国家对于HPV58型的研究极少。目前国外不论是已经上市或正在研究的HPV疫苗，都以16和18型为主，并没有包含58型。并且目前上市的仅有HPV预防性疫苗，对于已经罹患HPV感染甚至发展为宫颈癌前病变或宫颈癌的患者无效。由于HPV16、18与58基因的同源性仅有60 %，一些HPV16型常用的抗原表位如HPV16E711-20、49-57在HPV58型并不存在，因此，HPV16U8型疫苗对HPV58型感染并没有交叉保护作用。目前关于HPV16和18 型疫苗的研究已经很多，但对于HPV58型疫苗的研究仍然非常缺乏。面对我国宫颈癌患者中HPV58高感染率的现状，HPV58型治疗性疫苗研制是非常必要和迫切的。目前研究HPV疫苗主要有三个策略，第一种是预防HPV感染的预防性疫苗，主要通过产生中和抗体以抵抗病毒进入宿主上皮基底角化细胞内，目前最有希望的是包含有Ll 或L1/L2病毒壳蛋白的病毒样颗粒(VLPs)疫苗，这类疫苗主要用于年轻女性感染HPV之前，对已感染HPV或已有宫颈癌前病变或宫颈癌的女性无效。第二种是治疗性疫苗，主要通过刺激细胞介导的免疫反应以去除隐藏和表达病毒蛋白的细胞，这种疫苗应该能够阻止已经感染了病毒的角化细胞的增殖和促进已生长肿瘤的消退。因此，这类疫苗主要用于已经感染了 HPV或已经罹患宫颈癌前病变或宫颈的患者。由于HPV的早期基因E6和E7是维持其恶性表型所必需，从病毒开始感染到癌症的进展期，在肿瘤发展的所有阶段均有表达，能诱发机体产生并维持较强的以病毒抗原为靶分子的特异性CTL，因而，迄今仍是研制HPV治疗性疫苗所共同选择的靶抗原。第三策略是兼具预防和治疗作用的联合疫苗，这种疫苗的靶抗原既包含有Ll或L1/L2病毒壳蛋白又包含HPV的早期基因E6和E7。因此，这种疫苗既能产生强的中和抗体，又能诱发特异性CTL反应，以产生预防和治疗的效果，防止病毒的感染和扩散，清除手术或治疗后残余的肿瘤细胞。
3
采用HPV58型衣壳蛋白Ll或L1/L2为靶抗原研制的病毒样颗粒(VLPs)疫苗的报道有①田厚文等于2002年构建的表达人乳头瘤病毒58型Li、L2壳蛋白的非复制型重组痘苗病毒疫苗株；②李文生等于2007年预防性重组HPV58-减毒志贺氏杆菌载体活疫苗； ③Siang T等于2010年构建的HPV16/18/58三价VLPS疫苗。然而，此类疫苗存在如下问题 由于Li、L2衣壳蛋白在宫颈癌及癌前病变组织中不表达，故上述疫苗只能用于预防HPV58 型感染，但对已发生感染或病变的宫颈组织治疗无效。采用HPV58早期蛋白El或E2为靶抗原研制的疫苗的报道有张晓丽等于2009年构建了重组真核表达载体pcDNA3/58E2，但仅进行了体液免疫检测证明有抗E2特异性抗体产生，而没有进行细胞免疫相关实验的检测。此类疫苗存在如下问题E1和E2蛋白虽然涉及病毒游离基因的复制和病毒早期基因的转录，可能是感染早期好的靶抗原，但由于El和 E2蛋白的表达水平非常低以至难以被免疫系统所识别，而让病毒逃逸。而且，这两个基因通常在肿瘤生长的早期即病毒基因整合入宿主染色体时被敲出，因此，并不是理想的靶抗原。采用HPV58早期蛋白E6或E7为靶抗原(目前HPV治疗型疫苗研制过程中最常用的两个靶抗原)研制的疫苗的报道有⑴单独使用E6或E7基因作为靶抗原，罗利群等于 2003年制备了含HPV58型E7基因的重组痘苗病毒疫苗并利用动物肿瘤模型观察疫苗接种效果，发现经定点突变的HPV58E7基因转化活性显著降低，免疫小鼠后能抑制E7阳性肿瘤细胞在小鼠体内的生长并延长小鼠的生存期，说明该疫苗有一定的抗肿瘤效果。然而，此类疫苗存在如下问题由于仅利用了 HPV58E7基因作为抗原而忽略了另一个重要基因E6的抗原性，并且没有协同相关的佐剂来打破免疫耐受，因此该疫苗的作用尚待提高。( 未见使用E6和E7融合基因作为靶抗原。暂无采用HPV58L1和L2联合E6和E7为靶抗原研制的嵌合疫苗的相关报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种安全性高、免疫作用强、抗肿瘤理想的HPV58 型治疗性复合基因疫苗及其构建方法，用于治疗与HPV58型感染相关的宫颈癌及癌前病变。