专利名称：水稻工程保持系的培育方法及其在水稻普通核不育系繁殖中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及作物不育系的繁殖技术领域，具体涉及一种自花授粉类作物雄性不育系的繁殖方法。
背景技术：
利用植物的雄性不育性培育雄性不育系，再借助这种遗传工具来大量生产杂交种子，能使许多作物特别是自花授粉作物的杂种优势得以在生产上应用。按照三型学说，植物的雄性不育分为细胞质雄性不育、细胞核雄性不育和质核互作型雄性不育三种遗传类型。 细胞质雄性不育指不育性状仅受细胞质基因控制，与细胞核无关，单纯由细胞质控制的不育性状由于找不到恢复系，所以在生产上还没有应用实例。细胞核雄性不育指不育性状仅受控于细胞核基因，与细胞质无关，分为显性核不育和隐性核不育。目前已发现的核不育大多是隐性核不育。质核互作型雄性不育由细胞质基因和细胞核基因共同控制，既有保持系使其不育性得以保持，又能在恢复系的帮助下恢复F1杂交种的育性，这种类型的不育系与保持系、恢复系形成三系配套，是目前生产上最经典、最成熟的方法，即三系法。但是三系法的育种程序和生产环节较复杂，以致选育新组合的周期长、效率低、推广环节多、速度慢，同时种子成本高、价格贵。在细胞核雄性不育类型中，隐性核不育依据不育性是否对环境因子敏感，又分为环境敏感核不育和普通核不育。环境敏感核不育，目前主要指光温敏核不育，其育性既受核不育基因控制，又受外界光照长短和温度高低的调控，在一定的发育时期，长日、高温导致不育，短日、低温导致可育，具有育性转换的特征，可以一系两用，比三系减少一系，也即常说的两系法。光温敏不育系除了不需要保持系、繁育简易且效率更高外，还具有1)恢复谱广，几乎所有同亚种的正常品种都能使其育性恢复正常；2)遗传行为简单，不育性由I 2对隐性基因控制，容易转育和稳定，有利于培育多种类型的不育系。但是也应当指出，由于光温敏不育系的育性受外界光照和温度调控，如果在不育系繁殖过程中光照和气温变化不在控制范围内，将导致光温敏不育系繁殖减产甚至失败。普通核不育一般不受外部环境因子的影响，不管环境条件怎样变化，总是表现为不育，这种不育类型在自然界中比较常见。与质核互作型不育和光温敏核不育相比，普通核不育具有以下特点1)由于只受一对隐性核基因的控制，且育性不受环境影响，容易选育出不育率和不育株都为100%的普通核不育系；2)育性正常的品种都是它的恢复系，恢复谱及其广泛，配组自由使得选育优良组合的几率大增；3)能紧跟常规稻的选育步伐，开辟籼粳亚种间杂种优势新领域，使水稻产量在现有杂交水稻基础上实现更高产目标。因此，普通核不育是一种理想的不育材料。但由于这种类型的不育系没有相应的保持系，且自身不能进行育性转换，繁殖非常困难，暂未能在生产上大面积应用。目前，普通核不育系主要采用回交和无性繁殖来繁殖后代，例如，CN102121052A号中国专利文献记载了利用分子标记辅助选择通过回交来创制和繁殖水稻隐性核不育系。CN101946715A号中国专利文献中记载了利用小孢子培养和无性克隆技术选育和繁殖甘蓝型油菜隐性核不育系。另外，有文献报道水稻的普通核不育系还可以再生繁殖，棉花的普通核不育系可以扦插繁 殖。通过上述方法，科研工作者可以繁殖得到少量的普通核不育系用于科研和实验，但是繁殖得到的普通不育系数量稀少，而且需要花费大量的人力物力。如果能解决普通核不育系大规模繁殖的问题，将普通核不育系这一类型大规模应用于杂交制种，将极大地释放杂种优势的利用潜力。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种水稻工程保持系的培育方法及培育后产品在水稻普通核不育系繁殖中的应用，培育后的水稻工程保持系产品可机械化、规模化应用于水稻普通核不育系的繁殖制种，且能够使繁殖制种过程的步骤简单、操作方便。为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为一种水稻普通核不育系的工程保持系的培育方法，包括以下步骤
