专利名称：生产苹果酸的方法
技术领域：
本发明涉及发酵领域，具体涉及生产苹果酸的方法。
背景技术：
苹果酸，又名羟基丁二酸，是食品工业重要的有机酸产品之一，其具有天然果实的酸味特征，味觉自然丰厚，可作为酸味剂在食品及医药中广泛应用。苹果酸的酸感强度约相当于柠檬酸的1. 2倍，产热量更低，可以替代柠檬酸作为食品添加剂加以应用。目前苹果酸的主要生产工艺为富马酸酶催化工艺和一步发酵工艺。富马酸酶催化工艺是采用富马酸酶催化富马酸一步转化生产苹果酸，因富马酸酶和富马酸原料价格较高，生产受到一定的限制。一步发酵工艺是采用黄曲霉(A^argiBm /Yams)、米曲霉 {Aspergillus orj^e)、改造的酿酒酵母、改造的大肠杆菌等菌种，以葡萄糖为原料生产苹果酸，与富马酸酶催化工艺相比，虽然原料价格较低，但发酵液中苹果酸纯度较低，而从发酵液中提取苹果酸的工艺路线复杂，包括多步酸解、过滤、精制、结晶等多个步骤，产品收率低、纯度低；此外，因提取工艺中使用大量的碳酸钙，还产生大量酸性废水和钙渣排放，造成环境污染。因此，急需一种生产苹果酸的方法。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种生产苹果酸的方法，该方法制得的苹果酸产率高，提取苹果酸工艺简单。为了实现上述为目的，本发明的技术方案为 生产苹果酸的方法，具体步骤为
a.种子活化
将出芽短梗霉(Jareoh1SiiZiwB pullans) NRRL Y-2311-1接种于种子培养基，温度为 23-30°C震荡培养，得活化种子液；所述种子培养基为葡萄糖40-100 g/L、NH4NO3I-5 g/L、 KH2PO4 0. 005-0. 3g/L、ZnSO4 0. 005-0. 3g/L、MgSO4 0. 005-0. 3g/L、玉米菜 0. 05-3 g/L 和 CaCO3 10-50 g/L ；
b.发酵
将步骤a所得活化种子液接种于发酵培养基，温度为23-30°C震荡培养144小时以上，固液分离，收集液体，得发酵液；所述发酵培养基为糖80-120g/L、NH4NO3 l_5g/L、KH2PO4 0. 005-0. 3g/L、ZnSO4 0. 005-0. 3g/L、MgSO4 0. 005-0. 3g/L、玉米菜 0. 05_3g/L 和 CaCO3 10-50 g/L;所述糖为葡萄糖、木糖、玉米秸秆水解液或木质纤维素水解液中的至少一种；
所述玉米秸秆水解液的制备方法是取玉米秸秆，粉碎，加水，用酸调节PH至2. 5，加热至100°C充分水解，然后用碱中和，加入纤维素酶和半纤维素酶，50°C恒温水解，过滤，收集滤液，即得玉米秸秆水解液；
所述木质纤维素水解液的制备方法是取木质纤维，粉碎，用质量分数为7%的硫酸浸泡，再加热至160-200°C充分水解，然后用碱中和，剩余残渣再用质量分数为1的硫酸在温度为180-240°C充分水解，过滤，收集滤液，即得木质纤维素水解液；
c.醇沉
将步骤b所得发酵液用乙醇沉淀，固液分离，收集沉淀，得聚苹果酸；
d.水解
将步骤c所得聚苹果酸进行酸水解，得水解液；
e.浓缩结晶
将步骤d所得水解液浓缩，结晶，得苹果酸。进一步，步骤a中所述出芽短梗霉的接种按照出芽短梗霉与种子培养基的体积比为1 100-1000进行；所述震荡培养为在转速180-300 rpm下培养36-96小时；所述种子培养基为葡萄糖 60-80g/L、NH4NO3 2_4g/L、KH2PO4 0. 05-0. 2g/L、ZnSO4 0. 05-0. 2g/L、MgSO4 0. 05-0. 2g/L、玉米浆 0. 5-2g/L 和 CaCO3 20-50 g/L。进一步，步骤b中所述活化种子液的接种按照活化种子液与发酵培养基的体积比为1:10-20进行；所述震荡培养为在转速180-700 rpm下培养144-168小时；所述发酵培养基为糖 90-100g/L、NH4NO3 2_4g/L、KH2PO4 0. 05-0. 2g/L、ZnSO4 0. 05-0. 2g/L、MgSO4 0. 05-0. 2g/L、玉米浆 0. 5-2g/L 和 CaCO3 20-50 g/L ；
