专利名称：一种从液体样本中快速提取总rna的试剂及方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种从液体样本中快速提取总RNA的试剂及方法。
背景技术：
近年来，在基因研究的相关技术中，作为生物体内重要遗传物质，RNA已越来越多的成为被研究的对象。总RNA的提取是分子生物学研究的基础，在进行实时荧光定量PCR、cDNA文库的构建等分子生物学实验时均需要高质量RNA，因此RNA的提取是分子生物学研究的一个关键步骤。有关动植物组织中RNA提取方法的报道已经很多，常用的RNA的提取方法有TRIZOL法、异硫氰酸胍法、CTAB-LiCL法及国内外各生物公司的总RNA提取试剂盒等。目前 普遍使用的是根据RNA在酸性酚溶液中的溶解度不同，组织或细胞用变性液处理后，在用酸性酚和氯仿抽提的酸性硫氰酸胍-酚-氯仿一步法，该方法的优点是具有强烈的蛋白变性剂，它能强烈抑制材料及提取液中的Rnase的活性。早在1987年Chomaczynski等就建立了异硫氢酸胍/苯酚/氯仿一步法提取总RNA，该方法得到了广泛应用，数家公司据此开发出RNA提取试剂盒。然而液体样本中总RNA提取一直是一个比较困难的问题，因为液体样本本身大多都是水，RNA含量少，所以提取RNA相对较为困难。现在大部分血液总RNA的提取方法都需要分离红细胞和白细胞，然后裂解红细胞，倒掉上清液，再从白细胞中提取总RNA，最后还要用DNase酶进行基因组DNA的消化，整个操作时间甚至需要几个小时才能完成，即使有RNA提取出来，大都也都降解了。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种使用方便高效、重复性好的快速提取液体样本总RNA的试剂和方法，所述液体样本包括来源于人、动物、植物、酵母、细菌、病毒培养液等任何液体形式的样品。为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下本发明所述的从液体样本中快速提取总RNA的试剂，其组分按重量份计包括异硫氰酸胍10 50份，醋酸5 20份，醋酸钠10 30份，苯酚10 50份，硫氰酸铵5 20份，十二烷基肌氨酸钠O. I 10份。本发明提供的一种用上述试剂从液体样本中快速提取总RNA的方法，其特征在于包括如下步骤步骤[I]按照3 I的体积比加入所述试剂和液体样本后震荡混匀，室温下孵育5分钟以使核蛋白体完全分解；步骤[2]按照每O. 75 ImL步骤[I]中加入的本发明所述试剂加入O. 2mL氯仿，然后剧烈震荡并在室温下孵育5分钟帮助有机相和水相分层；步骤[3]4°C 12000rpm下离心经所述步骤[2]后所得的混合液15分钟，然后取含有RNA的上层水相；步骤[4]在经所述步骤[3]后所得的含有RNA的水相中加入异丙醇，加入的量按照每O. 75 ImL步骤[I]中加入的本发明所述试剂加入O. 5mL计算，然后室温孵育10分钟使RNA沉淀；步骤[5]4°C 12000rpm下离心经所述步骤[4]后所得的混合液10分钟，然后弃上清；步骤[6]用75%乙醇漂洗经所述步骤[5]后所得的RNA沉淀；步骤[7]真空干燥经所述步骤[6]后得到的RNA5分钟,然后用Rnase-free H2O溶解，-80°C下保存。
本发明的积极效果在于本发明所述试剂中含有强烈的蛋白变性剂，能迅速变性蛋白，使RNase变性，不能对RNA降解。使用本发明所述的方法能够更加快速方便的提取液体样本中的总RNA，且重复性好，省去了在处理样品前离心去除液体的步骤，对于血液样本，用上述试剂和方法无需分离红细胞，直接对血液进行裂解，既简化步骤，又避免白细胞的损失，总RNA产品得率高，稳定性好，且其裂解后得到的混合液还可以用来运输所提取RNA，以避免在运输过程中RNA的降解。
图I为按照下述实施例I提取人的全血总RNA的琼脂糖凝胶电泳图；泳道I与2 :全血样本在_80°C保存一个月后的提取结果；泳道M :标准的Hela细胞RNA。图2为利用实验室常用方法和下述实施例2中的方法提取鸡胚成纤维细胞总RNA的琼脂糖凝胶电泳图；泳道I :利用实验室常用方法提取的RNA ;泳道2 :利用实施例2所述方法提取的RNA ;泳道M =Marker0图3为按照下述实施例3所述方法提取的HIV-IRNA进行RT-PCR实验的琼脂糖凝胶电泳图。
具体实施例方式本发明实施例公开了一种从液体样本中快速提取总RNA的试剂及方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们应当都被视为包括在本发明中。本发明的试剂及方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明的内容、精神和范围内对本文所述的试剂和方法进行改动或者适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。本发明所述的从液体样本中提取总RNA的试剂，其组分按重量份计包括异硫氰酸胍10 50份，醋酸5 20份，醋酸钠10 30份，苯酚10 50份，硫氰酸铵5 20份，十二烷基肌氨酸钠O. I 10份。其中作为优选，按重量份数计，异硫氰酸胍30份，醋酸12份，醋酸钠20份，苯酚30份，硫氰酸铵12份，十二烷基肌氨酸钠5份，充分溶解后常温保存。本发明所述的液体样本包括来源于人、动物、植物、酵母、细菌、病毒培养液等任何液体形式的样品。
