专利名称：一种用于检测铜离子的核酸纳米金生物传感器的制作方法
技术领域：
本发明涉及检测领域，具体涉及一种用于检测铜离子的核酸纳米金生物传感器。
背景技术：
目前检测铜离子的主要方法是光谱法，包括原子光谱法、分子吸收光谱法、荧光光谱法，还有电化学分析法和化学传感方法等。原子光谱法应用广泛，检测准确，但需要大型仪器，需要专业技术人员的操作，前处理麻烦。近年来化学传感方法因其极高的灵敏度被广泛应用于各个领域，其中也包括了重金属的检测。但是目前使用的这些方法均涉及到荧光基团的使用，荧光基团容易淬灭，不易保存，且检测时需要使用到荧光检测仪，限制了其应 用范围。近年来，纳米材料的发展为解决这一问题提供了新的思路。纳米金颗粒具有优异的光学性质、电学性质、化学活性和生物兼容性，在生物领域得到广泛应用。研究表明，纳米金溶液的颜色与纳米金颗粒的间距以及纳米金聚集体的大小有关。纳米金颗粒的间距若明显超过其平均直径，纳米金呈分散状态，宏观上表现为红色；该间距若小于平均直径，则纳米金易团聚，呈聚集态，宏观上表现为紫色到蓝色。利用纳米金的这种性质，可设计一系列生化反应以改变纳米金颗粒间的距离，从而实现对靶物质的检测。2007年，Lu等利用依赖铜离子的核酸酶，在核酸酶上标记荧光基团，在其互补的底物序列上标记淬灭基团，当铜离子不存在时，没有荧光；当铜离子存在时，核酸酶切割其互补的底物序列，荧光基团和淬灭基团分离，出现荧光，其灵敏度的线性范围从35nM到20 PM。同年，White等合成了一段具有铜离子特异性的多肽片段(Gly-Gly-Asp-Gly-Gly-Asp-Gly-Gly-Asp-Gly-Gly-Asp-Gly-Gly)，同样通过荧光共振能量转移的原理，来检测铜离子的存在，其检测灵敏度为32y g/L。但是这些方法均牵涉到荧光基团的使用，荧光基团容易淬灭，不易保存，且检测时候需要使用到荧光检测仪，检测成本仍然较高，限制其应用范围。因此，一种能快速检测、不需要仪器使用且灵敏度高的检测方法会极大的满足市场的需求。此发明正致力于此。
发明内容
本发明的目的是克服现有Cu2+检测技术存在的问题和不足，提供一种用于Cu2+快速检测的新工具，即核酸纳米金生物传感器，利用Cu2+存在时，针对铜离子的特异的核酸酶能够切断与他互补的底物这一原理，配合胶体金放大系统，用来检测溶液中Cu2+的存在。并提供该核酸纳米金生物传感器的制备方法。本发明的技术原理是结合有第三段序列的胶体金喷布在金标垫上，用链霉亲和素和标记有生物素的第四段序列反应后，划在硝酸纤维素膜上形成检测线；用链霉亲和素和标记有生物素的第五段序列反应后，划在硝酸纤维素膜上形成质控线。首先将核酸酶和底物以一定比例混合，然后将待测样品加入其中，反应。如果待测样品中含有铜离子，则核酸酶会切断与其互补的底物序列，释放出图I中绿色和紫红色标记的序列部分，这段序列首先经过金标垫，与胶体金颗粒上标记的第三段核酸序列发生互补反应，然后经过检测线，同样与检测线上标记的第四段核酸序列发生互补反应，胶体金颗粒停留在检测线上，从而使得检测线显红色；继续经过质控线，剩余没有反应的胶体金颗粒，其上标记的序列与质控线上标记的第五段核酸序列发生互补反应，使得质控线显红色，为阳性结果。(图3)如果待测样品中没有铜离子，则核酸酶不会切断其互补的底物序列，上样后，由于底物序列被与其互补的酶序列所占据，则不会与胶体金颗粒上标记的序列发生反应，检测线不显色，但胶体金颗粒上标记的序列仍然能与质控线上的序列发生反应，质控线显红色，为阴性结果。如果质控线不显色，不管检测线显色与否，都说明生物传感器本身出现了问题，结果不可信，无效结果。(图3)。根据本发明的技术原理，设计的五段核酸序列是
第一段为铜离子特异性的核酸酶序列，含有35个碱基(SEQ ID NO: I)，第14-35个碱基形成一个回文结构；
第二段为其互补的底物序列，包含48个碱基(SEQ ID N0:2)，5’端与酶完全互补，3’端比酶序列长，为一段单链片段，互补序列含有一个脱氧核糖核苷酸G，它是酶活性的关键部位，酶切位点就位于其5’端；