所述玉米秸秆水解液的制备方法是取玉米秸秆，粉碎，按照固液体积比为1:5-10加水，用硫酸调节PH至2. 5，加热至100°C水解1-5小时，然后用氢氧化钙中和，加入纤维素酶和半纤维素酶，50°C恒温水解1-10小时，过滤，收集滤液，得玉米秸秆水解液；
所述木质纤维素水解液的制备方法是取木质纤维，粉碎，用质量分数为7%的硫酸浸泡 2小时，加热至160-200°C水解2-10分钟，然后用生石灰中和，剩余残渣再用质量分数为21 的硫酸在温度为180-240°C水解2-10分钟，过滤，收集滤液，得木质纤维素水解液。进一步，步骤c中所述用乙醇沉淀为加入相当于发酵液体积1-4倍的质量分数95% 的乙醇溶液，4°C冷冻12-36小时；所述固液分离为在转速不低于3000rpm的条件下离心不少于5分钟。进一步，步骤c所述用乙醇沉淀为加入相当于发酵液体积2倍的质量分数95%的乙醇溶液，4°C冷冻M小时；固液分离为在转速3500rpm的条件下离心45分钟。进一步，步骤d中所述酸水解为将聚苹果酸溶解于浓度为2mol/L的硫酸、盐酸或磷酸中的至少一种，温度为70-95°C水解7-15小时。进一步，步骤d中所述酸水解为将聚苹果酸溶解于浓度为2mol/L的硫酸中，温度为85°C水解10小时。进一步，步骤e中所述浓缩是在温度低于80°C、真空度不低于IMpa的条件下进行， 浓缩液的浓缩比大于10 ；所述结晶在4°C下冷冻结晶。进一步，步骤e中所述浓缩是在温度为80°C、真空度为IMpa的条件下进行，浓缩液的浓缩比为10。本发明有益效果在于本发明用出芽短梗霉(彻reo如Μ Τ/ puHans)为发酵菌株，既可以利用葡萄糖或木糖为糖原，也可以利用价格低廉的农副生物质资源玉米秸秆水解液或木质纤维素水解液为糖原，发酵直接产物为高分子聚苹果酸，解决了传统路线发酵直接产生苹果酸会抑制菌种产酸能力的问题，因而能够获得高浓度的聚苹果酸发酵液，发酵液中聚苹果酸最高达48. 4g/L，获得的聚苹果酸通过乙醇沉淀、酸水解即制得苹果酸，工艺步骤简单，苹果酸收率高(最高达54. 9g/L)，适合于大规模生产。
具体实施例方式以下将结合实施例对本发明进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。本发明使用的发酵菌株为出芽短梗霉(Aureobasidium pullans)NRRL Y-2311-1, 将出芽短梗霉NRRL Y-2311-1制备成OD6tltl= 0. 4左右的菌液，保存于本实验室_80°C超低温冰箱中。实施例1
原料准备
玉米秸秆水解液，具体为取玉米秸秆，粉碎，按照固液体积比1:7加入水，用硫酸调节 PH至2. 5，加热至100°C水解3小时，然后用氢氧化钙中和，加入纤维素酶和半纤维素酶， 50°C恒温水解8小时后，过滤，收集滤液，得玉米秸秆水解液，备用。生产苹果酸的方法，具体步骤为 a.种子活化
将出芽短梗霉NRRL Y-2311-1接种于种子培养基中，接种量按照出芽短梗霉与种子培养基的体积比为1:100，种子培养基配方为葡萄糖80g/L、NH4N032g/L、KH2P04 0. lg/L,ZnSO4 0. 2g/L、MgS04 0.2g/L、玉米浆 IgA^PCaCO3 20g/L，在温度为 、转速为 250 rpm条件下震荡培养72小时，得活化种子液； b.发酵