(1)准备基因型为SS的水稻普通核不育系，采用图位克隆的方法定位并克隆所述水稻普通核不育系的不育基因s(通过同源比对预测不育基因功能，并通过基因敲除和过表达技术验证该不育基因s的功能)；
(2)根据上述不育基因的序列设计引物，克隆出上述水稻普通核不育系来源亲本(基因型为SS)的等位基因，即野生型基因S，由于不育基因s是从野生型基因S突变得到，因此，该野生型基因S即能够恢复所述水稻普通核不育系育性的可育基因；不育基因s与可育基因S之间一般仅有一个碱基或几个碱基的差异，也可以是一个DNA片段的缺失或插入；可育基因S以其自身启动子驱动(启动子为编码区的前2kb的序列)；
(3)将颜色标记基因C与上述的可育基因S连接到同一个双元表达载体上，使颜色标记基因C与可育基因S在导入植物后能连锁遗传、共分离(在水稻中，如果连锁率为99%，则颜色标记基因C与可育基因S的物理距离相隔250X IO3碱基，本发明中C与S中间没有间隔碱基，连锁为100%，两者共分离)，得到双元表达载体pSe ；
(4)采用现有的转基因方法(优选为农杆菌介导法或基因枪转化法)将所述双元表达载体PSe转入所述的水稻普通核不育系中，通过PCR筛选得到带有颜色标记基因C的水稻普通核不育系的育性恢复株系(Ttl代转基因株系)；本发明培育的育性恢复株系中由于导入有可育基因S，而可育基因S对不育基因s为显性，因此Ttl代转基因株系及其后代株系将恢复育性；又由于颜色标记基因C与可育基因S共分离，T0代转基因株系及其后代株系的可育性状与颜色标记将连锁遗传，因此收获该育性恢复株系种子后，可以根据结实率和颜色标记并辅助PCR检测结果，通过不断地自交繁殖(一般通过2 5代的自交繁殖即可)，可获得育性稳定、结实率高且带有颜色标记基因C的纯合株系(通过测交验证其基因型为SeSe)；
(5)将所述纯合株系(基因型为SeSe)与普通核不育系(ss)回交，根据是否发荧光或PCR检测确定回交后代是否携带颜色标记基因C，并通过southern blot检测回交后代颜色标记基因的拷贝数，获得单拷贝插入的工程保持系(基因型sSe)。上述的培育方法中，所述的水稻普通核不育系可以是通过遗传选育、物理化学诱变、基因工程及其他各种手段或正规途径获得，优选物理化学诱变方法。所述水稻普通核不育系的不育性状是由单基因控制的隐性性状，所述可育基因S对不育基因s为显性，且不育性状不受外界环境条件影响。在优选的方案中，由于不育性状只受一对隐性核基因的控制，且育性不受环境影响，因此更容易选育出不育率和不育株都为100%的普通核不育系。上述的培育方法，所述步骤(3)中，所述双元表达载体优选为植物双元表达载体，具体优选为 pCAMBIA1300、pCAMBIA1301、pCAMBIA1390、pCAMBIA3301、pBI121 中的任意一种(特别优选为 PCAMBIA1300 或 pCAMBIA1390)。上述的培育方法，所述步骤(3)中，颜色标记基因C能在种子中表达，使种子带有颜色标记，以便于后续应用中色选出带有该颜色标记基因的种子。所述的颜色标记基因优选为红色荧光蛋白基因(GenBank: DQ493888. 2)、红色荧光蛋白标记基因似P(GenBank: GQ495894. 1)、绿色荧光蛋白基因^FKGenBank: AF286456. 1)、绿色荧光蛋白基因從F/7 (GenBank: JX445134. 1)或蓝色荧光蛋白基因屈尸产(GenBank: EF030494.1)，其中更优选为红色荧光蛋白基因或绿色荧光蛋白基因從F/7。根据所述颜色标记基因C在种子中的表达部位，可以选择合适的特异性表达启动子，例如，颜色标记基因C在胚乳表达就选择胚乳特异性表达启动子，胚乳特异性启动子有=Petl (GenBank: EU264103. I)和Pelum(GenBank: AY427569. I 或 GenBank: JN389781. I)。