专利名称：利用膜分离技术高效制备一类不均一性安络小皮伞多糖的方法
技术领域：
本发明涉及一种利用膜分离技术从发酵液中分离提取浓缩一类不均一性安络小皮伞多糖的方法。
背景技术：
中国农产品每年因作物病害减产数十亿吨，防治农作物病害对保障国民经济的稳定发展和不断提高人民生活水平具有重要的意义。使用化学农药是减少作物病害损失的有效手段，但由于大量使用、滥用以及农药的不可降解性，造成环境污染、生态破坏、食品污染及人畜毒等事件频发，并导致严重的3R(残留、抗性、再增猖獗)问题。水稻稻瘟病是全世界稻区危害最严重的水稻病害之一，一般造成水稻减产10% —20%。以我国为例，20世纪 90年代以来，该病的年发生面积均在380万公顷以上，年损失稻谷达数亿千克。由于稻瘟病菌小种构成复杂，而且变化很快，易导致水稻抗病品种丧失，稻瘟病菌的多变性也常使其抗农药性发展迅速，因此筛选一种新的杀菌剂是十分必要的。真菌多糖一般是指各种真菌的子实体和类所产生的一类代谢产物，通常是极性大分子化合物，能够控制细胞分裂分化，调节细胞生长衰老的一类活性多糖，被誉为21世纪的健康卫士。与动、植物多糖不同的是真菌多糖分子单体之间，大多以β(1 —3)与β (I — 6)糖苷键结合，形成链状分子，具有螺旋状的立体构型。多糖又分为均一性多糖和不均一性多糖两类。(I)均一性多糖一般由10个以上的同一种单糖通过糖苷键连接而成，可分为直链结构，也可有分支结构。(2)不均一性多糖是由不同单糖分子缩合而成的多糖，除含有糖链外，还可含有肽链或脂类成份。大部分的多糖都属于不均一性多糖。安络小皮伞类多糖是安络小皮伞的重要活性成分，它的药用价值较高，我国民间用它的菌丝来治疗跌打损伤、骨折疼痛、坐骨神经痛、偏头痛、麻风性神经痛和风湿关节痛等，但是对于防治作物病害方面国内外报道的很少。本课题组通过研究发现不均一性安络小皮伞类多糖是一个高效、杀菌谱广、对作物和肺靶标生物以及环境安全的真菌多糖，尤其对稻瘟病菌有良好的防效，经多次试验证明对稻瘟病菌的菌丝生长的抑制率高达93. 5%。目前多糖提取工艺一般多采用水浴、酶提和层析、精馏、重结晶等工艺过程，其缺点一、是工艺繁琐、温度、时间要求特定。二、是没有进行有效组分提纯或生产中无法实现组分提纯，多是以杂多糖形成制品，其产品中无效的糟柏成分较多、有效功效低，这局限了其在制药方面的开发和利用。三、是现有工艺成本高，功效低，难以规模化生产。四、是现有工艺处理步骤中用到的一些化学药品，其既浪费资源，又污染环境，而且对产品的有效成分还有一定程度的破坏。膜分离技术是国际上公认的20世纪末至21世纪中期最有发展前途的前沿技术。膜分离是以选择性透过膜为分离介质，当膜两侧存在推动力时，原料的组分可透过选择膜而对混合物进行分离、提纯、浓缩的一种分离过程。膜分离技术是当今世界一项先进的精细分离技术，膜技术的分离孔径从纳米级至微米级，能把一切物质分离开，它的分离比以重力为基础的离心机收得率高30%以上。因此，本项目以该技术为基础原理的所研发的一类不均一性安络小皮伞类多糖发酵后的安络小皮伞类多糖制备工艺具有比以滤布为介质的板框等分离精度高一个数量级；比化学萃取工序简单，无相变、无污染；比蒸馏分离、蒸发浓缩能耗低80% 90%等优点。
发明内容