将步骤a所得活化种子液接种于含50mL发酵培养基的摇瓶中，接种量按照活化种子液与发酵培养基的体积比为1:10，发酵培养基配方为玉米秸秆水解液和葡萄糖总糖含量为 100 g/L、NH4NO3 2g/L、KH2PO4 0.1 g/L, ZnSO4 0.2 g/L,MgSO4 0. 2g/L、玉米浆 lg/L 和 CaCO3 20 g/L，在温度为25°C、转速为220 rpm条件下震荡培养160小时，培养液用板框过滤机过滤，收集滤液，得发酵液；
c.醇沉
将步骤b所得发酵液加入相当于发酵液体积2倍的质量分数为95%的乙醇溶液，4°C冷冻M小时，转速为4000rpm离心30分钟，收集沉淀，得聚苹果酸；
d.水解
将步骤c所得聚苹果酸溶于浓度为2mol/L的硫酸中，80°C水解12小时，得水解液；
e.浓缩结晶
将步骤d所得水解液采用刮板式真空蒸发器浓缩，浓缩温度为80°C，真空度为IMpa，浓缩比为10，将浓缩液转入结晶罐，4°C冷冻结晶，得苹果酸。本实施例的聚苹果酸产量为44g/L，苹果酸产量为49g/L。实施例2
生产苹果酸的方法，具体步骤为 a.种子活化
将出芽短梗霉NRRL Y-2311-1接种于种子培养基中，接种量按照出芽短梗霉与种子培养基的体积比为1:500，种子培养基配方为葡萄糖60 g/L、NH4NO3 3 g/L、KH2PO4 0. 2g/L、ZnSO4 0. lg/L, MgSO4 0. lg/L、玉米浆 2g/L 和 CaCO3 30g/L，在温度为 25°C、转速为 220 rpm 条件下震荡培养48小时，得活化种子液；
b.发酵
将步骤a所得活化种子液接种于含50mL发酵培养基的摇瓶中，接种量按照种子液与发酵培养基的体积比为1:12.5，发酵培养基配方为葡萄糖90g/L、NH4N03 3 g/L、KH2P04 0.2 g/ LJnSO4 0.1 g/L,MgSO4 0. lg/L、玉米浆 2g/L 和 CaCO3 30 g/L，在温度为 25°C、转速为 220 rpm条件下震荡培养168小时，培养液用板框过滤机过滤，收集滤液，得发酵液；
c.醇沉
将步骤b所得发酵液加入相当于发酵液体积3倍的质量分数为95%的乙醇溶液，4°C冷冻M小时，转速为3500rpm离心45分钟，收集沉淀，得聚苹果酸；
d.水解
将步骤c所得聚苹果酸溶于浓度为2mol/L的盐酸中，85°C水解10小时，得水解液；
e.浓缩结晶
将步骤d所得水解液采用刮板式真空蒸发器浓缩，浓缩温度为60°C，真空度为1. 5Mpa, 浓缩液的浓缩比为12，将浓缩液转入结晶罐，4°C冷冻结晶，得苹果酸。本实施例的聚苹果酸产量为48 g/L，苹果酸产量为55 g/L。实施例3 原料准备
玉米秸秆水解液，具体为取玉米秸秆，粉碎，按照固液体积比为1 10加入水，用硫酸调节PH至2. 5，加热至100°C水解5小时，然后用氢氧化钠中和，加入纤维素酶和半纤维素酶， 50°C恒温水解10小时后，过滤，收集滤液，得玉米秸秆水解液，备用。生产苹果酸的方法，具体步骤为
a.种子活化
将出芽短梗霉NRRL Y-2311-1接种于种子培养基中，接种量按照出芽短梗霉与种子培养基的体积比为1:1000，种子培养基配方为葡萄糖70g/L、NH4N034g/L、KH2P040. 05g/L,ZnSO4 0. 05g/L、MgS04 0 . 05g/L、玉米浆 0. 5g/L 和 CaCO3 40g/L，在温度为 25°C、转速为 200 rpm 条件下震荡培养60小时，得活化种子液；
b.发酵