第三和第四段序列为检测序列，其中第三段序列用于胶体金标记，序列为(5’ -SH-SEQID N0:3-3’)；第四段序列标记在检测线上，序列为(5，- biotin- SEQ ID NO:4 -3，)，底物在未酶切条件下不能与其它两段序列形成夹心结构，而酶切后互补片段变短则能被第三段序列置换形成夹心。这两段序列分别与被酶切后长片段的两端互补(即图I中绿色和紫红色部分)；
第五段序列为质控序列。标记在质控线上，它与胶体金颗粒上标记的第三段序列互补，用于检测生物传感器的稳定性。其序列为(5’ - SEQ ID N0:5-biotin-3，)。本发明所述的核酸纳米金生物传感器包括从左到右依次固定于胶板上的样品垫、玻璃纤维、硝酸纤维素膜和吸水纸；所述玻璃纤维上涂有纳米金标记的核酸序列3，该核酸序列是由巯基修饰并与胶体金偶联形成的，所述硝酸纤维素膜上有质控线和检测线，质控线上固定有核酸序列5，该核酸序列与胶体金颗粒上标记的第三段序列互补，用生物素标记并与链霉亲和素反应后，固定与硝酸纤维素膜上的，用于检测生物传感器的稳定性。检测线上固定有核酸序列4，底物在未酶切条件下不能与其它两端序列形成夹心结构，而酶切后互补片段变短则能被第三段序列置换形成夹心。生物素标记的核酸序列4与链霉亲和素反应后，固定在硝酸纤维素膜上形成检测线。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果
本发明巧妙的把胶体金放大系统和针对铜离子的特异的核酸酶结合起来，设计出了一种高灵敏度、低费用、不需要使用任何仪器的胶体金试纸条生物传感器。既解决了以往检测方法中需要大型仪器的缺陷，又能保证检测灵敏度，而且制备简便、检测迅速，不需要专业的技术人员。
图I铜离子特异性的核酸酶及其底物； 图2试纸条整体结构方案；
图3试纸条检测样品效果图；图4本发明所述核酸纳米金生物传感器检测铜离子的实验技术路线 图5本发明所述核酸纳米金生物传感器检测铜离子的灵敏度结果图； 图6本发明所述核酸纳米金生物传感器检测铜离子的特异性结果图。
具体实施例方式实施例I核酸纳米金生物传感器的制备
I、五种核酸序列的设计
在已有Cu2+依赖酶活性DNAzyme的基础上，对其互补链也就是底物的5’进行延伸，以用于酶切后核酸夹心的检测(见图I)。具体设计序列SEQ ID N0:l 5。2.纳米金(胶体金)的制备
向250ml的圆底烧瓶中称取IOOg O. 01%的HAuCL4溶液，磁力搅拌加热至沸腾；然后向上述溶液中迅速加入4ml 1%的柠檬酸三钠，溶液变为红色后，继续煮沸lOmin，停止加热继续搅拌直至冷却；胶体金溶液4°C避光保存，纳米金通过520nm最大吸光度值鉴定。3. 金标核酸的制备
用ΙΟΟμΙ去离子水溶解IOD核酸序列3，加入到Iml 5倍体积浓缩的胶体金溶液中，40C 24小时；1%的牛血清白蛋白封闭30分钟后，加入NaCl和1%的SDS’分别至终浓度为O. 15Μ和O. 01%, 40C过夜，11500转/分钟离心20分钟，弃上清，沉底用500ul重悬液(20mM Na3PO4, 5% BSA, O. 25% Tween,和10%蔗糖)重悬，重复洗三遍后用200ul的重悬液重新悬浮，制成悬浮液。4.样品垫的处理
玻璃纤维浸泡含有pH9. 0,4. 0% TritonX-100、IOOmM 硼酸、3%PEG4000、1%BSA、2%蔗糖，
0.1% SDS，50. OnM竞争 DNA 探针(SEQ ID NO:6), O. 5ug/ml 鲑鱼精 DNA 的溶液后，37°C烘干备用。5.金标垫的制备
将本发明制备的金标核酸序列3涂于玻璃纤维上，37°C干燥2个小时，制成金标垫，备用。6.硝酸纤维素膜上质控线和检测线的处理
用去离子水溶解IOD的核酸序列5，使其浓度为ΙΟΟμΜ，取15μ1 ΙΟΟμΜ的核酸序列5，加入15μ1 (lmg/ml)链和亲霉素，室温下反应2小时后，采用划膜喷金仪涂于硝酸纤维素膜质控线上，37°C干燥两个小时。用去离子水溶解10D的核酸序列4，使其浓度为ΙΟΟμΜ,取15μ1 ΙΟΟμΜ的核酸序列4，加入15μ1 (lmg/ml)链和亲霉素，室温下反应2小时后，采用划膜喷金仪涂于硝酸纤维素膜检测线上，37°C干燥两个小时。7.胶体金试纸条的组装
