专利名称：一种降解蓖麻基润滑油及矿物油的耐盐菌株l-3的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物育种及生态领域，尤其是一种降解蓖麻基润滑油及矿物油的耐盐菌株L-3。
背景技术：
随着全球经济的快速发展，每年都要消耗大量的石油产品，除汽、柴油等成品油外，很大一部分就是用于各种不同领域的润滑油，随着润滑油的广泛使用，人们越来越关注它对环境产生的影响。在使用过程中，润滑油不可避免地会通过泄漏、溢出或不恰当的排放等途径进入环境，而在这些油品中，大部分不能被生物降解，并具有一定的生态毒性，严重污染大气、土壤和水资源，破坏生态环境和生态平衡。据统计，全世界每年约有500 1000 万吨石油基化学品进入生物圈，仅欧共体每年就有60万吨润滑油进入环境。在我国，废油的回收率不足10%，以此估算，每年至少有观 32万吨流入环境，造成极大的资源浪费和环境污染。据报道，矿物润滑油污染地下水的影响可达100年，微量的矿物油会阻碍植物的生长和毒害水生生物，约0. 1 μ g/g的矿物油即可使水生壳类生物减寿20%。目前，润滑油污染土壤的治理方法主要有物理方法、化学方法和生物方法3种。物理方法包括挖掘填埋法、气提吹脱法、电解法、洗涤法和隔离控制法等，主要采用热处理法，即通过焚烧或锻烧， 净化土壤中大部分有机污染物，但同时亦破坏土壤结构和组分，且所用的燃料和设备价格昂贵因此很难实施；化学方法包括氧化剂氧化法、光化学氧化法、热分解法、萃取法和化学棚法等，采用化学浸出和水洗也可以获得较好的除油效果，但所用的化学试剂的二次污染问题限制了其应用。为彻底解决废润滑油对环境造成的污染，许多国家都以极大热情相继进行环境兼容润滑油即可生物降解润滑油的研究。所谓可生物降解润滑油，又称绿色润滑油或环境友好润滑油，是指润滑油必须满足机器工况的要求，即使用性能；润滑油及其损耗产物对生态不造成危害，或在一定程度上为环境所容许，即生态效应，主要包括可生物降解性、生物积聚性、毒性和生态毒性、损耗和可再生资源，其中，生物降解性是反映其生态效应最主要的指标，建立废润滑油生物降解性评定方法对研究可降解性废润滑油具有重要意义。生物修复是指利用微生物及其它生物，将存在于土壤中的有毒有害的油品污染物现场降解成二氧化碳和水或转化成为无害物质的工程技术系统，它是传统的生物处理方法的延伸。生物修复由于能够治理大面积污染而成为一种新型可靠的环保技术，已得到世界环保部门的认可，并引起了工业界的关注，生物修复在治理土壤污染方面的作用己越来越突出。生物修复的类型主要包括微生物对污染土壤的修复、植物对污染土壤的修复及微生物一植物的联合修复，其中微生物对润滑油污染土壤的生物修复是近年来科学家研究的重点ο
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种耐盐性好的降解蓖麻基润滑油的菌株L-3，是一种生长速度快，能以蓖麻基润滑油为唯一碳源的菌种。本发明的目的是通过以下技术方案实现的一种降解蓖麻基润滑油的菌株L-3，菌株L-3的分类名称克雷伯氏菌klebsiella SP.，保藏编号为CGMCC No. 4925，保藏日期2011年06年10日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。而且，菌株L-3对蓖麻基润滑油的降解率为80 % -90 %。而且，菌株L-3 使用的培养基配方ΚΗ2Ρ043· 4g/L，Na2HPO4L 5g/L，(NH4) 2S044. Og/ L，MgSO4O. 7g/L，NaCl 1. 6g/L，酵母粉 0. Olg/L, Tween-800. 6mL,蓖麻基润滑油 5. OmL,蒸馏水 1L，pH 7· 0 7· 2。而且，所述菌株L-3以蓖麻基润滑油为唯一碳源进行生长。而且，所述菌株L-3降解的矿物油包括齿轮油、液压油。而且，所述菌株L-3耐NaCl浓度为7%。本发明的优点和积极效果如下1.本发明利用平板梯度涂布法，从蓖麻榨油车间排污井口采取土样和水样中筛选出能以废弃蓖麻基润滑油为唯一碳源的菌种，该方法操作简便快捷，能显著缩短菌株筛选时间。2.本发明筛选出的降解废弃蓖麻基润滑油的菌株L-3，生长速度快，在最适培养温度和PH条件下，有利于扩大培养，制成菌种发酵剂，投放到污染地进行生态修复。3.本发明对筛选的菌株进行了初步鉴定，通过生理生化及相关菌株鉴定试验，得出菌株具有耐盐性，革兰氏阳性，链球状，无鞭毛，不运动，葡萄糖氧化发酵实验不产酸、不产气，产过氧化氢酶，明胶酶等，初步鉴定为克雷伯菌属。4.以本发明筛选出的降解蓖麻基润滑油的L-3菌株为出发菌株，采用改良的 CEC-L-33-A-93实验方法进行生物降解，在30°C，180r/min，黑暗遮光条件下培养7d后，用四氯化碳进行萃取，采用顶在处检测CH3-CH2-中C-H-键的振动吸收峰，计算出残余油量，得出蓖麻基润滑油的降解率。本方法可缩短降解培养周期，从21d缩短到7d，与其他降解方法相比，实验效率大大提高。