将步骤a所得活化种子液接种于装4L发酵培养基的5L发酵罐中，接种量按照种子液与发酵培养基的体积比为1 12. 5，发酵培养基配方为玉米秸秆水解液和葡萄糖总糖含量 120 g/L、NH4NO3 4g/L、KH2PO4 0. 05 g/L、ZnSO4 0. 05 g/L、MgSO4 0. 05g/L、玉米菜 0. 5g/L 和CaCO3 40 g/L，在温度为25°C、转速为500 rpm、通气比1:1. 2条件下震荡培养144小时， 培养液用真空抽滤装置过滤，收集滤液，得发酵液；
c.醇沉
将步骤b所得发酵液加入相当于发酵液体积4倍的质量分数为95%的乙醇溶液，4°C冷冻12小时，转速为5000rpm离心5分钟，收集沉淀，得聚苹果酸；
d.水解
将步骤c所得聚苹果酸溶于浓度为2mol/L的磷酸中，90°C水解9小时，得水解液；
e.浓缩结晶将步骤d所得水解液采用刮板式真空蒸发器浓缩，浓缩温度为30°C，真空度为3Mpa，浓缩液的浓缩比为15，将浓缩液转入结晶罐，4°C冷冻结晶，得苹果酸。本实施例的聚苹果酸产量为42g/L，苹果酸产量为47g/L。实施例4
生产苹果酸的方法，具体步骤为
a.种子活化
将出芽短梗霉NRRL Y-2311-1接种于种子培养基中，接种量按照出芽短梗霉与种子培养基的体积比为1:250，种子培养基配方为葡萄糖40g/L、NH4NO3 5g/L、KH2PO4 0. 05g/L、 ZnSO4 0. 05g/L、MgS04 0 . 05g/L、玉米浆 3g/L和 CaCO3 10g/L，在温度为 23°C、转速为 180rpm 条件下震荡培养96小时，得活化种子液；
b.发酵
将步骤a所得活化种子液接种于含50mL发酵培养基的摇瓶中，接种量按照种子液与发酵培养基的体积比为1: 20，发酵培养基配方为木糖100g/L、NH4NO3 5 g/L、KH2PO4 0. 05 g/ UnSO4 0. 05 g/L、MgSO4 0. 05g/L、玉米浆 3g/L 和 CaCO3 10 g/L，在温度为 、转速为 300 rpm条件下震荡培养144小时，培养液用真空抽滤装置过滤，收集滤液，得发酵液；
c.醇沉
将步骤b所得发酵液加入相当于发酵液体积4倍的质量分数为95%的乙醇溶液，4°C冷冻18小时，转速为4500rpm离心30分钟，收集沉淀，得聚苹果酸；
d.水解
将步骤c所得聚苹果酸溶于浓度为2mol/L的硫酸中，70°C水解15小时，得水解液；
e.浓缩结晶
将步骤d所得水解液采用刮板式真空蒸发器浓缩，浓缩温度为80°C，真空度为IMpa，浓缩液的浓缩比为13，将浓缩液转入结晶罐，4°C冷冻结晶，得苹果酸。本实施例的聚苹果酸产量为37 g/L，苹果酸产量为43 g/L。实施例5 原料准备
木质纤维素水解液，具体为取木质纤维，粉碎，用质量分数为7%的硫酸浸泡2小时， 温度升至200°c，水解10分钟后，用生石灰中和，剩余残渣用质量分数为m的硫酸在温度 240°C水解10分钟，过滤，收集滤液，得到木质纤维素水解液，备用。生产苹果酸的方法，具体步骤为
a.种子活化
将出芽短梗霉NRRL Y-2311-1接种于种子培养基中，接种量按照出芽短梗霉与种子培养基的体积比为1:750，种子培养基配方为葡萄糖100g/L、NH4NO3 lg/L、KH2PO4 0. 3g/ UnSO4 0.3g/L、MgSO4 0. 3g/L、玉米浆 0. 05g/L 和 CaCO3 50g/L，在温度为 30°C、转速为 300rpm条件下震荡培养36小时，得活化种子液；
b.发酵
