专利名称：同时检测人ebv、bkv和 cmv的三重实时荧光定量pcr方法及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及医学分子生物检测技术。特别是一种可同时检测人EBV、BKV和CMV的三重实时荧光定量PCR方法及试剂盒。可应用于移植后病人或其他免疫抑制状态下病人血清或其他样品中三种病毒载量的同时监测。
背景技术：
器官移植是现代医学的标志性学科之一。自1959年首例肾移植成功以来目前世界上已有70多万尿毒症患者接受了器官移植而获得新生，而且这个数字还在以每年近5万的速度增加。截至2003年，我国累计完成肾脏移植5万多例，现在每年完成超过5000例， 数量仅次于美国位居世界第二位。中国约有100多万尿毒症患者，每年还有近12万的新增病人。对这些患者，肾脏移植是目前最重要的治疗手段。然而移植肾脏的长期存活，始终是肾移植成功与否的主要问题。感染是器官移植手术后重要的并发症之一，也是造成器官移植失败的重要原因。 在移植早期，感染造成的死亡率达40% -78%。随着新的免疫抑制药物的出现及其联合应用，使单一药物用量有所下降，从而使感染引起的移植早期死亡率显著下降。尽管如此，在导致器官移植受者死亡的原因中，感染仍居首位，其中病毒感染占很大的比例。移植后病毒感染早期可能没有明显的临床表现，对移植肾的损伤也不易被发现，感染后期却会影响移植肾的功能。同时，不同的病毒感染，往往需要不同的治疗方案才能奏效，因此，尽早诊断和预防病毒感染，同时进行病毒载量与感染情况的不断监测，对降低肾移植后病毒感染的危害有很大的临床意义。巨细胞病毒(Cytomegalovirus CMV)，EB 病毒，Epstein-Barr virus (EBV)以及 BK病毒BK(p0ly0maViruS BKV)是实体器官移植后最常见的病毒感染。即使在无症状的感染情况下，也会对移植器官造成影响。目前已经有多种检测方法用于病毒滴度或载量的检测。最常用的为免疫学方法和定量PCR方法。然而这些方法都只能同时检测一种病毒感染情况，病人要想了解这三种病毒的感染情况，至少得做三个检测。最近有前瞻性研究表明， 这三种病毒存在共感染的情况，如果能有一种同时检测这三种病毒载量的方法，将会使检测过程变得方便、快速。实时焚光定量PCR技术(Real-time quantitative Polymerase Chain Reaction， Real Time PCR)以其快速、灵敏、特异、重复性好等特点前最常用病毒基因载量检测方法之一，广泛的应用在各种病毒上。特别是Taqman探针技术，应用更加广泛。在移植相关病毒检测领域目前已经有成熟的CMV，BKV, EBV病毒Taqman探针定量PCR检测试剂盒，均能够准确迅速的检测病毒的载量。然而如前所述，这些检测试剂盒均只能检测一个靶标。多重荧光定量PCR技术是在荧光定量PCR基础上发展起来的一个新技术，它强调在同一个反应体系里同时扩增多个靶标。最近已有多项研究将多重定量PCR技术应用于病毒诊断检测领域。在移植后病毒检测方面，Kaoru Wada等用多重定量PCR技术，同时检测27例造血干细胞病人和19例肝移植病人全血样品中的HHV-6病毒，CMV以及EBV病毒共计303份样品，结果显示多重PCR体系与单一扩增结果在灵敏度和特异性方面基本相同。 YasuhitoFunahashi等用多重定量PCR技术同时检测BKV病毒、JCV病毒以及腺病毒，同样取得良好结果。这些结果都说明了多重PCR技术用于病毒检测可靠性。但是到目前为止， 尚无报道有同时检测CMV病毒，EBV病毒以及BKV病毒的试剂盒。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能同时检测CMV病毒，EBV病毒以及BKV病毒的多重定量Taqman PCR方法，同时基于该方法提供相应的试剂盒。该试剂盒可用于人全血或尿液标本的检测。一种同时检测人EBV、BKV和CMV的三重实时荧光定量PCR方法，其特征在于，所述实时荧光定量PCR的反应体系中同时采用以下三套引物及探针CMV-FP =ATC AAC ATA AGG ACT TTT CAC ACT TT,CMV-RP :GAA TAC AGA CAC TTA GAG CTC GGG GT,CMV-探针:CTG GCC AGC ACG TAT CCC AAC AGC A-BHQl ；EBV-FP :GGA ACC TGG TCA TCC TTT GC,EBV-RP :ACG. TGC. ATG. GAC. CGG. TTA. AT,EBV-探针CGC. AGG. CAC. TCG. TACTGC. TCG. CT-BHQl ；BKV-FP :AGT GGA TGG GCA GCC TAT GTA,BKV-RP :TCA TAT CTG GGT CCC CTG GA,BKV-探针A GG TAG AAG A GG TTA GGG TGT TTG ATG GCA CA G-BHQ2 ；CMV-探针，EBV-探针和BKV-探针的5，端标记的荧光素不同，分别为FAM，HEX和 ROX。