本发明所述的从液体样本中快速提取总RNA的方法，包括如下步骤步骤[I]按照3 I的体积比加入所述试剂和液体样本后震荡混匀，室温下孵育5分钟以使核蛋白体完全分解；步骤[2]按照每O. 75 ImL步骤[I]中加入的本发明所述试剂加入O. 2mL氯仿，然后剧烈震荡并在室温下孵育5分钟帮助有机相和水相分层；步骤[3] 4°C 12000rpm下离心经所述步骤[2]后所得的混合液15分钟，然后取含有RNA的上层水相；步骤[4]在经所述步骤[3]后所得的含有RNA的水相中加入异丙醇，加入的量按照每O. 75 ImL步骤[I]中加入的本发明所述试剂加入O. 5mL计算，然后室温孵育10分钟使RNA沉淀；步骤[5] 4°C 12000rpm下离心经所述步骤[4]后所得的混合液10分钟，然后弃上 清；步骤[6]用75%乙醇漂洗经所述步骤[5]后所得的RNA沉淀；步骤[7]真空干燥经所述步骤[6]后得到的RNA5分钟,然后用Rnase-free H2O溶解，-80°C下保存。为进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提取RNA的方法进行详细说明。实施例I :本发明所述从液体样本中快速提取总RNA的试剂按重量份数计，取异硫氰酸胍30份，醋酸12份，醋酸钠20份，苯酚30份，硫氰酸铵12份，十二烷基肌氨酸钠5份，充分溶解后常温保存。利用上述配方配置的试剂按照本发明中所述快速提取总RNA的方法提取人全血RNA。实施例2 :本发明所述从液体样本中快速提取总RNA的试剂按重量份数计，取异硫氰酸胍10份，醋酸5份，醋酸钠10份，苯酚10份，硫氰酸铵5份，十二烷基肌氨酸钠O. I份，充分溶解后常温保存。利用上述配方配置的试剂按照本发明中所述快速提取总RNA的方法提取人全血RNA。实施例3 :本发明所述从液体样本中快速提取总RNA的试剂按重量份数计，取异硫氰酸胍50份，醋酸20份，醋酸钠30份，苯酚50份，硫氰酸铵20份，十二烷基肌氨酸钠10份，充分溶解后常温保存。利用上述配方配置的试剂按照本发明中所述快速提取总RNA的方法提取人全血RNA。按照上述实施例I、实施例2及实施例3所述的试剂处理相同的人全血样本，进行比较。检测值如下表
吸光度A260/A280 得率
实施例I O18ug/mL
权利要求
1.一种从液体样本中快速提取总RNA的试剂，其特征在于其组分按重量份数计包括异硫氰酸胍10 50份，醋酸5 20份，醋酸钠10 30份，苯酚10 50份，硫氰酸铵5 20份，十二烷基肌氨酸钠O. I 10份。
2.按照权利要求I所述的一种从液体样本中快速提取总RNA的试剂，其特征在于所述液体样本包括来源于人、动物、植物、酵母、细菌、病毒培养液的液体形式的样品。
3.一种用权利要求I所述的试剂从液体样本中快速提取总RNA的方法，其特征在于包括如下步骤 步骤[I]按照3 I的体积比加入所述试剂和液体样本后震荡混匀，室温下孵育5分钟以使核蛋白体完全分解； 步骤[2]按照每O. 75 ImL步骤[I]中加入的本发明所述试剂加入O. 2mL氯仿，然后剧烈震荡并在室温下孵育5分钟帮助有机相和水相分层； 步骤[3]4°C 12000rpm下离心经所述步骤[2]后所得的混合液15分钟，然后取含有RNA的上层水相； 步骤[4]在经所述步骤[3]后所得的含有RNA的水相中加入异丙醇，加入的量按照每O.75 ImL步骤[I]中加入的本发明所述试剂加入O. 5mL计算，然后室温孵育10分钟使RNA沉淀； 步骤[5]4°C 12000rpm下离心经所述步骤[4]后所得的混合液10分钟，然后弃上清； 步骤[6]用75%乙醇漂洗经所述步骤[5]后所得的RNA沉淀； 步骤[7]真空干燥经所述步骤[6]后得到的RNA5分钟，然后用Rnase-free H2O溶解，-80°C下保存。
全文摘要
本发明的目的在于提供一种方便、高效、重复性好的提取液体样本总RNA的试剂和方法，包括从来源于人、动物、植物等任何液体形式的样品中提取总RNA。本发明提供的一种提取液体样本总RNA的试剂，其组分按重量份数计异硫氰酸胍10～50份，醋酸5～20份，醋酸钠10～30份，苯酚10～50份，硫氰酸铵5～20份，十二烷基肌氨酸钠0.1～10份。本发明提供的液体样本总RNA提取方法，不需要在处理样本前离心去除液体的步骤，对于全血样本来说，不需要分离红细胞和白细胞，不需要进行另外的红细胞裂解步骤。整个过程操作简单，方便快捷。采用本发明获得的总RNA产品得率高，稳定性好，可以满足下游分子生物学实验。
文档编号C12N15/10GK102876663SQ20121038043
公开日2013年1月16日 申请日期2012年10月10日 优先权日2012年10月10日
发明者周志图 申请人:北京百泰克生物技术有限公司