本发明的目的是解决现有的一类不均一性安络小皮伞类多糖制作方法存在的制作工艺复杂成本高及制作得到的多糖含量低、发酵液杂质多以及使用化学药品对产品的有效成分造成破坏等。本发明提供一种利用膜分离技术浓缩纯化一类不均一性安络小皮伞类多糖制作方法。用以解决现有技术中存在的劳动强度大、生产效率低、环境污染严重、生产成本高、产品质量差、产品收率低等问题。本发明的膜材料是陶瓷无机膜。本发明所用的陶瓷无机膜与高聚物分离膜相比优点是(I)热稳定好，适用于高温、高压体系。试用温度一般都可以达到400°C，有时可以高达800°C。(2)化学稳定性好，能耐酸和弱碱，pH值试用范围宽。(3)抗微生物能力强，与一般微生物不发生生化及化学反应。(4)陶瓷膜组件机械强度大。(5)清洁状态好。本身无毒，不会使被分离体系受到污染。容易再生和清洗。当膜污染被堵塞后、可以进行反吹及冲洗，也可以在高温下进行化学清洗。(6)陶瓷膜的孔分布 窄，分离性能好。本发明一种利用膜分离技术从发酵液中分离提取浓缩一类不均一性真菌多糖的芽孢的方法，按照以下步骤进行一、将产安络小皮伞类多糖的安络小皮伞经深层发酵后得到发酵液；二、将步骤一中的发酵液冷冻干燥至恒质量，粉碎机破碎，过60目筛；三、将步骤二中的类干粉加蒸馏水在70°C恒温水浴锅浸提2h ;四、将步骤三中的浸提液在操作温度为25 45°C、膜通量为50 60LMH条件下，经过截留分子量为O. 01 O. 03um的无机陶瓷微滤膜和微滤技术来浓缩纯化浸提液中不均一性安络小皮伞类多糖，通过的溶液为安络小皮伞类多糖溶液，不均一性安络小皮伞类多糖浓缩倍数为6 7倍；五、将步骤四中的不均一性安络小皮伞类多糖溶液在操作温度为25 45°C、膜通量为35 45LMH条件下通过截留分子量为4000 9000k的无机陶瓷超滤膜和超滤技术来浓缩纯化浸提液中不均一性安络小皮伞类多糖，其中被截留的在膜的近侧液的溶液为不均一性安络小皮伞类多糖溶液，不均一性安络小皮伞类多糖浓缩倍数为10 15倍；六、将步骤五中的不均一性安络小皮伞类多糖溶液用sevage液去除蛋白；七、将步骤六中的不均一性安络小皮伞类多糖溶液经喷雾干燥制成粉末，即得到不均一性安络小皮伞类多糖，喷雾干燥的进口温度为170 210°C，出口温度为80 95°C。本发明的方法中的膜过滤技术自动化程度高，操作简单，减少了人力成本且不需要使用过滤剂进行过滤，本发明的制作方法成本低。本发明制作得到不均一性安络小皮伞类多糖杀菌剂中安络小皮伞类多糖含量高，制作得到的小皮伞真菌多糖杀菌剂不易吸潮，保质期长。
图I利用膜分离技术高效制备一类不均一性安络小皮伞多糖的工艺生产流程框图。
具体实施例方式以下结合具体实施方式
，对本发明进行详细说明。
具体实施方式
一本实施方式一种膜分离技术从发酵液中分离提取浓缩一类不均一性小皮伞真菌多糖的方法按照以下步骤进行一、将产安络小皮伞类多糖的安络小皮伞经深层发酵后得到发酵液；二、将步骤一中的发酵液冷冻干燥至恒质量，粉碎机破碎，过60目筛；三、将步骤二中的类干粉加蒸馏水在70°C恒温水浴锅浸提2h ；
四、将步骤三中的浸提液在操作温度为25_45°C、膜通量为50-60LMH条件下，经过截留分子量为O. 01-0. 03um的无机陶瓷微滤膜来浓缩纯化浸提液中不均一性安络小皮伞类多糖，通过的溶液为安络小皮伞类多糖溶液，不均一性安络小皮伞类多糖浓缩倍数为6-7倍；被截留的在膜的近侧液的溶液中主要成分为类和不溶性物等。五、将步骤四中的不均一性安络小皮伞类多糖溶液在操作温度为25_45°C、膜通量为35-45LMH条件下通过截留分子量为4000_9000k的无机陶瓷超滤膜来浓缩纯化浸提液中不均一性安络小皮伞类多糖，其中被截留的在膜的近侧液的溶液为不均一性安络小皮伞类多糖溶液，不均一性安络小皮伞类多糖浓缩倍数为10-15倍；通过的溶液为盐、氨基酸等一些小分子物质。六、将步骤五中的不均一'丨生安络小皮伞类多糖溶液用sevage液去除蛋白；七、将步骤六中的不均一性安络小皮伞类多糖溶液经喷雾干燥制成粉末，即得到不均一性安络小皮伞类多糖杀菌剂，喷雾干燥的进口温度为170 210°C，出口温度为80 95。。。本实施方式得到的一类不均一性安络小皮伞类多糖的保质期为2年以上。本实施方式得到的一类不均一性安络小皮伞类多糖的分子量为180万。13CNMR谱测定表I 一类不均一性安络小皮伞类多糖的化学移植峰号化学位移值δ (ppm)峰号化学位移值δ (ppm)
