专利名称：土生曲霉的制作方法
技术领域：
本发明涉及微生物技术领域，特别是涉及一种以三七为基质通过发酵而获得的具有抗人类血栓形成药用成份的微生物。
三七是中国的传统名贵中药材，与人参有着相似的性质和功效，可以滋补、镇静、抗溶血、抗疲劳、抗糖尿病、抗血小板、促进癌细胞转化、抑制癌细胞成长等，目前，使原植物三七药用成分的含量得以提高，并改变其原药用成分的种类，成为较有研究价值的课题。
本发明的目的是提供一种使三七发酵，产生抗人类心脑血管疾病或抗肿瘤的发酵产物的微生物——土生曲霉。
本发明所述的土生曲霉命名为土生曲霉Aspergillus sp.Ym31966土生曲霉Ym31966，是从我国云南省土壤样品中分离得到，该菌株已在国家知识产权局专利局指定的保藏单位保藏，保藏日期为2002年3月27日，保藏单位名称中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO.M202016。
本发明所述的土生曲霉的培养基培养特征为下列之一一、PDA培养基28℃培养7天，菌落直径28mm，13天38mm。菌落浅咖啡色，扁平疏松粉状，边缘稍不整齐，中间凸起，背面黄褐色，有同心环，有浅黄色素。
二、麦芽汁培养基28℃培养7天，菌落直径33mm，13天40mm，菌落浅咖啡色，扁平疏松粉状，边缘不齐，中部有放射沟纹，背面褐色。
三、察贝克培养基28℃培养7天，菌落直径23mm，13天37mm。菌落浅浅黄带肉红色，粉状，中间绒状，稍紧密，边缘不齐，有黄色水珠，背面橘红色，稍有沟纹。
形态特征一、无性世代，菌丝无色有隔膜，孢子梗从壁厚而膨大的的足细胞垂直生出，光滑无色；顶囊半球形，顶部2/3密生小梗；小梗双层；分生孢子穗圆筒形，肉桂色；分生孢子球形光滑，孢子直径1.8微米。
二、有性世代，未发现。
本发明所述的土生曲霉的发酵培养特征为一、培养基三七粉50％，鲜豆渣50％，按重量比计。
二、培养温度28℃±2℃。
三、发酵时间12天。
四、发酵培养特征培养第1天，有零星的白菌丝点生长。培养第2天，长满白色菌丝，菌丝短，发酵物结块。培养第3天，有土红色孢子生长，发酵物致密呈土黄色。培养第4天，有大量土红色孢子生长。发酵物紧密呈土黄色。培养第5天，发酵物同第5天。培养第7天，发酵物表面长满土红色孢子，发酵物上四分之三部分呈土色，下四分之一部分呈土黄色。培养第8天，发酵物表面长满粉粉的土红色孢子，发酵物上五分之四左右部分呈土色，下五分之一左右部分呈土黄色。培养第9天，发酵物呈土红色，表面长满孢子，发酵物致密。培养第10天，发酵物上部分呈米糠色，下部分呈黄绿色，发酵物致密，表面长满糠麸色孢子。培养第11天，发酵物同第10天。培养第12天，发酵物表面长满糠麸色孢子。发酵物致密，上部分呈糠麸色，靠近瓶底部分呈黄绿色。
本发明所述的土生曲霉，经发酵原植物三七成分中的三七总皂甙含量平均提高20％；其工艺步骤为菌种→一级种子培养→二级种子培养→发酵→培养烘干→三七发酵物→提取→总皂甙。本工艺适合于半知菌类的其它丝状真菌类微生物。
其中，发酵原料为有数或无数头三七中药材，发酵方式为固体发酵；一级种子培养采用马铃薯葡萄糖固体培养基(固体PDA)，二级种子培养为马铃薯葡萄糖液体培养基(液体PDA)。马铃薯葡萄糖培养基(PDA)的制备取新鲜马铃薯200克，去皮切成小块，加水1升煮沸30分钟，过滤弃马铃薯，滤液加水补足一升，加入葡萄糖20克，PH自然。上述马铃薯葡萄糖培养基中加入琼脂15克，即为固体PDA培养基。发酵培养发酵的培养基为80-100目三七粉50％，新鲜黄豆渣50％，水份65％，PH自然。培养时间菌种活化培养96小时，一级种子静止培养时间96小时，二级种子摇床培养时间96小时，发酵培养时间12天。培养温度一级种子培养温度28℃±1℃，二级种子摇床培养温度28℃±2℃，发酵培养温度为28℃±2℃。烘干发酵完毕，发酵产物置60℃下烘干，备用。
本发明所述的土生曲霉，其显著的有益效果在于发酵能使原三七皂甙元Rc、Re(人参二醇型)及nR1~6、Rb2、3、Rg2(人参三醇型)等组分降低或消失，发酵三七产物总甙含量为92.5％，三七发酵产物总甙主要组分由Rg1、Rd和Rb1三种皂甙元构成，其中，原人参二醇型皂甙元Rb1含量占总成分的25％；原人参三醇型皂甙元Rg1含量为35％；Rd含量15％左右，三组分(Rg1、Rb1、Rd)含量总和75％。皂甙元Rg1、Rd和Rb1的化学结构与三七原植物皂甙组分相同。
