专利名称：一种人神经生长因子的重组变异体及其制备方法
一种人神经生长因子的重组变异体及其制备方法人神经生长因子(hNGF)是人体中一种对神经修复机能有调节作用的生物活性因子，对促进神经系统的生长，损伤神经的再生具有决定性作用。目前hNGF作为药品国内外均未上市，只有我国批准了鼠源NGF临床应用，但鼠源NGF因种属差异及病毒污染的威胁而终将被重组产品替代。用基因工程生产重组人神经生长因子是唯一的途径。rhNGF具有重要临床价值，将填补国际神经修复药物的空白。我国每年有上百万神经损伤病人，市场前景可观。我们发明了一种通过蛋白质工程改造获得的hNGF重组变异体及其制备方法。天然活性的人神经生长因子末端为 Ser-Ser-Ser-Arg-Pro-Ile-Phe-His-Arg-Gly-Glu-Phe-Ser-Val-Cys-Asn-Ser等。我们通过对其分子结构的深入研究,提出了 hNGF重组变异体的新结构，此重组变异体(rhNGF)的特征在于重组表达的hNGF肽段从N端第一个氨基酸开始少了 S丝氨酸、S丝氨酸、S丝氨酸、H组氨酸、P脯氨酸、I异亮氨酸、F苯丙氨酸、H组氨酸、R精氨酸、G甘氨酸等10个氨基酸，多了 G甘氨酸、A丙氨酸二个氨基酸，并从E谷氨酸、F苯丙氨酸、S丝氨酸、V缬氨酸及往后氨基酸开始符合hNGF正常序列，从总体分子量上看少 了 8个氨基酸。我们通过上述对hNGF进行的蛋白质工程改造以期获得药效更好、更稳定的hNGF重组突变体(rhNGF)，其为具有新结构的生物分子，以利于新药开发和临床应用。实例说明I.目的基因的获得为了获得人NGF重组变异体的cDNA，我们采用全基因合成的方法获得rhNGF的cDNA。全基因合成采用分段合成的方法进行。基因序列设计则根据我们的分子设计和参考文献报道的hNGF的基因序列。我们设计的hNGF基因序列的5’端含有Kpnl酶切位点及编码羟胺切割位点的序列，3’端含有Xbal酶切位点和终止密码TGA。合成基因设计序列见图I。图I. rhNGF合成基因设计序列
5’AAC GGC GCA GAA TTC TCG GTG
TGT GAC AGT GTC AGC GTG TGG GTT GGGGAT AAG ACC ACC GCC ACA GAC ATC AAGGGC AAG GAG GTG ATG GTG TTG GGA GAGGTG AAC ATT AAC AAC AGT GTA TTC AAACAG TAC TTT TTT GAG ACC AAG TGC CGG
GAC CCA AAT CCC GTT GAC AGC GGG TGCCGG GGC ATT GAC TCA AAG CAC TGG AACTCA TAT TGT ACC ACG ACT CAC ACC TTTGTC AAG GCG CTG ACC ATG GAT GGC AAGCAG GCT GCC TGG CGG TTT ATC CGG ATAGAT ACG GCC TGT GTG TGT GTG CTC AGCAGG AAG GCT GTG AGA TGA TCT AGA2.基因序列测定将人工合成的rhNGF的cDNA，插入载体pThioHis A，用合成的测序引物进行正向测序(测序仪ABI PRISM) ο将测序图谱用计算机读序，得到cDNA序列并翻译成对应氨基酸，结果我们设计的hNGF的cDNA和氨基酸序列一致。表明我们克隆得到的rhNGF的cDNA是正确的。
3.表达质粒的构建将rhNGF的cDNA插入pBV220中直接表达，表达产物形成不溶性的包含体，需要经过变性和复性得到有活性的rhNGF。因rhNGF含三对二硫键，复性很困难，导致产率很低。为了获得rhNGF的高效可溶性表达,我们把rhNGF与大肠杆菌硫氧还蛋白thioredoxin进行融合表达，thioredoxin可以引导其后的蛋白正确折叠，呈可溶性表达，具天然生物学活性，避免了变性复性的难题。切割方法用的是盐酸羟胺切割法。盐酸羟胺可以特异地切割蛋白中的Asn-Gly肽键，产生N端为Gly的多肽。我们发现rhNGF多肽中不含羟胺切割位点Asn-Gly，故我们选定轻胺切割位点Asn-Gly为连接点与thioredoxin融合表达rhNGF。表达的融合蛋白用轻胺切割后释放出rhNGF，其起始氨基酸为Gly，此后的氨基酸序列与rhNGF序列一致。Gly与Met性质相似，放在N端均不影响蛋白的活性，况且hNGF的N端氨基酸对活性不重要，其N端8个氨基酸在人体内首先要被水解掉以实现功能。羟胺是人体内的正常代谢产物，盐酸羟胺成本低，切割特异性好，切割效率高，适合工业化生产。我们选用质粒pThioHis A作为表达载体(Invitrogen公司产品)，它含有启动子Ptrc promotor、thioredoxin前导肽及终止子aspA terminator,以及Amp抗性基因。我们将合成的rhNGF cDNA用Kpnl-Xbal双酶切后的片段插入上述质粒的Kpnl-Xbal之间，构建成表达质粒pTHNGF。宿主菌选用大肠杆菌JM109 (购自Invitrogen公司)。大肠杆菌JM109的基因型为recAlsupE44 endAl hsdR17 gyrA96 relAl thi Δ (lac-proAB)F，[traD36proAB+lacIqlacZ Δ Μ15]。将质粒pTHNGF转化入大肠杆菌JM109，即构成工程菌pTHNGF/JM109。将其保存于15%甘油中，冷冻于_70°C，即为原始种子库。4. rhNGF工程菌的检定4. I细菌形态、培养特征、生理生化特性