将固定有寡核苷酸探针的硝酸纤维素膜、吸水纸、涂有纳米微粒标记寡核苷酸探针的玻璃纤维、样品垫依次固定于胶板上，相邻部分彼此重叠2mm，经切割成宽4mm后即得到本发明所述的核酸纳米金生物传感器。质量控制标准
(I)C线(质控线)出现红色的线证明纳米金生物传感器有效。
(2) T线(检测线)出现红色的线与否，是阳性阴性判别的标准。结果判定标准
(1)C线出现红色的线，同时T线出现红色的线，说明被检样品中Cu2+含量超标；
(2)C线出现红色的线，同时T线没有出现红色的线，说明被检样品中Cu2+含量没有超
标；
(3)C线没有出现红色的线，说明纳米金生物传感器失效。实施例2前述核酸纳米金生物传感器的质量控制与检测效果
采用实施例I所制成的核酸纳米金生物传感器，进行以下实验，验证其检测效果。
I.配制铜离子标准溶液梯度，浓度分别为100. O μΜ, 10. O μ Μ, I. O μ Μ,100. O ηΜ, 50. O ηΜ, 10. O ηΜ, O. O ηΜ，室温保存。2.配制 20. 0μ M 的 Hg2+, Mn2+, Cd2+, Pb2+, Mg2+, Zn2+, Fe2+, Fe3+, Ba2+, Ca2+,Ni2+，Co2+溶液。3. ￠(2. OyL 100.0 μ M 核酸酶、10. O μ L 100. O μ M 酶底物和 190. O μ L 4Χ SSC(ρΗ7. 4)于EP管中，混匀，70°C水浴锅加热2分钟，置于温水中缓慢冷却，此时核酸酶和酶底物的浓度分别为I. O μ M和5. O μ M ;
然后取10. Oy L上述反应溶液与90. Oy L 8 X SSC (ρΗ7. 4)混合，使得核酸酶和酶底物的终浓度分别为100. O ηΜ和500. O ηΜ。分别将15. O μ L工作液和15. O μ L不同浓度的标准品溶液混合，使得核酸酶和酶底物的终浓度分别为50. O ηΜ和250. O ηΜ,缓冲液浓度为4X SSC (ρΗ7. 4)，室温反应30分钟。4.将配置的上样溶液滴在样品垫上，室温；10分钟后观察质控线和检测线的颜色变化。结果显示最低检测线可以达到10. O ηΜ，远超过美国环保署对于饮用水中铜离子的最高含量(20μΜ)的标准。在Cu2+存在的条件下，检测线均显出肉眼可见的红色，并且，随着Cu2+浓度的增加，检测线的颜色也逐渐加深，用金标试纸条读数仪的结果也一致，随着Cu2+浓度的增加，检测线的曲线也逐渐增大，质控线显色。在Cu2+存在的条件下，核酸酶特异性的切开其互补的底物序列，产生待检测的单链核酸序列，从而与胶体金上标记的第三段序列和检测线上划的第四段序列形成夹心结构，使检测线显红色。并且，Cu2+的浓度越高，核酸酶的效率越快，切断的底物序列也随之增加，使得检测线的颜色也逐渐加深。同时，质控线也呈现均一的红色，说明生物传感器的体系正常，结果可信。5.分别将15. O μ L工作液和15. O μ L不同离子的标准品溶液混合，使得核酸酶和酶底物的终浓度分别为50. O ηΜ和250. O ηΜ,缓冲液浓度为4X SSC (ρΗ7. 4)，室温反应30分钟。上述反应溶液滴在样品垫上，室温；10分钟后观察质控线和检测线的颜色变化。结果显示在20. O μ M的条件下，只有Cu2+的检测线显出肉眼可见的红色，Co2+有微弱的红色，其它 Hg2+，Mn2+，Cd2+，Pb2+，Mg2+，Zn2+，Fe2+，Fe3+，Ba2+，Ca2+，Ni2+均不显色。图中左边是实物拍摄图，右边是用传感器读卡仪读出来的相对应的曲线图。该结果显示出了此生物传感器有着良好的特异性。只有在Cu2+存在的条件下，核酸酶才能特异性的切开其互补的底物序列，产生待检测的单链核酸序列，从而与胶体金上标记的第三段序列和检测线上划的第四段序列形成夹心结构，使检测线显红色。同时，质控线也呈现均一的红色，说明生物传感器的体系正常，结果可信。权利要求