将步骤a所得活化种子液接种于含50mL发酵培养基的摇瓶中，接种量按照种子液与发酵培养基的体积比为1:15，发酵培养基配方为木质纤维素水解液和木糖总糖含量100g/L、 NH4NO3 1 g/L、KH2PO4 0. 3 g/L、ZnSO4 0. 3 g/L、MgSO4 0. 3g/L、玉米浆 0. 05g/L 和 CaCO3 50g/L，在温度为30°C、转速为300 rpm条件下震荡培养144小时，培养液用真空转鼓过滤机过滤，收集滤液，得发酵液；
c.醇沉
将步骤b所得发酵液加入相当于发酵液体积1倍的质量分数为95%的乙醇溶液，4°C冷冻36小时，转速为3500rpm离心60分钟，收集沉淀，得聚苹果酸；
d.水解
将步骤c所得聚苹果酸溶于浓度为2mol/L的盐酸中，85°C水解10小时，得水解液；
e.浓缩结晶
将步骤d所得水解酸溶液采用刮板式真空蒸发器浓缩，浓缩温度为70°C，真空度为 3Mpa，浓缩液的浓缩比为20，将浓缩液转入结晶罐，4°C冷冻结晶，得苹果酸。本实施例的聚苹果酸产量为34 g/L，苹果酸产量为39 g/L。实施例6 原料准备
玉米秸秆水解液，具体为取玉米秸秆，粉碎，按照固液体积比为1:7加入水，用硫酸调节PH至2. 5，加热至100°C水解3小时，然后用氢氧化钙中和，加入纤维素酶和半纤维素酶， 50°C恒温水解8小时后，过滤，收集滤液，得玉米秸秆水解液，备用。木质纤维素水解液，具体为取木质纤维，粉碎，用质量分数为7%的硫酸浸泡2小时，温度升至180°c，水解6分钟后，用氢氧化钠中和，剩余残渣用质量分数为m的硫酸在温度200°C水解8分钟，过滤，收集滤液，得到木质纤维素水解液，备用。生产苹果酸的方法，具体步骤为
a.种子活化
将出芽短梗霉NRRL Y-2311-1接种于种子培养基中，接种量按照出芽短梗霉与种子培养基的体积比为1:500，种子培养基配方为葡萄糖40g/L、NH4NO3 5g/L、KH2PO4 0. 05g/L、 ZnSO4 0. 05g/L、MgS04 0 . 05g/L、玉米浆 3g/L和 CaCO3 10g/L，在温度为 23°C、转速为 180rpm 条件下震荡培养96小时，得活化种子液；
b.发酵
将步骤a所得活化种子液接种于含4L发酵培养基的5L发酵罐中，接种量按照种子液与发酵培养基的体积比为1:17. 5，发酵培养基配方为玉米秸秆水解液和木质纤维素水解液总糖含量 80g/L、NH4NO3 5 g/L、KH2PO4 0. 05 g/L、ZnSO4 0. 05 g/L、MgSO4 0. 05g/L、玉米浆 3g/L和CaCO3 10 g/L，在温度为23°C、转速为300 rpm、通气比为1:0. 8条件下震荡培养144 小时，培养液用真空转鼓过滤机过滤，收集滤液，得发酵液；
c.醇沉
将步骤b所得发酵液加入相当于发酵液体积4倍的质量分数为95%的乙醇溶液，4°C冷冻18小时，转速为4500rpm离心20分钟，收集沉淀，得聚苹果酸；
d.水解
将步骤c所得聚苹果酸溶于浓度为2mol/L的硫酸中，70°C水解15小时，得水解液；
e.浓缩结晶
将步骤d所得水解液采用刮板式真空蒸发器浓缩，浓缩温度为20°C，真空度为5Mpa，浓缩液的浓缩比为12，将浓缩液转入结晶罐，4°C冷冻结晶，得苹果酸。
本实施例的聚苹果酸产量为36g/L，苹果酸产量为40 g/L。实施例7 原料准备
玉米秸秆水解液，具体为取玉米秸秆，粉碎，按照固液体积比为1:5加入水，用硫酸调节PH至2. 5，加热至100°C水解1小时，然后用氢氧化钙中和，加入纤维素酶和半纤维素酶， 50°C恒温水解1小时后，过滤，收集滤液，得玉米秸秆水解液，备用。木质纤维素水解液，具体为取木质纤维，粉碎，用质量分数为7%的硫酸浸泡2小时，温度升至160°c，水解2分钟后，用生石灰水中和，剩余残渣用质量分数为m的硫酸在温度180°C水解2分钟，过滤，收集滤液，得到木质纤维素水解液，备用。生产苹果酸的方法，具体步骤为