本发明所述的土生曲霉，已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏单位地址中国.武汉.武汉大学，分类命名Aspergillus sp.Ym31966土生曲霉Ym31966。
图1为本发明所述的土生曲霉PDA培养基菌落形态图。
图2为本发明所述的土生曲霉分生孢子穗显微图。
图3为本发明所述的土生曲霉分生孢子及菌丝显微图。
实施例取土生曲霉Aspergillus sp.Ym3 1966土生曲霉Ym31966，Aspergillus terreusThom在无菌条件下(无菌室或超净工作台)，用接种针挑取少许菌种，转接于已灭菌的固体PDA培养基试管(15×150mm)中，置培养箱内28℃±1℃活化培养96小时。取出活化96小时的菌种，在无菌条件下，以同样方式接入活化好的菌种到已灭菌的一组种子固体PDA培养基中，在28℃±1℃下培养96小时，即为YM31966一级种子。
采用500毫升玻璃三角瓶，装入配制好的液体PDA培养基100毫升，15磅灭菌30分钟后，取YM31966一级种子，在无菌条件下，接种于装有100毫升液体PDA培养基500毫升玻璃三角瓶中，一级种子接种量为每支斜面接三个三角瓶，置28℃±2℃摇床培养96小时后，作为三七发酵二级种子用。
根据发酵规模大小，发酵料按重量比率，称取50％三七粉，加入50％的新鲜黄豆渣，充分，发酵料水分不低于65％，三七发酵料配制好后，装入500毫升罐头瓶中，塑料薄膜、牛皮纸封口，置灭菌锅内15磅灭菌60分钟后，取出待冷却至30℃，接入液体二级种子，二级种子接用量为5％(V/W)。摇匀后放置后28℃±2℃下，静止发酵12天。在发酵期间，注意发酵室保湿不低于80％相对湿度，第2天分别进行摇瓶一次，并注意检查有无染菌现象。发酵完毕，发酵产物置60℃下烘干，得到三七发酵产物。
本发明所述的土生曲霉生物学特征表现为18rRNA基因组由1729个碱基组成TTTGACCAAC TTTCCGGCTC TGGGGGGTCG TTGCCAACCC CCTGGAGCCA GTCCGAAGGCCTCACCGAGC CATTCAATCG GTAGTAGCGA CGGGCGGTGT GTACAAAGGG CAGGGACGTAATCGGCACGA GCTGATGACT CGTGCCTACT AGGCATTCCT CGTTGAAGAG CAATAATTGCAATGCTCTAT CCCCAGCACG ACAGGGTTTA ACAAGATTAC CCAGACCTCT CGGCCAAGGTGATGTACTCG CTGGCCCTGT CAGTGTAGCG CGCGTGCGGC CCAGAACATC TAAGGCCATCACAGACCTGT TATTGCCGCG CACTTCCATC GGCTTGAGCC GATAGTCCCC CTAAGAAGCCAGCGGCCCGC AAATGCGGAC CGGGCTATTT AAGGGCCGAG GTCTCGTTCG TTATCGCAATTAAGCAGACA AATCACTCCA CCAACTAAGA ACGGCCATGC ACCACCATCC AAAAGATCAAGAAAGAGCTC TCAATCTGTC AATCCTTATT TTGTCTGGAC CTGGTGAGTT TCCCCGTGTTGAGTCAAATT AAGCCGCAGG CTCCACGCCT TGTGGTGCCC TTCCGTCAAT TTCTTTAAGTTTCAGCCTTG CGACCATACT CCCCCCAGAA CCCAAAAACT TTGATTTCTC GTAAGGTGCCGAGCGGGTCA TCATAGAAAC ACCGCCCGAT CCCTAGTCGG CATAGTTTAT GGTTAAGACTACGACGGTAT CTGATCGTCT TCGATCCCCT AACTTTCGTT CCCTGATTAA TGAAAACATCCTTGGCGAAT GCTTTCGCAG TAGTTAGTCT TCAGCAAATC CAAGAATTTC ACCTCTGACAGCTGAATACT GACGCCCCCG ACTATCCCTA TTAATCATTA CGGCGGTCCT