1104.61073.2
2103. I1172.8
3102.31272.8
4101. 21369.6
580.51469.8
680.31568.9 778.51664.0
875.81763.8
974.3表2 —类不均一性安络小皮伞类多糖的C-I区解析
糖残基碳原子化学位移值S (ppm) 峰高比
—2) -Man-(I— C-I104.6 I
-4)- a -D-Glc-Cl- C-I102.3 3
A-D-Glc-(I— C-I101. I I
—2)-Mane - (I— C-I103. I I t表3 —类不均一性安络小皮伞类多糖的C-6区解析
糖残基碳原子化学位移值δ (ppm)
Glc _(n—C-663.4Man - (n—C-663.8 —2) -Manc - (I—C-668.7
t表4 一类不均一性安络小皮伞类多糖取代后的C-2、C-3、C_4区解析糖残基碳原子化学位移值δ (ppm)
—2)_Man - (I—C-280.2—4)- a-D-Glc-(l- C_478.6
—2)-Maru — (I—C~280.7
t具体实施方式
二 本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤一中将一类不均一性小皮伞接种到发酵罐中进行发酵培养，发酵温度为为25-28°C，发酵时间为60-70h。其它步骤及参数与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
三本实施方式与具体实施方式
一或二不同的是步骤四中小皮伞类多糖溶液浓缩倍数为7倍。其它步骤及参数与具体实施方式
一或二相同。
具体实施方式
四本实施方式与具体实施方式
三不同的是步骤四中滤液通过截留分子量为O. 02um的微滤膜过滤。其它步骤及参数与具体实施方式
三相同。
具体实施方式
五本实施方式与具体实施方式
四不同的是步骤五中小皮伞类多糖溶液浓缩倍数为14倍。其它步骤及参数与具体实施方式
四相同。
具体实施方式
六本实施方式与具体实施方式
五不同的是步骤五中滤液通过截留分子量为7000k的超滤膜过滤。其它步骤及参数与具体实施方式
五相同。
具体实施方式
七本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤七中喷雾干燥的进口温度为180°C，出口温度为75°C。其它步骤及参数与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
八本实施方式与具体实施方式
二不同的是一类不均一性小皮伞接种到发酵罐中进行发酵培养，发酵温度为28°C，发酵时间为70h。其它步骤及参数与具体实施方式
二相同。
具体实施方式
九本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤五中将发酵液通过截留分子量为5000 8000k的超滤膜过滤。其它步骤及参数与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
十不均一性安络小皮伞类多糖的防治效果，采用抑菌圈法首先刮取病原菌孢子制成孢悬液，将孢悬液(I X IO6个/mL)与融化并冷却至45°C左右的PDA培养基混匀，制平板。不均一性安络小皮伞类多糖点接于病原菌平板上，28°C培养72h，观测抑菌圈。也可将不均一性安络小皮伞类多糖和病原菌成十字交叉排列(病原菌在十字的中央，不均一性安络小皮伞类多糖在十字的两端)。培养3-4天后，观察抑菌圈大小。得出的结果见表5和表6。