为解决上述技术问题本发明采用如下技术方案HPV58型治疗性复合基因疫苗， 该疫苗以HPV58型E6/E7融合基因为靶抗原，以GM/B7作为抗原佐剂；HPV58型E6/E7融合基因去除了 HPV58型E6和E7基因的终止码，同时将E6蛋白上的第50、63和106位氨基酸和E7蛋白上的第MJ6和92位氨基酸都突变成甘氨酸。靶抗原由HPV58型E6/E7融合基因片段插入pCI-Fc_GPI载体中，构建过渡性真核质粒 pCI-sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI，再将 sig-HPV58mE6E7-Fc_GPI 片段从 pCI 载体上切下来而得。该疫苗采用的载体为PVAX1-IRES-GM/B7，它对靶抗原sig-HPV58mE6E7-Fc_GPI和 GM/B7可共表达。该疫苗是PVAX卜sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI-IRES-GM/B7 (简称 PVAXl-HPV58mE6E7FcGB)。HPV58型治疗性复合基因疫苗的构建方法，其特征在于该方法包括以下步骤<1>制备靶抗原先去除HPV58型E6和E7基因的终止码，将E6和E7基因融合成HPV58mE6E7融合基因，其中，将E6蛋白上的第50、63和106位氨基酸和E7蛋白上的第MJ6和92位氨基酸都突变成甘氨酸；然后，把HPV58mE6E7融合基因片段插入 pCI-Fc-GPI载体中，构建过渡性真核质粒pCI-sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI，再将复合基因片段 sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI WpCI 载体上切下来；<2>选择载体选用GM-CSF和B7. 1双亚基共表达的疫苗载体PVAX1-IRES-GM/B7 ；<3>制备疫苗将步骤<1>的复合基因片段sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI插入步骤<2> 的疫苗载体PVAX1-IRES-GM/B7的IRES上游，即得HPV58型治疗性复合基因疫苗PVAXl_si g-HPV58mE6E7-Fc-GPI-IRES-GM/B7。本发明将HPV58型E6和E7制成融合基因HPV58mE6E7，并通过6个定点突变消除了其转化活性而保留其抗原性，避免了潜在的致癌风险，最大程度地确保了以其作为靶抗原的HPV58型治疗性复合基因疫苗(PVAXl-sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI-IRES-GM/B7)的安全性。该疫苗用于治疗与HPV58型感染相关的宫颈癌及癌前病变。由于采用了安全性更高的载体，并引入抗原佐剂GM/B7帮助打破免疫耐受发挥协同作用从而改善了疫苗的抗肿瘤功能。此外，该疫苗包含人IgK链前导信号肽(sig)可有效促进基因的真核表达，而人IgG Fc段则增强了融合基因的抗原性且利于鉴定，引入GPI锚定蛋白达到增强免疫识别的作用，可在激发细胞免疫反应上占优。研究表明，本发明的治疗性复合基因疫苗安全性有效性较佳，可作为HPV58型阳性相关肿瘤及其癌前病变免疫治疗的候选疫苗。