上述的培育方法中，所述不育基因S优选为mspl、pairl、pair2、zepl、mell、pssl、tdr、udtl、gamyb4、ptcl、api5、wdal、cyp704B2、dpw、tmds3、osc6、ripl、csa 或 ait/Z,所述可育基因S为对应的水稻野生型基因(可根据登录号可以在NCBI上获得相应基因序列，所述步骤(2)中的引物根据相应基因序列设计即可)。作为一个总的技术构思，本发明还提供一种上述培育方法获得的工程保持系在水稻普通核不育系繁殖中的应用，所述工程保持系为带有单拷贝颜色标记基因C且基因型为sSc的株系，该工程保持系是通过将共分离的可育基因S和颜色标记基因C导入普通核不育系受体(SS)后，与普通核不育系(SS)回交选育所得，因此所述工程保持系的遗传背景与水稻普通核不育系(SS)基本一致，唯一差别在于工程保持系的基因组中插入了共分离的颜色标记基因C与可育基因S ;繁殖普通核不育系时，将该工程保持系与基因型为SS的水稻普通核不育系杂交，在杂交后代中同时获得工程保持系种子和水稻普通核不育系种子(二者的比例一般为I : I左右);此时，颜色标记基因C在种子特异性表达启动子驱动下，特异地在工程保持系种子中表达，通过色选机即可将所述工程保持系种子分选出来，依据颜色分选出来的基因型为sSe的工程保持系种子，可以继续与基因型为ss的水稻普通核不育系杂交，繁殖基因型为sSe的杂合种子与基因型为ss的普通核不育系种子；剩下的种子即为基因型为ss的水稻普通核不育系种子，不含转基因成分，可以与恢复系杂交用于杂交制种，也可以与基因型为sSe的杂合种子杂交，用于自身材料的繁殖和延续。与现有技术相比，本发明的优点在于
(I)通过转基因手段创制工程保持系来繁殖水稻普通核不育系，繁殖得到的水稻普通核不育系不含转基因成分；且育性正常的品种都是该水稻普通核不育系的恢复系，恢复谱极其广泛，配组自由，使得选育优良组合的几率大增；能紧跟常规稻的选育步伐，开辟籼粳亚种间杂种优势新领域，使水稻产量在现有杂交水稻基础上实现更高产目标；
(2)繁殖过程简单，繁殖效率高不育系繁殖不受环境条件制约，种子纯度高；虽然比两系法多了一个工程保持系，但该工程保持系不需要额外繁殖，在繁殖水稻普通核不育系的同时，可由机器色选出工程保持系；
(3)智能分选，操作方便采用机器智能分选代替人工控制，为大规模机械化制种提供了可能。
图I为本发明实施例中普通核不育系繁殖的工艺流程图。图2为本发明实施例中构建的胚乳特异性红色荧光蛋白表达载体VTDIfsRed。
图3为本发明实施例中southern blot检测4个纯合单株(TDfed / TD严、与普通核不育系(ss)回交后代的插入拷贝数,其中，I为Marker ；2和4为单拷贝插入；5为双拷贝插入；3为无杂交信号。
具体实施例方式以下结合说明书附图和具体优选实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。实施例
水稻切/ (Tapetum Degradation Retardation)基因编码的蛋白控制水稻绒粘层的降解，是水稻绒毡层发育和降解调控网络中的重要因子。如果TS/ 基因发生突变，水稻花药绒粘层将退化，导致水稻花粉败育，产生一种水稻普通核不育系(参见CN1884541A号中国专利文献)。一种本发明的水稻普通核不育系的工程保持系在水稻普通核不育系繁殖中的应用，其应用的具体对象即为本实施例上述的Wr基因突变体的普通核不育系，具体包括以下步骤(工艺流程可参见图I)
I.60Co-Y射线诱变，获得一株水稻不育突变体，根据遗传分析表明该不育性状由一个隐性单基因(即不育基因)控制，属于一种水稻普通核不育系(基因型为tdr/tdr、。我们也可从突变体库RiceGE购买水稻普通核不育突变体，网址http://signal. salk. edu/cgi-bin/RiceGE ;常见的可适用于本发明方法的核不育基因如下表I所示
表I :水稻普通核不育突变体列表
权利要求