表5不均一性安络小皮伞类多糖的抑菌谱测定结果
权利要求
1.ー种利用膜分离技术从发酵液中分离浓缩提取不均一性安络小皮伞类多糖的方法，其特征在于，按照以下步骤进行一、将产安络小皮伞类多糖的安络小皮伞经深层发酵后得到发酵液；ニ、将步骤一中的发酵液冷冻干燥至恒质量，粉碎机破碎，过60目筛；三、将步骤ニ中的类干粉加蒸馏水在70°C恒温水浴锅浸提2h ;四、将步骤三中的浸提液在操作温度为25 45°C、膜通量为50 60LMH条件下，经过截留分子量为O. 01 O. 03um的无机陶瓷微滤膜浓缩纯化浸提液中不均一性安络小皮伞类多糖，通过的溶液为安络小皮伞类多糖溶液，不均一性安络小皮伞类多糖浓缩倍数为6 7倍；五、将步骤四中的不均一性安络小皮伞类多糖溶液在操作温度为25 45°C、膜通量为35 45LMH条件下通过截留分子量为4000 9000k的无机陶瓷超滤膜来浓缩纯化浸提液中不均一性安络小皮伞类多糖，其中被截留的在膜的近侧液的溶液为不均一性安络小皮伞类多糖溶液，不均一性安络小皮伞类多糖浓缩倍数为10 15倍；六、将步骤五中的不均一性安络小皮伞类多糖溶液用sevage液去除蛋白；七、将步骤六中的不均一性安络小皮伞类多糖溶液经喷雾干燥制成粉末，即得到不均一性安络小皮伞类多糖产品，喷雾干燥的进ロ温度为170 210°C，出ロ温度为80 95。。。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，步骤一中将安络小皮伞接种到发酵罐中进行发酵培养，发酵温度为25-28°C，发酵时间为60 70h。
3.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，步骤三中料水重量比为I: 15。
4.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，步骤四中溶液通过截留分子量为O.02um的无机陶瓷微滤膜。
5.根据权利要求I所述的方法，其特征在干，步骤五中溶液通过截留分子量为8000k的超滤膜过滤。
6.根据权利要求I或5所述的方法，其特征在于，步骤五中ー类不均一性安络小皮伞类多糖溶液的浓缩倍数为14倍。
7.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，步骤六中的不均一性安络小皮伞类多糖溶液用sevage液去除蛋白。
8.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，步骤七中喷雾干燥的进ロ温度为190°C，出口温度为85で。
全文摘要
本发明公开了利用膜分离技术高效制备一类不均一性安络小皮伞多糖的方法，按照以下步骤进行一、深层发酵后得到发酵液；二、将发酵液冷冻干燥至恒质量，粉碎机破碎，过60目筛；三、恒温水浴锅浸提；四、无机陶瓷微滤膜浓缩纯化；五、通过截留分子量为4000～9000k的无机陶瓷超滤膜浓缩纯化；六、将步骤五中的不均一性安络小皮伞类多糖溶液用sevage液去除蛋白；七、将步骤六中的不均一性安络小皮伞类多糖溶液经喷雾干燥制成粉末，即得到不均一性安络小皮伞类多糖产品，喷雾干燥的进口温度为170～210℃，出口温度为80～95℃。本发明的制作方法成本低，制作得到的产品质量好，保质期长，密封条件下可保存2年以上不变质。
文档编号C12R1/645GK102676609SQ20111044266
公开日2012年9月19日 申请日期2011年12月27日 优先权日2011年12月27日
发明者安德荣 申请人:西北农林科技大学