1.一种用于检测铜离子的核酸纳米金生物传感器，其特征在于包括两部分 (1)用于检测铜离子的核酸纳米金生物试纸条，由从左到右依次固定于胶板上的样品垫、玻璃纤维、硝酸纤维素膜和吸水纸组成； (2)上样缓冲液体系，由核酸序列SEQID NO T2和核酸杂交液组成； 其中，所述玻璃纤维上涂有纳米金标记的核酸序列，如SEQ ID N0:3所示； 所述硝酸纤维素膜上有质控线和检测线，质控线上固定有用生物素标记并与链霉亲和素反应后的核酸序列，如SEQ ID NO :5所示；所述检测线上固定有用生物素标记并与链霉亲和素反应后的核酸序列，如SEQ ID NO 4所示。
2.根据权利要求I所述的用于检测铜离子的核酸纳米金生物传感器，其特征在于所述SEQ ID NO :3的5’端用巯基修饰，所述SEQ ID NO :4的5’端和SEQ ID NO :5的3’端用生物素修饰。
3.根据权利要求I所述的用于检测铜离子的核酸纳米金生物传感器，其特征在于所述质控线和检测线之间的距离为3 10mm。
4.根据权利要求I所述的用于检测铜离子的核酸纳米金生物传感器，其特征在于所述样品垫、玻璃纤维、硝酸纤维素膜和吸水纸两两之间的相邻部分彼此重叠f5mm。
5.根据权利要求I所述的用于检测铜离子的核酸纳米金生物传感器，其特征在于所述胶体金的粒径为8 lOOnm。
6.权利要求f5中任意一条权利要求所述用于检测铜离子的核酸纳米金生物传感器的制备方法，其特征在于所述纳米金标记核酸序列的方法是 (1)纳米金的制备选用粒径为flOOnm的胶体金颗粒，胶体金采用常规的氯金酸煮沸还原法制备，通过控制还原剂的量在0. oro. 05%以及搅拌速度在100(T50000rpm之间来控制颗粒粒径； (2)纳米金与核酸序列的偶联与封闭老化将巯基修饰的核酸序列加入到1-10倍体积浓缩的纳米金溶液中，混合标记l_48h，用牛血清白蛋白或PEG封闭多余的活性位点，其后加入氯化钠和SDS使其终浓度分别至0. 15M和0. 01%，老化5 30h后，800(Tl6000rpm离心.2(T60min,弃上清，即获得纳米金标记的核酸探针。
7.根据权利要求6所述的中任意一条权利要求所述用于检测铜离子的核酸纳米金生物传感器的制备方法，其特征在于所述样品垫是经过以下处理的采用含表面活性剂、电中性或碱性缓冲液、PEG4000、BSA和蔗糖的混合液浸泡玻璃纤维4h后，37°C烘干过夜。
8.权利要求1飞中任意一条权利要求所述核酸纳米金生物传感器的使用方法，其特征在于是将上样缓冲液体系滴在样品垫上，如果待测样品中含有铜离子，则核酸酶会切断与其互补的底物序列，释放出相应的序列，这序列首先会经过样品垫，与胶体金颗粒上标记的核酸序列发生互补反应，然后经过检测线，同样与检测线上标记的第四段核酸序列发生互补反应，胶体金颗粒停留在检测线上，从而使得检测线显红色；反应物继续经过质控线，剩余没有反应的胶体金颗粒，其上标记的序列与质控线上标记的核酸序列发生互补反应，使得质控线显红色，为阳性结果； 如果待测样品中没有铜离子，则核酸酶不会切断其互补的底物序列，上样后，由于底物序列被与其互补的酶序列占据，不会与胶体金颗粒上标记的序列发生反应，检测线不显色，但胶体金颗粒上标记的序列仍然能与质控线上的序列发生反应，质控线显红色，为阴性结果; 如果质控线不显色，不管检测线显色与否，为无效结果。
全文摘要
本发明公开了一种用于检测铜离子的核酸纳米金生物传感器。本发明所述的核酸纳米金生物传感器是通过铜离子存在时，针对铜离子的特异的核酸酶能够切断与它互补的底物这一原理，配合胶体金放大系统，用于检测铜离子。本发明所述的核酸纳米金生物传感器具有高灵敏度、低费用、不需要使用任何仪器的优点，既解决了以往检测方法中需要大型仪器的缺陷，又能保证检测灵敏度，而且制备简便，检测迅速，不需要专业的技术人员。
文档编号C12Q1/68GK102634571SQ20111031411
公开日2012年8月15日 申请日期2011年10月17日 优先权日2011年10月17日
发明者张文娟, 方志远, 曾令文, 黄婧 申请人:中国科学院广州生物医药与健康研究院