图 1 是 PVAXl-HPV58mE6E7FcGB 质粒双酶切鉴定图，图中 M :DNA marker (DL5000)， 1 :PVAXl-HPV58mE6E7FcGB 质粒，2 :PVAXl_HPV58mE6E7FcGB 质粒经 NheI 和 RneI 双酶切鉴定结果，3 :PVAXl-HPV58mE6E7FcGB质粒经NheI和PvuI双酶切鉴定结果。图2是瞬时转染PVAXl-HPV58mE6E7FcGB的细胞免疫荧光检测图，图中A FITC (物镜 40 X)，B :PE (物镜 40 X)，C :FITC+PE (物镜 40 X)。图3是瞬时转染PVAXl-HPV58mE6E7FcGB的细胞流式细胞术检测图，图中A =PVAXl对照组(FITC+PE，红色荧光+绿色荧光)，B :PVAXl-HPV58mE6E7FcGB实验组 (FITC+PE，红色荧光+绿色荧光)，R1 总细胞数，R2 显色绿色荧光(FITC)细胞占总细胞数的比例，R3 显示红色荧光(PE)细胞占总细胞数的比例，R4 显示双色(红、绿)荧光细胞占总细胞数的比例。图4是融合蛋白突变前后氨基酸位点比较图，图中序列1是突变前序列 HPV58E6E7，序列2是突变后序列HPV58mE6E70图5是PVAXl-HPV58mE6E7FcGB疫苗的构建流程图。图6是预防模型免疫示意图。图7是治疗模型免疫示意图。图8是CTL加样示意图。
具体实施例方式HPV58型疫苗的安全性及有效性研究一、PVAXl-HPV58mE6E7FcGB 疫苗构建(如图 5)
免疫治疗的两大关键是合适的抗原及高效的载体。在抗原选择方面，由于HPV的早期基因E6和E7是维持其恶性表型所必需，从病毒开始感染到癌症的进展期，在肿瘤发展的所有阶段均有表达，能诱发机体产生并维持较强的以病毒抗原为靶分子的特异性CTL，因而，迄今仍是研制HPV治疗性疫苗所共同选择的靶抗原。发明人在设计抗原时，首先去除 HPV58型E6和E7基因的终止码，将E6和E7基因融合成HPV58E6E7融合基因。由于HPV E6和E7为癌蛋白，病毒DNA有可能整合入宿主细胞基因组，诱发细胞的恶性转化，具有潜在的致癌风险，出于对DNA疫苗安全性的考虑，在利用E6和E7基因作为靶抗原之前，必须消除E6、E7基因的转化活性所导致的潜在致癌风险，以保证疫苗的安全性。对E6、E7基因的转化活性位点进行点突变是目前消除其转化活性的常用方法。据文献报道，E6第50位上的Leu(亮氨酸)在所有致癌HPV中高度保守，提示其可能在E6蛋白的转化功能中起重要作用；第63和106位上的Cys (半胱氨酸)则位于E6蛋白一对锌指结构的两侧，对其与抑癌基因P53的结合和降解有重要作用；E7除第M位上的Cys和沈位上的Glu (谷氨酰胺) 位于E7蛋白一对锌指结构的两侧外，还有第92位的Cys位于一个单独的锌指结构上，这些锌指结构都可与抑癌基因PRb基因使其降解失活。由于既往文献报道都是突变E6或E7基因中的1-2个点，因此，综合文献报道，本研究首创对HPV58E6E7基因融合基因进行6个定点突变以彻底消除其转化活性而保留其抗原性，最大程度确保疫苗的安全性。即将E6蛋白上的第50、63和106位氨基酸和E7蛋白上的第MJ6和92位氨基酸，都突变成Gly (甘氨酸)，构建了 HPV58mE6E7(突变后)融合基因(编码的融合蛋白突变前后氨基酸位点比较见图4)。通过对突变前HPV58E6E7 (序列表SEQ. ID. No. 1的碱基序列，1-447位为E6基因， 448-741位为E7基因)和突变后HPV58mE6E7 (序列表SEQ. ID. No. 2的碱基序列，点突变处 148-150 位 tta->ggt、187-189 位 tgt->ggt、316_318 位 tgt_>ggt、517_519 位 tgc_>ggc、 523-525位gag->ggg、721-723位tgc->ggc)融合基因转化活性实验的对比分析，证实了点突变后的HPV58mE6E7融合基因已消除了转化活性，可作为HPV58型新型治疗性疫苗研制的靶抗原。随后，发明人将已证实消除转化活性的HPV58mE6E7融合基因片段插入 pCI-Fc-GPI载体中，构建了过渡性真核质粒pCI-sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI，再将 sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI片段从pCI载体上切下来，形成一段包含人IgK链前导信号肽 (sig)、HPV58mE6E7融合基因、人IgG-Fc段和糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定信号肽的复合基因片段——sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI。发明人前导肽的设计选用hvitrogen公司的pSecTag2 哺乳动物表达载体公布的信号肽序列，它是Ig κ链V-J2-C区域的分泌信号序列，并在起始密码子ATG前加入了 Kozak序列，对基因在真核细胞内获得有效表达起到了促进的作用。之后发明人将HPV58mE6E7抗原与人IgG Fc段进行融合表达。人IgG Fc段能与免疫效应细胞表面的Fc γ受体结合，起到了免疫黏附素的作用。由于DC和NK细胞表面带有Fc γ受体，IgG Fc段与DC和NK细胞结合后，就能加强免疫应答的抗原呈递功能，发挥其调节免疫效应、抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用以及激活吞噬细胞的作用等，并可延长重组蛋白的半衰期，增强了 HPV58mE6E7的抗原性。同时带有Fc段的嵌合蛋白，还可以将Fc段作为检测标签，对HPV58mE6E7-Fc融合蛋白的鉴定带来了很大的方便，特别是在没有HPV58mE6E7 蛋白的商品化抗体的情况下优势更为明显。GPI锚定蛋白是一类通过其羧基末端的糖基化磷脂酰肌(glycosylphosphatidylinositol，GPI)结构锚定于真核细胞膜表面的蛋白。
6它的基本化学结构主要由胆胺甘露糖、葡萄糖胺和肌醇连接而成。肌醇最终通过磷酸基团与细胞膜中的磷脂结构相连，胆胺则与蛋白质的羧基端相连形成GPI锚定蛋白。它们与传统的跨膜型表面蛋白不同，没有跨膜区和胞内部分，不跨越细胞膜脂质双层，只通过其羧基末端的GPI结构锚定于细胞膜上。GPI锚定蛋白合成是在粗面内质网内进行的在内质网的胞浆面，完整的GPI分子转入内质网腔内后与新生蛋白连接形成GPI锚定蛋白。蛋白通过GPI结构锚定于细胞膜表面而不跨越其磷脂膜双层结构。当它与细胞共同孵育时，可自动整合至细胞膜表面，并可保持其生物学活性。本研究利用GPI的目的，就是要将表达的 HPV58mE6E7-Fc融合蛋白抗原锚定在细胞膜上，从而达到增强免疫识别的作用。而且目前的研究认为，以膜形式表达的抗原要比分泌形式表达的抗原，在激发细胞免疫反应的能力上有更大优势。此外，疫苗构建面临的另一个重要问题就是载体。目前常用的负载靶抗原的载体主要为病毒载体和非病毒载体。在构建HPV疫苗常用的病毒载体中，痘苗病毒和腺病毒载体是常用的两种。二者虽然具有抗原性稳定，免疫原性持久，能够同时诱发体液和细胞免疫等优点，但这二者都存在安全性的隐忧。并且存在痘苗病毒在种痘后局部反应较大，重复免疫后容易产生针对痘苗病毒而不是靶抗原的免疫反应，在人接种后有百万分之一发生全身性发痘和种痘后脑炎等并发症倾向；腺病毒存在编码蛋白作为异种抗原易被机体清除，在全身用药时可能产生致命的过敏反应等缺点。因此，这些载体都存在一定局限性。非病毒载体中的PVAXl是hvitrogen公司出品的一种在载体pcDNA3. 1的基础上改建而成的一种真核表达载体，它是由美国食品和药品管理委员会(FDA)推荐的唯一可以应用于人体实验的载体质粒，具有自身体积小、表达容量大的优点。因此，发明人利用本室前期改造的抗原与细胞因子GM-CSF/共刺激分子B7-1 (GM/B7)双亚基可共表达的新型疫苗载体 PVAX1-IRES-GM/B7，将复合抗原片段 sig-HPV58mE6E7-Fc_GPI 插入载体 PVAX1-IRES-GM/B7 的IRES上游，成功构建新型复合基因疫苗PVAXl-sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI-IRES-GM/B7 (简称PVAXl-HPV58mE6E7Fc-GM/B7)并成功实现其真核表达。