所述实时荧光定量PCR的体系如下2XQuantitech Multiplex PCR NoRox Master Mix :12.5ul，5uM CMV-FP :0.5ul, 5uM CMV-RPO. 5ul, uM CMV-探针 lul，5uM EBV-FP 0. 5ul,5uM EBV-RP 0. 5ul,5uM EBV-探针 lul，5uMBKV-FP 0. 5ul，5uM BKV-RP 0. 5ul，5uM BKV-探针 lul，待测模板 1 !3ul，补充双蒸水至25ul。所述实时荧光定量PCR的反应程序如下Step 1 95 °C 15min,Step 2 94°C 60s,Step 3 60°C 60s,Step 4 读数，Go to step 2 for 40 个循环。同时检测人EBV、BKV和CMV病毒的三重实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于包括如以下核苷酸序列所示的引物及荧光探针CMV-FP =ATC AAC ATA AGG ACT TTT CAC ACT TT,CMV-RP :GAA TAC AGA CAC TTA GAG CTC GGG GT,CMV-探针:CTG GCC AGC ACG TAT CCC AAC AGC A-BHQl ；EBV-FP :GGA ACC TGG TCA TCC TTT GC,
EBV-RP :ACG. TGC. ATG. GAC. CGG. TTA. AT,EBV-探针CGC. AGG. CAC. TCG. TACTGC. TCG. CT-BHQl ；BKV-FP :AGT GGA TGG GCA GCC TAT GTA,BKV-RP :TCA TAT CTG GGT CCC CTG GA,BKV-探针A GG TAG AAG A GG TTA GGG TGT TTG ATG GCA CA G-BHQ2 ；CMV-探针，EBV-探针和BKV-探针的5，端标记的荧光素不同，分别为FAM，HEX和 ROX。还包括EBV、BKV和CMV病毒基因的三种病毒，每种病毒分别6个浓度梯度的18个标准品。所述标准品的浓度梯度分别为1 X IO6拷贝/ul，1 X IO5拷贝/ul，1 X IO4拷贝/ul， IX IO3 拷贝 /ul，lX102 拷贝 /uiaxio1 拷贝 /ul。还包括病毒DNA提取试剂。还包括实时荧光定量PCR扩增所需的PCR缓冲液、Taq酶，dNIPs。所述引物、荧光探针、PCR缓冲液、Taq酶和dNII^s混合呈PCR预混液。本发明根据三种病毒的基因组序列特征，分别设计三种病毒的特异性引物和探针，探针分别用三种不同荧光素标。经试验证明，三套探针引物同时扩增待测模板或人工配置的验证标准品，都能够特异地正确反映三种病毒在样品中的存量，且互不干扰。根据设计得到的三套引物及荧光探针，本发明提供了实时荧光定量PCR方法和试剂盒，并提供了优化的PCR体系和程序。当然本领域技术人员根据实时荧光定量PCR的一般要求可以调整PCR体系和程序，也同样能够实现检测的目的。在本发明提供的试剂盒的一种优选实施方式中，在试剂盒中装入包括含有EBV、 BKV和CMV三种病毒模板的呈浓度梯度的6份标准品，用于制备标准曲线。为了更进一步提高试剂盒的方便程度，在制备的一些试剂盒中，装入病毒DNA提取试剂，实时荧光定量PCR所需的缓冲液，Taq酶，dNTPs等试剂。在一个优选实施例中，优选将引物，探针，缓冲液，Taq酶，dNTPs等试剂按比例混合制成预混液，用于检测时，加入待测模板即可。
图1单重扩增系统与三重扩增系统扩增三种病毒标准品建立的标准曲线
具体实施例方式实施例1三种病毒引物以及Taqman探针的设计和体系优化根据NCBI公布的CMV、EBV和BKV病毒基因组序列，使用Primer Express 3 (Applied Biosystems)以及 Primer Premier 5 (Premier Biosoft International)弓|物设计软件，所设计引物以及探针序列如表1所示表1所设计的检测引物和荧光标记
权利要求