a.种子活化
将出芽短梗霉NRRL Y-2311-1接种于种子培养基中，接种量按照出芽短梗霉与种子培养基的体积比为1:750，种子培养基配方为葡萄糖100g/L、NH4NO3 lg/L、KH2PO4 0. 3g/ UnSO4 0.3g/L、MgSO4 0. 3g/L、玉米浆 0. 05g/L 和 CaCO3 50g/L，在温度为 30°C、转速为 300rpm条件下震荡培养36小时，得活化种子液；
b.发酵
将步骤a所得活化种子液接种于含4L发酵培养基的5L发酵罐中，接种量按照种子液与发酵培养基的体积比为1: 20，发酵培养基配方为木糖、玉米秸秆水解液和木质纤维素水解液总糖含量 80g/L、NH4NO3 1 g/L、KH2PO4 0.3 g/L、ZnSO4 0.3 g/L、MgSO4 0. 3g/L、玉米浆 0. 05g/L和CaCO3 50 g/L，在温度为30°C、转速为700 rpm、通气比为1:1. 6条件下震荡培养144小时，培养液用板框过滤机过滤，收集滤液，得发酵液；
c.醇沉
将步骤b所得发酵液加入相当于发酵液体积1倍的质量分数为95%的乙醇溶液，4°C冷冻36小时，转速为4000rpm离心25分钟，收集沉淀，得聚苹果酸；
d.水解
将步骤c所得聚苹果酸溶于浓度为2mol/L的盐酸中，85°C水解10小时，得水解液；
e.浓缩结晶
将步骤d所得水解液采用刮板式真空蒸发器浓缩，浓缩温度为50°C，真空度为lOMpa， 浓缩液的浓缩比为10，将浓缩液转入结晶罐，4°C冷冻结晶，得苹果酸。本实施例的聚苹果酸产量为32 g/L，苹果酸产量为36 g/L。最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。
权利要求
1.生产苹果酸的方法，其特征在于，具体步骤为a.种子活化将出芽短梗霉(Jareoh1SiiZiwB pullans) NRRL Y-2311-1接种于种子培养基，温度为 23-30°C震荡培养，得活化种子液；所述种子培养基为葡萄糖40-100 g/L、NH4NO3I-5 g/L、 KH2PO4 0. 005-0. 3g/L、ZnSO4 0. 005-0. 3g/L、MgSO4 0. 005-0. 3g/L、玉米菜 0. 05-3 g/L 和 CaCO3 10-50 g/L ；b.发酵将步骤a所得活化种子液接种于发酵培养基，温度为23-30°C震荡培养144小时以上，固液分离，收集液体，得发酵液；所述发酵培养基为糖80-120g/L、NH4NO3 l_5g/L、KH2PO4 0. 005-0. 3g/L、ZnSO4 0. 005-0. 3g/L、MgSO4 0. 005-0. 3g/L、玉米菜 0. 05_3g/L 和 CaCO3 10-50 g/L;所述糖为葡萄糖、木糖、玉米秸秆水解液或木质纤维素水解液中的至少一种；所述玉米秸秆水解液的制备方法是取玉米秸秆，粉碎，加水，用酸调节PH至2. 5，加热至100°C充分水解，然后用碱中和，加入纤维素酶和半纤维素酶，50°C恒温水解，过滤，收集滤液，即得玉米秸秆水解液；所述木质纤维素水解液的制备方法是取木质纤维，粉碎，用质量分数为7%的硫酸浸泡，再加热至160-200°C充分水解，然后用碱中和，剩余残渣再用质量分数为21的硫酸在温度为180-240°C充分水解，过滤，收集滤液，即得木质纤维素水解液；c.醇沉将步骤b所得发酵液用乙醇沉淀，固液分离，收集沉淀，得聚苹果酸；d.水解将步骤c所得聚苹果酸进行酸水解，得水解液；e.浓缩结晶将步骤d所得水解液浓缩，结晶，得苹果酸。