AGAAACCAACAAAATAGAAC CGCACGTCCT ATTCTATTAT TCCATGCTAA TGTATTCGAG CAAAGGCCTGCTTTGAACAC TCTAATTTTT TCACAGTAAA AGTCCTGGTT CCCCCCACAG CCAGTGAAGGCCATGGGATT CCCCAGAAGG AAAGGTCCAG CCGGACCAGT ACTCGCGGTG AGGCGGACCGGCCAGCCAGA CCCAAGGTTC AACTACGAGC TTTTTAACTG CAACAACTTT AATATACGCTATTGGAGCTG GAATTACCGC GGCTGCTGGC ACCAGACTTG CCCTCCAATT GTTCCTCGTTAAGGGATTTA GATTGTACTC ATTCCAATTA CGAGACCCGA AAGAGCCCCG TATCAGTATTTATTGTCACT ACCTCCCCGT GTCGGGATTG GGTAATTTGC GCGCCTGCTG CCTTCCTTGGATGTGGTAGC CGTTTCTCAG GCTCCCTCTC CGGAATCGAA CCCTAATTCC CCGTTACCCGTTGCCACCAT GGTAGGCCAC TATCCTACCA TCGAAAGTTG ATAGGGCAGA AATTTGAATGAACCATCGCC GGCGCAAGGC CATGCGATTC GTTAAGTTAT TATGAATCAC CAAGGAGCCCCGAAGGGCAT TGGTTTTTTA TCTAATAAAT ACACCCCTTC CGAAGTCGGG GTTTTTAGCATGTATTAGCT CTAGAATTAC CACAGGTATC CATGTAGTAA GGTACTATCA AATAAACGATAACTGATTTA ATGAGCCATT CGCAGTTTCA CAGTATAAAG TGCTTATACT TAGACATGCATGGCTTAATC TTTGAGACAA GCATATGACT ACTGGCAGAA TCAACCAGA
权利要求
1.一种土生曲霉，其特征在于命名为土生曲霉Aspergillus sp.Ym31966土生曲霉Ym31966，该菌株已在国家知识产权局专利局指定的保藏单位保藏，保藏日期为2002年3月27日，保藏单位名称中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO.M202016。
2.根据权利要求1所述的土生曲霉，其特征在于其18rRNA基因组由1729个碱基组成TTTGACCAAC TTTCCGGCTC TGGGGGGTCG TTGCCAACCC CCTGGAGCCA GTCCGAAGGCCTCACCGAGC CATTCAATCG GTAGTAGCGA CGGGCGGTGT GTACAAAGGG CAGGGACGTAATCGGCACGA GCTGATGACT CGTGCCTACT AGGCATTCCT CGTTGAAGAG CAATAATTGCAATGCTCTAT CCCCAGCACG ACAGGGTTTA ACAAGATTAC CCAGACCTCT CGGCCAAGGTGATGTACTCG CTGGCCCTGT CAGTGTAGCG CGCGTGCGGC CCAGAACATC TAAGGGCATCACAGACCTGT TATTGCCGCG CACTTCCATC GGCTTGAGCC GATAGTCCCC CTAAGAAGCCAGCGGCCCGC AAATGCGGAC CGGGCTATTT AAGGGCCGAG GTCTCGTTCG TTATCGCAATTAAGCAGACA AATCACTCCA CCAACTAAGA ACGGCCATGC ACCACCATCC AAAAGATCAAGAAAGAGCTC TCAATCTGTC AATCCTTATT TTGTCTGGAC CTGGTGAGTT TCCCCGTGTTGAGTCAAATT AAGCCGCAGG CTCCACGCCT TGTGGTGCCC TTCCGTCAAT TTCTTTAAGTTTCAGCCTTG CGACCATACT CCCCCCAGAA CCCAAAAACT TTGATTTCTC GTAAGGTGCCGAGCGGGTCA