专利名称：一种血清MICA蛋白及其mRNA的检查方法
技术领域：
本发明涉及一种血清MICA蛋白及其mRNA的检查方法。
背景技术：
自上世纪50年代美国成功实施世界上首例肾移植以来，器官移植作为一项划时代的新技术在过去的50多年中得到了蓬勃发展，特别是随着八十年代末免疫抑制剂的出现，更是极大地提高了器官移植的成功率和受者的存活率，至今全球大约已经有60多万患者接受了包括肾、肝、心在内的器官移植手术。我国从上世纪60年代开展器官移植以来，至2006年全国年器官移植数已位居全球第二位，取得了长足的进步和发展。移植物发生免疫排斥反应是自器官移植出现后就一直困扰着国内外学者的最大瓶颈，虽然移植免疫机制的研究在不断深入，大量新免疫抑制药物在不断涌现，但是不可否认目前国内外依然面临着如移植后移植物发生免疫排斥机率仍然较高，免疫抑制剂费用昂贵及长期应用后发生肿瘤、感染的机会大大增加等诸多问题，因此对移植免疫的研究依然是最关键的课题之一。近来美国学者在一些肾移植术前和术后患者的血清中均发现了抗MICA蛋白抗体，随后又在出现排斥反应被切除的移植肾中发现了更高滴度的该抗体，提示此类患者在肾移植前体内存在同种异型MICA抗原的预致敏，且抗MICA蛋白抗体在肾移植后发生的排斥反应中可能起着重要作用，但其参与免疫反应的机制仍然不清楚。因此，从血清中检查MICA蛋白及其mRNA的方法，为进一步研究肝移植等器官移植手术的排斥反应，有重要意义。MICA (major histocompatibility complex class I chain-related gene A)·基因又称为MHC-I链相关基因A，此基因与经典HLA-I类基因具有较高的同源性，但功能不同。MICA位于HLA-B位点着丝粒端约46kb处，全长11 722bp，比经典HLA-I类基因长。其编码产物是一条高度糖基化的蛋白质分子，结构与经典的HLA-I类分子a链相似，包括3个胞外结构域al、a2和a3，以及跨膜区和胞内区，构型很稳定。MICA基因呈高度多态性，存在于人、灵长类、狗、羊、牛和猪中，但不存在小鼠和大鼠体内，其主要表达于内皮细胞、树突状细胞、成纤维细胞、上皮细胞和肿瘤细胞中。
发明内容
本发明的目的在于提供一种血清MICA蛋白及其mRNA的检查方法，为进一步研究肝移植等器官移植手术的排斥反应，提供支持。为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案
本发明一种血清MICA蛋白及其mRNA的检查方法，包括以下步骤
步骤一
取人体的静脉血存于_80°C冰箱中待检测；
步骤二
血清MICA蛋白含量的检测采用western blot法a.3ml静脉全血离心后提取血清1ml，用ELISA法进行蛋白定量，PVDF膜在5%脱脂奶粉溶液中室温孵育I小时以封闭膜上的非特异结合；
b.将上述准备好的样品液和预染蛋白marker分别上样，进行变性聚丙烯酰胺不连续凝胶电泳分离蛋白；
c.蛋白质转移到PVDF膜，按Bio-Rad蛋白转移装置说明组装滤纸凝胶纤维素夹层，30mA恒流条件下，4°C转移过夜；
d.PVDF膜在5%脱脂奶粉溶液中室温孵育I小时以封闭膜上的非特异结合蛋白，封闭过的膜加入抗MICA —抗，室温孵育I. 5小时，抗原抗体结合，加入HRP标记的二抗，室温孵育膜I小时；
e.pvdf膜与化学发光底物孵育，经X胶片曝光显影，图片扫描保存为电脑文件；
步骤三
血清或者细胞内MICA mRNA表达水平的检测
a.提取RNA:3ml静脉全血离心后提取血清Iml；
b.逆转录合成cDNA第I链及第2链；
c.将逆转录合成的cDNA进行PCR扩增在50ul的反应体系中加入Iul上述cDNA、2. 5ul Taq酶和2. 5ul抗Taq酶，5’端引物序列为ATGCCCCAGTCCTCCAGA，3’端引物为GTGGCATCCC TGTGGTCA,内参基因选择为beta-actin，PCR周期设置为94°C变性I分钟，64°C复性I分钟,聚合过程45秒,进行30个周期的扩增；采用BigDye Terminator Cyclesequencing kit and Abi Prism 310试剂盒测定扩增的DNA产物,与内参基因对比的水平即MICA mRNA的表达水平。与现有技术相比本发明的有益效果是本发明能够快速、便捷、准确的检查出血清中的MICA蛋白及其mRNA，为进一步研究肝移植等器官移植手术的排斥反应，提供支持。