恶性肿瘤在体内能长期存在的一个重要原因就是免疫耐受。引入GM-CSF不仅可以刺激巨噬细胞生成，还可促进单核巨噬细胞MHC II类分子、粘附分子及其刺激分子的表达，具有激活树突细胞等专职抗原递呈细胞作用；B7-1也可增强抗原提呈效应，有效活化T淋巴细胞成为细胞毒性T细胞(CTL)，是目前最常用的共刺激分子。因此，GM/B7联合应用作为抗原佐剂可以在一定程度上打破免疫耐受，提高肿瘤细胞的免疫原性和对肿瘤相关抗原的免疫力，并且激活特异性和非特异性免疫细胞，活化局部的免疫微环境，直接杀伤肿瘤。通过IRES上游的复合抗原与下游的分子佐剂的共表达，使二者能够协同作用，在一定程度上免疫耐受、发挥比较理想的抗肿瘤作用，成为治疗与HPV58型感染相关的宫颈癌及癌前病变的新型DNA疫苗。二、PVAXl-HPV58mE6E7FcGB 疫苗的鉴定①酶切鉴定PVAXl-HPV58mE6E7FcGM/B7 疫苗质粒经分另Ij 经 Nhe I/Pme I 和 Nhe I/PvuI 双酶切(如图1)鉴定证实，目的片段sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI已连入真核表达载体 PVAX1-IRES-GM/B7 中，疫苗质粒 PVAXl-sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI-IRES_GM/B7 构建成功，简称为 PVAXl-HPV58mE6E7FcGB0②瞬时转染细胞的免疫荧光检测
在发明人构建的重组质粒中，HPV58mE6E7基因的羧基端融合了人IgG Fc段基因， 可作为检测融合蛋白表达的标签。用FITC标记的山羊抗人IgG抗体与转染4 后的细胞进行孵育，用以检测IRES上游的插入片段sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI在细胞中的表达情况。IRES下游的GM和Β7. 1融合蛋白经PE标记的兔抗人Β7. 1抗体染色可检测其表达情况。经荧光显微镜观测发现，PVAXl-HPV58mE6E7FcGB组细胞有荧光显示，主要分布于细胞膜上(图2、，且PVAXl-HPV58mE6E7FcGB组上下游分别有绿、红荧光显示，而未转染重组质粒的细胞为阴性，证明插入片段HPV58mE6E7-Fc-GPI及GM/B7能够有效表达。③瞬时转染细胞的流式细胞仪分析瞬时转染4 后的细胞用FITC标记的山羊抗人IgG抗体孵育IRES上游的人 IgG Fc段基因，IRES下游的GM和Β7. 1融合蛋白经PF标记的兔抗人Β7. 1抗体染色后，经流式细胞仪检测结果如图3所示，约有14%的细胞表达(包括单独表达和共表达)IRES上游的sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI融合基因，约有17%的细胞表达(包括单独表达和共表达) IRES下游的GM/B7融合基因。三、PVAXl-HPV58mE6E7FcGB疫苗的具体构建工艺(如图5)1.重组质粒 pCI-sig-HPV58mE6E7-Fc_GPI 的构建及鉴定1. 1重组质粒pGEM-T easy/HPV58mE6E7和真核表达载体pCI-Fc-GPI双酶切及纯化1.1.1 酶切将重组质粒pGEM-T easy/HPV58mE6E7 和载体 pCI-Fc-GPI 分别用 XhoI 和 EcoRI 双酶切，酶切体系如下
PGEM-T easy/HP V58mE6E7
DNA
IOxbuffer
BSA
Xhol
EcoRl
双蒸水
9.5μΙ>
0.5μΙ. IpL Ιμ 33uL
pCI-Fc-GPI 9.5μ 5 μι 0.5μ \μL lμL 33uL