1.同时检测人EBV、BKV和CMV的三重实时荧光定量PCR方法，其特征在于，所述实时荧光定量PCR的反应体系中同时采用以下三套引物及探针CMV-FP =ATC AAC ATA AGG ACT TTT CAC ACT TT,CMV-RP :GAA TAC AGA CAC TTA GAG CTC GGG GT,CMV-探针:CTG GCC AGC ACG TAT CCC AAC AGC A-BHQl ；EBV-FP :GGA ACC TGG TCA TCC TTT GC,EBV-RP :ACG. TGC. ATG. GAC. CGG. TTA. AT,EBV-探针CGC. AGG. CAC. TCG. TACTGC. TCG. CT-BHQl ；BKV-FP :AGT GGA TGG GCA GCC TAT GTA,BKV-RP :TCA TAT CTG GGT CCC CTG GA,BKV-探针A GG TAG AAG A GG TTA GGG TGT TTG ATG GCA CA G-BHQ2 ；CMV-探针，EBV-探针和BKV-探针的5，端标记的荧光素不同，分别为FAM，HEX和R0X。
2.根据权利要求1所述的三重实时荧光定量PCR方法，所述实时荧光定量PCR的体系如下2XQuantitech Multiplex PCR NoRox Master Mix :12.5ul，5uM CMV—FP :0.5ul，5uM CMV-RPO. 5ul,uM CMV-探针 lul，5uM EBV-FP 0. 5ul，5uM EBV-RP 0. 5ul，5uM EBV-探针 lul， 5uMBKV-FP 0. 5ul，5uM BKV-RP 0. 5ul，5uM BKV-探针 lul，待测模板 1 3ul，补充双蒸水至 25uL·
3.根据权利要求1所述的三重实时荧光定量PCR方法，所述实时荧光定量PCR的反应程序如下Step 1 95 °C 15min, Step 2 94°C 60s, Step 3 60°C 60s,Step 4 读数，Go to step 2 for 40 个循环。
4.同时检测人EBV、BKV和CMV的三重实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于包括如以下核苷酸序列所示的引物及荧光探针CMV-FP =ATC AAC ATA AGG ACT TTT CAC ACT TT,CMV-RP :GAA TAC AGA CAC TTA GAG CTC GGG GT,CMV-探针:CTG GCC AGC ACG TAT CCC AAC AGC A-BHQl ；EBV-FP :GGA ACC TGG TCA TCC TTT GC,EBV-RP :ACG. TGC. ATG. GAC. CGG. TTA. AT,EBV-探针CGC. AGG. CAC. TCG. TACTGC. TCG. CT-BHQl ；BKV-FP :AGT GGA TGG GCA GCC TAT GTA，BKV-RP :TCA TAT CTG GGT CCC CTG GA,BKV-探针A GG TAG AAG A GG TTA GGG TGT TTG ATG GCA CA G-BHQ2 ；CMV-探针，EBV-探针和BKV-探针的5，端标记的荧光素不同，分别为FAM，HEX和R0X。
5.根据权利要求4所述的三重实时荧光定量PCR试剂盒，还包括EBV、BKV和CMV病毒基因的三种病毒，每种病毒分别6个浓度梯度。
6.根据权利要求5所述的三重实时荧光定量PCR试剂盒，所述标准品的浓度梯度分别为 IX IO6 拷贝 /ul，IX IO5 拷贝 /ul，IX IO4 拷贝 /ul，IX IO3 拷贝 /ul，IX IO2 拷贝 /ul， IXlO1 拷贝 /ul。
7.根据权利要求4所述的三重实时荧光定量PCR试剂盒，所还包括病毒DNA提取试剂。
8.根据权利要求4所述的三重实时荧光定量PCR试剂盒，还包括荧光实时定量PCR扩增所需的PCR缓冲液、Taq酶和dNIPs。
9.根据权利要求8所述的三重实时荧光定量PCR试剂盒，所述引物、荧光探针、PCR缓冲液、Taq酶和dNII^s混合呈PCR预混液。
全文摘要
本发明“同时检测人EBV、BKV和CMV的三重实时荧光定量PCR方法及试剂盒”，属于医学分子生物检测技术。采用自己设计的三种病毒的三套引物和探针同时检测待测样本，试验证明，三套探针引物同时扩增待测模板或人工配置的验证标准品，都能够特异地正确反映三种病毒在样品中的存量，且互不干扰。
文档编号C12Q1/68GK102363818SQ20111017710
公开日2012年2月29日 申请日期2011年6月28日 优先权日2011年6月28日
发明者李全, 焦守恕 申请人:同昕生物技术(北京)有限公司