图1为本发明L-3菌株CEC法测试红外光谱图。
具体实施例方式下面结合实施例，对本发明进一步说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的， 不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。本发明的技术路线为将采集的土样和水样用无菌水制成悬浮液，采用平板梯度涂布法进行菌株分离，从中分离出降解效果较好的菌株L-3，再对L-3菌株进行改良的 CEC-L-33-A-93实验，获得较好的降解效果。一种降解蓖麻基润滑油及矿物油的耐盐菌株L-3，其筛选步骤如下1.从蓖麻榨油车间排污井口采取土样和水样，采样所需工具均已灭菌；2.菌株初筛将采集的样品经24h曝气处理后，在无菌操作条件下取少量样品，加入50mL无菌水，搅拌，制成悬浮液，用移液枪取0. ImL悬浮液，放入以废弃蓖麻基润滑油为唯一碳源的筛选培养基平板上(培养基KH2P043. 4g ；Na2HPO4L 5g ； (NH4)2S044. Og ； MgSO4O. 7g ；NaCl 1. 6g ；酵母粉 0. Olg ；Tween-800. 6mL,蓖麻基润滑油 5. OmL,蒸馏水 IOOOmL, pH7. 0 7. 2)，用无菌涂布器连续涂布四个平板，分别放置于30°C恒温培养箱中， 培养2-3d，挑取生长较快和不同菌落形态的菌株，进一步分离纯化复筛，从中筛选出能以废弃蓖麻基润滑油为唯一碳源生长的菌种。3.菌株复筛；将第一次挑选出的菌株分别接种在以蓖麻基润滑油为唯一碳源的平板筛选培养基上进行分离纯化，将平板分别置于30°C恒温培养箱中，培养2-3d，观察结果，再挑选生长较快的不同单菌落，接种到斜面中，培养后，将菌株L-3置于4°C冰箱保藏， 待用。4. L-3菌株的鉴定(1)菌株耐盐性实验在250mL三角瓶中装入IOOmL富集培养基(葡萄糖，3g ；NaCl,5g ；酵母膏，3g ；蛋白胨，3g ；K2HPO4 ·3Η20，2. 7g ；蒸馏水，IOOOmL ；pH为7. 2)，将L-3菌株以相同接种量接入NaCl 质量分数为1%、3%、5%、7%、9%的培养基中，300C，180r/min,培养3d，测定0D600值，其结果见表3。表3L-3菌株的耐盐性
权利要求
1.一种降解蓖麻基润滑油及矿物油的耐盐菌株L-3，其特征在于菌株L-3的分类名称克雷伯氏菌klebsiella sp.，保藏编号为=CGMCC No. 4925，保藏日期2011年06年10 日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
2.根据权利要求1所述的降解蓖麻基润滑油及矿物油的耐盐菌株L-3，其特征在于菌株L-3对蓖麻基润滑油的降解率为80% -90%。
3.根据权利要求1所述的降解蓖麻基润滑油及矿物油的耐盐菌株L-3，其特征在于菌株 L-3 使用的培养基配方=KH2PO4 3. 4g/L, Na2HPO4 1. 5g/L，(NH4)2SO4 4. Og/L, MgSO4O. 7g/L， NaCl 1. 6g/L，酵母粉 0. 01g/L，Tween-80 0. 6mL，蓖麻基润滑油 5. OmL，蒸馏水 1L，pH 7.0 7. 2。
4.根据权利要求1所述的降解蓖麻基润滑油及矿物油的耐盐菌株L-3，其特征在于所述菌株L-3以蓖麻基润滑油为唯一碳源进行生长。
5.根据权利要求1所述的降解蓖麻基润滑油及矿物油的耐盐菌株L-3，其特征在于所述菌株L-3降解矿物油包括齿轮油和液压油。
6.根据权利要求1所述的降解蓖麻基润滑油及矿物油的耐盐菌株L-3，其特征在于所述菌株L-3耐NaCl浓度为7%。
全文摘要
本发明涉及一种降解蓖麻基润滑油及矿物油的菌株L-3，其特征在于菌株L-3的分类名称克雷伯氏菌，保藏编号为CGMCC No.4925，保藏日期2011年06年10日，保藏地址为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。本发明利用平板梯度涂布法，从蓖麻榨油车间排污口附近采取土样和水样，筛选出能以蓖麻基润滑油为唯一碳源生长的微生物，该方法操作简便快捷，筛选出的降解蓖麻基润滑油的菌株L-3生长速度快，在最适培养温度和pH条件下，有利于扩大培养，制成菌种发酵剂，投放到污染环境中进行生态修复。
文档编号C12R1/22GK102352328SQ201110277358
公开日2012年2月15日 申请日期2011年9月19日 优先权日2011年9月19日
发明者何良年, 刘亚琼, 叶锋, 李风娟, 王昌禄, 王玉荣, 陈勉华 申请人:天津南开大学蓖麻工程科技有限公司