从原始种子库中取一支甘油保存的pTHNGF/JM109工程菌，接种在LBA培养基中，37°C摇荡培养16小时，再以10%的比例接种到LBA培养基中(LB+0. lmg/ml Amp)，继续培养3小时，以此为种子液进行以下各项检查4. I. I细菌形态用种子液涂布玻片后，革兰氏染色并镜检。工程菌为革兰氏阴性，菌体为直杆状，边缘清晰，两端钝圆，大小基本一致，未见其它杂菌污染。4. I. 2培养特征用种子液划线LBA平板，37°C培养20小时，肉眼可见菌落为圆形，边缘光滑，菌落饱满，表面湿润、光滑，呈乳白色，基质未见色素产生。4. 1.3生理生化特性
能利用葡萄糖、乳糖、甘油作为碳源，不能利用果糖、肌醇。吲哚反应为阳性。V. P.反应呈阴性,不水解明胶。4. 2抗生素抗性特征未转化的宿主菌BL21在LB培养基上生长，在LBA培养基上不生长(Amp :0. Img/ml) ο转化后的工程菌pTHNGF/JM109在LB培养基和LBA培养基上都生长良好。表明工程菌pTHNGF/JM109具有氨苄青霉素的抗性。4. 3质粒酶切图谱分析从上述种子液中提取质粒pTHNGF，进行酶切鉴定。用KpnI-XbaI及KpnI-PstI均可切出370bp的小带,用EcoRI-PstI可切出约340bp的小带,酶切鉴定结果均符合质粒设计，说明质粒PTHNGF构建正确。4. 4工程菌的表达与表达产物的获得将pTHNGF/JM109种子液以I %的比例接种于LBA培养基中，37°C生长至OD6tltl约为O. 5，加入IPTG至ImM作为诱导剂，37°C诱导5小时，收获菌体，洗涤后取样裂解，进行SDS-PAGE电泳分析。可见诱导后的菌体在26kD处比空白对照多出一条浓的蛋白带，与要表达的rhNGF融合蛋白分子量26kD大小相等，经薄层扫描，该条带占菌体总蛋白的10-20 %左右。对表达的菌体进行超声破菌，并高速离心。将沉淀和上清进行SDS-PAGE电泳。可见表达的rhNGF融合蛋白集中在上清中，即以可溶形式表达，具天然活性，不需要经过变性和复性。经过渗透压释放的方法，将大肠杆菌细胞内的可溶rhNGF融合蛋白大部分释放到缓冲液中，羟胺切割后，经Ni螯合层析柱和CM-Sepharose层析柱纯化，即得到纯化的rhNGFο5.表达产物结构确证资料5. I特异性鉴别实验纯化的rhNGF产品做免疫印迹鉴定，结果与抗hNGF抗体呈阳性反应。表明本产品与抗hNGF抗体发生免疫反应。5. 2N末端氨基酸序列分析对纯化的rhNGF进行N端氨基酸序列分析，测序结果表明N端15个氨基酸序列为Gly-Ala-Glu-Phe-Ser-Val-Cys-Asp-Ser-Val-Ser-Val-Trp-Val-Gly即N端氨基酸序列与设计符合。6.活性测定采用鸡胚背根神经节法测定，具体为以DMEM为母液，在含20%鸡血浆和15%鸡胚浸液的培养基中，利用伊莎褐鸡胚腰椎背根神经节，在终浓度为30ng/ml的NGF的刺激下，培养36h。经检测，纯化的rhNGF其生物学活性与鼠源神经生长因子活性在一个数量级，达105u/mg 以上。通过以上步骤，我们对hNGF进行了蛋白质工程改造，以期获得药效更好、生物活 性更稳定的hNGF重组突变体(rhNGF)，以利于人神经生长因子的作用机制研究和临床应用。
权利要求
1.本发明中的人神经生长因子重组变异体(rhNGF)特征在于表达的NGF肽段N端少了 SSSHPIFHRG 10个氨基酸，多了 GA 二个氨基酸，分子量上看少了 8个氨基酸，从EFSV开始同于人神经生长因子正常序列。
2.本发明中人神经生长因子重组变异体(rhNGF)第I位氨基酸为甘氨酸。
3.本发明中人神经生长因子重组变异体(rhNGF)第2位氨基酸为丙氨酸。
4.本发明中切割rhNGF融合蛋白的Asn-Gly肽键用的是羟胺切割法。盐酸羟胺可以特异地切割蛋白中的Ash-Gly肽键，产生N端为Gly的多肽。
5.本发明采用IPTG作为诱导剂诱导表达，采用超声破菌和渗透法释放大部分可溶rhNGF融合蛋白，用Ni螯合层析柱和CM-Sepharose层析柱纯化rhNGF。
6.本发明获得的人神经生长因子重组变异体具有药用价值，可以开发出各种剂型的药品。剂型指粉针、水针、喷雾、含片、胶囊、栓剂等药物剂型。
全文摘要
本发明公开了一种人神经生长因子的重组变异体rhNGF及其制备方法。我们根据分子结构研究设计的人神经生长因子重组变异体(rhNGF)其肽段N端少了SSSHPIFHRG 10个氨基酸，多了GA二个氨基酸，此后从EFSV开始的序列同于人神经生长因子正常序列。采用全基因合成的方法获得rhNGF的cDNA，构建工程菌进行表达，得到rhNGF融合蛋白，用羟胺切割后进行纯化即得到纯化的rhNGF，其具有天然生物活性。
文档编号C12N15/70GK102911265SQ20111022353
公开日2013年2月6日 申请日期2011年8月5日 优先权日2011年8月5日
发明者王革 申请人:王革