总体积50pL50pL酶切条件37°C水浴4h。1. 1. 2酶切产物的纯化回收酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分离后，按照北京三博远志生物基因技术有限责任公司“胶回收试剂盒”说明书进行纯化回收。1. 2HPV58mE6E7和pCI-Fc-GPI的连接、转化及阳性克隆的鉴定酶切、纯化后的HPV58mE6E7片段与载体pCI-Fc-GPI 16°C连接过夜，转化大肠杆菌E. coli DH5 α。经氨苄青霉素筛选后，菌落PCR挑选阳性克隆；再经NheI和NotI双酶切鉴定，鉴定正确的菌株送北京英骏生物技术有限公司进行测序。1. 2. lHPV58mE6E7 片段与 pCI-Fc-GPI 载体连接
8
连接体系如下
权利要求
1.一种HPV58型治疗性复合基因疫苗，其特征在于该疫苗以HPV58型E6/E7融合基因为靶抗原，以GM/B7作为抗原佐剂；所述HPV58型E6/E7融合基因去除了 HPV58型E6和E7 基因的终止码，同时将E6蛋白上的第50、63和106位氨基酸和E7蛋白上的第MJ6和92 位氨基酸都突变成甘氨酸。
2.根据权利要求1所述的HPV58型治疗性复合基因疫苗，其特征在于所述靶抗原由所述HPV58型E6/E7融合基因片段插入pCI-Fc_GPI载体中，构建过渡性真核质粒 pCI-sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI，再将 sig-HPV58mE6E7-Fc_GPI 片段从 pCI 载体上切下来而得。
3.根据权利要求2所述的HPV58型治疗性复合基因疫苗，其特征在于该疫苗采用的载体为 pVAXl-IRES-GM/B7，它对所述靶抗原 sig-HPV58mE6E7-Fc_GPI 和 GM/B7 可共表达。
4.根据权利要求3所述的HPV58型治疗性复合基因疫苗，其特征在于该疫苗是PVAXl-sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI-IRES-GM/B70
5.根据权利要求1至4任一所述HPV58型治疗性复合基因疫苗的构建方法，其特征在于该方法包括以下步骤<1>制备靶抗原先去除HPV58型E6和E7基因的终止码，将E6和E7基因融合成HPV58mE6E7融合基因，其中，将E6蛋白上的第50、63和106位氨基酸和E7蛋白上的第MJ6和92位氨基酸都突变成甘氨酸；然后，把HPV58mE6E7融合基因片段插入 pCI-Fc-GPI载体中，构建过渡性真核质粒pCI-sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI，再将复合基因片段 sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI 从 pCI 载体上切下来；<2>选择载体选用GM-CSF和B7. 1双亚基共表达的疫苗载体PVAX1-IRES-GM/B7 ；<3>制备疫苗将步骤<1>的复合基因片段sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI插入步骤<2>的疫苗载体PVAX1-IRES-GM/B7的IRES上游，即得HPV58型治疗性复合基因疫苗PVAXl-sig-HPV58mE6E7-Fc-GPI-IRES-GM/B7。
全文摘要
本发明公开了一种HPV58型治疗性复合基因疫苗及其构建方法，该疫苗以HPV58型E6/E7融合基因为靶抗原，以GM/B7作为抗原佐剂；其中，HPV58型E6/E7融合基因去除了HPV58型E6和E7基因的终止码，同时将E6蛋白上的第50、63和106位氨基酸和E7蛋白上的第24、26和92位氨基酸都突变成甘氨酸。本发明提供的HPV58型治疗性复合基因疫苗安全性高、免疫作用强、抗肿瘤理想，为治疗与HPV58型感染相关的宫颈癌及癌前病变提供了更好的选择，尤其适合HPV58型高感染的中国和亚洲宫颈癌患者。
文档编号C12N15/62GK102228698SQ201110176858
公开日2011年11月2日 申请日期2011年6月28日 优先权日2011年6月28日
发明者于继云, 李力, 王鹤 申请人:广西医科大学附属肿瘤医院