TCATAGAAAC ACCGCCCGAT CCCTAGTCGG CATAGTTTAT GGTTAAGACTACGACGGTAT CTGATCGTCT TCGATCCCCT AACTTTCGTT CCCTGATTAA TGAAAACATCCTTGGCGAAT GCTTTCGCAG TAGTTAGTCT TCAGCAAATC CAAGAATTTC ACCTCTGACAGCTGAATACT GACGCCCCCG ACTATCCCTA TTAATCATTA CGGCGGTCCT AGAAACCAACAAAATAGAAC CGCACGTCCT ATTCTATTAT TCCATGCTAA TGTATTCGAG CAAAGGCCTGCTTTGAACAC TCTAATTTTT TCACAGTAAA AGTCCTGGTT CCCCCCACAG CCAGTGAAGGCCATGGGATT CCCCAGAAGG AAAGGTCCAG CCGGACCAGT ACTCGCGGTG AGGCGGACCGGCCAGCCAGA CCCAAGGTTC AACTACGAGC TTTTTAACTG CAACAACTTT AATATACGCTATTGGAGCTG GAATTACCGC GGCTGCTGGC ACCAGACTTG CCCTCCAATT GTTCCTCGTTAAGGGATTTA GATTGTACTC ATTCCAATTA CGAGACCCGA AAGAGCCCCG TATCAGTATTTATTGTCACT ACCTCCCCGT GTCGGGATTG GGTAATTTGC GCGCCTGCTG CCTTCCTTGGATGTGGTAGC CGTTTCTCAG GCTCCCTCTC CGGAATCGAA CCCTAATTCC CCGTTACCCGTTGCCACCAT GGTAGGCCAC TATCCTACCA TCGAAAGTTG ATAGGGCAGA AATTTGAATGAACCATCGCC GGCGCAAGGC CATGCGATTC GTTAAGTTAT TATGAATCAC CAAGGAGCCCCGAAGGGCAT TGGTTTTTTA TCTAATAAAT ACACCCCTTC CGAAGTCGGG GTTTTTAGCATGTATTAGCT CTAGAATTAC CACAGGTATC CATGTAGTAA GGTACTATCA AATAAACGATAACTGATTTA ATGAGCCATT CGCAGTTTCA CAGTATAAAG TGCTTATACT TAGACATGCATGGCTTAATC TTTGAGACAA GCATATGACT ACTGGCAGAA TCAACCAGA
3.根据权利要求1所述的土生曲霉，其特征在于培养基培养特征为PDA培养基28℃培养7天，菌落直径28mm，13天38mm。菌落浅咖啡色，扁平疏松粉状，边缘稍不整齐，中间凸起，背面黄褐色，有同心环，有浅黄色素。
4.根据权利要求1所述的土生曲霉，其培养基培养特征在于麦芽汁培养基28℃培养7天，菌落直径33mm，13天40mm，菌落浅咖啡色，扁平疏松粉状，边缘不齐，中部有放射沟纹，背面褐色。
5.根据权利要求1所述的土生曲霉，其培养基培养特征在于察贝克培养基28℃培养7天，菌落直径23mm，13天37mm。菌落浅浅黄带肉红色，粉状，中间绒状，稍紧密，边缘不齐，有黄色水珠，背面橘红色，稍有沟纹。
全文摘要
本发明涉及微生物技术领域，特别是涉及一种以三七为基质通过发酵而获得的具有抗人类心脑血管疾病或抗肿瘤药用成份的微生物。所述的土生曲霉命名为土生曲霉Aspergillussp.Ym31966土生曲霉Ym31966，是从我国云南省土壤样品中分离得到，该菌株已在国家知识产权局专利局指定的保藏单位保藏，保藏日期为2002年3月27日，保藏单位名称中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO.M202016。其显著的有益效果在于能使三七药用成分的含量得以提高，并改变其原药用成分的种类。
文档编号C12N1/14GK1454988SQ03103059
公开日2003年11月12日 申请日期2003年1月22日 优先权日2002年4月30日
发明者陈有为, 李绍兰, 李治滢, 杨丽源, 周斌, 张琦 申请人:云南省微生物研究所