1.一种水稻工程保持系的培育方法，包括以下步骤 (1)准备基因型为SS的水稻普通核不育系，通过采用图位克隆的方法定位并克隆所述水稻普通核不育系的不育基因s ； (2)根据上述不育基因的序列设计引物，克隆出上述水稻普通核不育系来源亲本的可育基因S，该可育基因S能够恢复所述水稻普通核不育系育性； (3)将颜色标记基因C与上述的可育基因S连接到同一个双元表达载体上，使颜色标记基因C与可育基因S在导入植物后能连锁遗传、共分离，得到双元表达载体pSe ； (4)采用现有的转基因方法将所述双元表达载体pSe转入所述的水稻普通核不育系中，最后得到水稻普通核不育系的育性恢复株系SeSe ； (5)将所述育性恢复株系的纯合株系与普通核不育系ss回交，获得基因型为sSe单拷贝插入的株系，即为工程保持系。
2.根据权利要求I所述的培育方法，其特征在于所述水稻普通核不育系的不育性状是由单基因控制的隐性性状，所述可育基因S对不育基因s为显性，且不育性状不受外界环境条件影响。
3.根据权利要求I所述的培育方法，其特征在于所述步骤(3)中，所述双元表达载体为植物双元表达载体，具体为 pCAMBIA1300、pCAMBIA1301、pCAMBIA1390、pCAMBIA3301 或pBI121。
4.根据权利要求3所述的培育方法，其特征在于所述植物双元表达载体为PCAMBIA1300 或 pCAMBIA1390。
5.根据权利要求I所述的培育方法，其特征在于所述步骤(3)中，所述的颜色标记基因为红色荧光标记基因红色荧光蛋白标记基因似P、绿色荧光蛋白基因ffP、绿色荧光蛋白基因EGFP或蓝色荧光蛋白基因EBFP。
6.根据权利要求5所述的培育方法，其特征在于所述的颜色标记基因为红色荧光蛋白基因DsRed或绿色荧光蛋白基因EGFP。
7.根据权利要求2 6中任一项所述的培育方法，其特征在于所述不育基因s为mspl、pairl、pair2、zepl、mell、pssl、tdr、udtl、gamyb4、ptcl、api5、wdal、cyp704B2、dpw、mads3、osc6、ripl、csa或ait/Z,所述可育基因S为对应的水稻野生型基因。
8.根据权利要求2 6中任一项所述的培育方法，其特征在于所述步骤(4)中的转基因方法为农杆菌介导法或基因枪转化法。
9.一种如权利要求I 8中任一项所述培育方法获得的工程保持系在水稻普通核不育系繁殖中的应用，其特征在于所述工程保持系为带有单拷贝颜色标记基因C且基因型为sSe的株系，所述工程保持系是在所述水稻普通核不育系的基因组中插入了共分离的颜色标记基因C与可育基因S，在繁殖水稻普通核不育系时，将该工程保持系与基因型为ss的水稻普通核不育系杂交，在杂交后代中同时获得工程保持系种子和水稻普通核不育系种子，再通过色选机将所述工程保持系种子分选出来，剩下的种子即为基因型为ss的水稻普通核不育系种子。
全文摘要
本发明公开了一种水稻工程保持系的培育并将培育的工程保持系应用于水稻普通核不育系繁殖的方法，包括以下步骤先采用图位克隆的方法定位并克隆水稻普通核不育系的不育基因s和不育系来源亲本的可育基因S；将颜色标记基因C与可育基因S连接到同一个双元表达载体上，使二者在导入植物后能连锁遗传、共分离；采用转基因方法将表达载体转入普通核不育系中，得到育性恢复株系；再将其与普通核不育系回交，获得工程保持系。本发明培育的工程保持系与水稻普通核不育系杂交，在杂交后代中可同时获得工程保持系种子和水稻普通核不育系种子。本发明可机械化、规模化应用于水稻普通核不育系的繁殖制种，且能够大大简化普通核不育系的繁殖过程。
文档编号C12N15/82GK102876711SQ201210426678
公开日2013年1月16日 申请日期2012年10月31日 优先权日2012年10月31日
发明者袁定阳, 李新奇, 李莉, 段美娟, 余东, 邝翡婷, 宋书锋, 李娜, 谭炎宁, 孙志忠, 袁光杰, 袁贵龙, 符习勤, 赵炳然, 张大兵, 袁隆平 申请人:湖南杂交水稻研究中心