具体实施例方式本发明一种血清MICA蛋白及其mRNA的检查方法，包括以下步骤
步骤一
取人体的静脉血存于_80°C冰箱中待检测；
步骤二
血清MICA蛋白含量的检测采用western blot法
a.3ml静脉全血离心后提取血清1ml，用ELISA法进行蛋白定量，PVDF膜在5%脱脂奶粉溶液中室温孵育I小时以封闭膜上的非特异结合；
b.将上述准备好的样品液和预染蛋白marker分别上样，进行变性聚丙烯酰胺不连续凝胶电泳分离蛋白；
c.蛋白质转移到PVDF膜，按Bio-Rad蛋白转移装置说明组装滤纸凝胶纤维素夹层，30mA恒流条件下，4°C转移过夜；
d.PVDF膜在5%脱脂奶粉溶液中室温孵育I小时以封闭膜上的非特异结合蛋白，封闭过的膜加入抗MICA —抗，室温孵育I. 5小时，抗原抗体结合，加入HRP标记的二抗，室温孵育 膜I小时；
e.pvdf膜与化学发光底物孵育，经X胶片曝光显影，图片扫描保存为电脑文件；步骤三
血清或者细胞内MICA mRNA表达水平的检测
a.提取RNA:3ml静脉全血离心后提取血清Iml；
b.逆转录合成cDNA第I链及第2链；
c.将逆转录合成的cDNA进行PCR扩增在50ul的反应体系中加入Iul上述cDNA、2. 5ul Taq酶和2. 5ul抗Taq酶，5’端引物序列为ATGCCCCAGTCCTCCAGA，3’端引物为GTGGCATCCC TGTGGTCA,内参基因选择为beta-actin，PCR周期设置为94°C变性I分钟，64°C复性I分钟,聚合过程45秒,进行30个周期的扩增；采用BigDye Terminator Cyclesequencing kit and Abi Prism 310试剂盒测定扩增的DNA产物,与内参基因对比的水平即MICA mRNA的表达水平。利用本发明的方法，引深 的有益效果是，可以对比出器官移植前后血清中的MICA蛋白及MICA mRNA的表达水平，为进一步研究肝移植等器官移植手术的排斥反应，提供支持。
权利要求
1.一种血清MICA蛋白及其mRNA的检查方法，其特征在于包括以下步骤 步骤一 取人体的静脉血存于_80°C冰箱中待检测； 步骤二 血清MICA蛋白含量的检测采用western blot法 a.3ml静脉全血离心后提取血清1ml，用ELISA法进行蛋白定量，PVDF膜在5%脱脂奶粉溶液中室温孵育I小时以封闭膜上的非特异结合； b.将上述准备好的样品液和预染蛋白marker分别上样，进行变性聚丙烯酰胺不连续凝胶电泳分离蛋白； c.蛋白质转移到PVDF膜，按Bio-Rad蛋白转移装置说明组装滤纸凝胶纤维素夹层，30mA恒流条件下，4°C转移过夜； d.PVDF膜在5%脱脂奶粉溶液中室温孵育I小时以封闭膜上的非特异结合蛋白，封闭过的膜加入抗MICA —抗，室温孵育I. 5小时，抗原抗体结合，加入HRP标记的二抗，室温孵育膜I小时； e.pvdf膜与化学发光底物孵育，经X胶片曝光显影，图片扫描保存为电脑文件； 步骤三 血清或者细胞内MICA mRNA表达水平的检测 a.提取RNA:3ml静脉全血离心后提取血清Iml； b.逆转录合成cDNA第I链及第2链； c.将逆转录合成的cDNA进行PCR扩增在50ul的反应体系中加入Iul上述cDNA、2. 5ul Taq酶和2. 5ul抗Taq酶，5’端引物序列为ATGCCCCAGTCCTCCAGA，3’端引物为GTGGCATCCC TGTGGTCA,内参基因选择为beta-actin，PCR周期设置为94°C变性I分钟，64°C复性I分钟,聚合过程45秒,进行30个周期的扩增；采用BigDye Terminator Cyclesequencing kit and Abi Prism 310试剂盒测定扩增的DNA产物,与内参基因对比的水平即MICA mRNA的表达水平。
全文摘要
本发明公开了一种血清MICA蛋白及其mRNA的检查方法，包括以下步骤步骤一取人体的静脉血存于-80℃冰箱中待检测；步骤二血清MICA蛋白含量的检测采用westernblot法；步骤三血清或者细胞内MICAmRNA表达水平的检测。本发明提供了一种血清MICA蛋白及其mRNA的检查方法，为进一步研究肝移植等器官移植手术的排斥反应，提供支持。
文档编号C12Q1/68GK102914655SQ20111022354
公开日2013年2月6日 申请日期2011年8月5日 优先权日2011年8月5日
发明者曹利平, 丁国平 申请人:浙江大学