2.根据权利要求1所述生产苹果酸的方法，其特征在于步骤a中所述出芽短梗霉的接种按照出芽短梗霉与种子培养基的体积比为1:100-1000进行；所述震荡培养为在转速 180-300 rpm下培养36-96小时；所述种子培养基为葡萄糖60_80g/L、NH4N03 2-4g/L,KH2PO4 0. 05-0. 2g/L,ZnSO4 0. 05-0. 2g/L,MgSO4 0. 05-0. 2g/L、玉米浆0. 5_2g/L和 CaCO3 20-50 g/ L0
3.根据权利要求1所述生产苹果酸的方法，其特征在于步骤b中所述活化种子液的接种按照活化种子液与发酵培养基的体积比为1:10-20进行；所述震荡培养为在转速 180-700 rpm 下培养 144-168 小时；所述发酵培养基为糖 90_100g/L、NH4N03 2-4g/L,KH2PO4 0. 05-0. 2g/L、ZnSO4 0. 05-0. 2g/L、MgSO4 0. 05-0. 2g/L、玉米菜 0. 5_2g/L 和 CaCO3 20-50 g/L；所述玉米秸秆水解液的制备方法是取玉米秸秆，粉碎，按照固液体积比为1:5-10加水，用硫酸调节PH至2. 5，加热至100°C水解1-5小时，然后用氢氧化钙中和，加入纤维素酶和半纤维素酶，50°C恒温水解1-10小时，过滤，收集滤液，得玉米秸秆水解液；所述木质纤维素水解液的制备方法是取木质纤维，粉碎，用质量分数为7%的硫酸浸泡 2小时，加热至160-200°C水解2-10分钟，然后用生石灰中和，剩余残渣再用质量分数为21 的硫酸在温度为180-240°C水解2-10分钟，过滤，收集滤液，得木质纤维素水解液。
4.根据权利要求1所述生产苹果酸的方法，其特征在于步骤c中所述用乙醇沉淀为加入相当于发酵液体积1-4倍的质量分数95%的乙醇溶液，4°C冷冻12-36小时；所述固液分离为在转速不低于3000rpm的条件下离心不少于5分钟。
5.根据权利要求4所述生产苹果酸的方法，其特征在于步骤c所述用乙醇沉淀为加入相当于发酵液体积2倍的质量分数95%的乙醇溶液，4°C冷冻M小时；固液分离为在转速 3500rpm的条件下离心45分钟。
6.根据权利要求1所述生产苹果酸的方法，其特征在于步骤d中所述酸水解为将聚苹果酸溶解于浓度为2mol/L的硫酸、盐酸或磷酸中的至少一种，温度为70-95°C水解7_15 小时。
7.根据权利要求6所述生产苹果酸的方法，其特征在于步骤d中所述酸水解为将聚苹果酸溶解于浓度为2mol/L的硫酸中，温度为85°C水解10小时。
8.根据权利要求1所述生产苹果酸的方法，其特征在于步骤e中所述浓缩是在温度低于80°C、真空度不低于IMpa的条件下进行，浓缩液的浓缩比大于10 ；所述结晶在4°C下冷冻结晶。
9.根据权利要求8所述生产苹果酸的方法，其特征在于步骤e中所述浓缩是在温度为80°C、真空度为IMpa的条件下进行，浓缩液的浓缩比为10。
全文摘要
本发明公开了一种生产苹果酸的方法，具体步骤为将出芽短梗霉接种于种子培养基，温度为23-30℃震荡培养，得活化种子液；将所得活化种子液接种于发酵培养基，温度为23-30℃震荡培养144小时以上，固液分离，收集液体，得发酵液；将所得发酵液用乙醇沉淀，固液分离，收集沉淀，得聚苹果酸；将所得聚苹果酸进行酸水解，得水解液；最后将所得水解液浓缩，结晶，制得苹果酸；本发明的生产苹果酸的方法工艺步骤简单，苹果酸产率高，适合于大规模生产。
文档编号C12P7/46GK102492734SQ20111042966
公开日2012年6月13日 申请日期2011年12月20日 优先权日2011年12月20日
发明者邹祥 申请人:西南大学