专利名称：鉴别水稻苯达松敏感致死基因的分子标记方法
技术领域：
本发明涉及一种植物分子标记技术，确切地说是一种鉴别水稻苯达松敏感致死基因的分子标记方法。
化学致死标记在杂交稻生产实际中具有非常重要的意义。黄大年等曾成功地应用转基因技术将抗除草剂草丁磷基因导入杂交稻恢复系(《科学通报》1998，43(1)67～70)，从而达到快速检验杂交稻和提高杂交稻制种纯度的目的。
苯达松(bentazon)为一种苯并噻二唑类(benzothiadiazole)除草剂，主要用于水稻、小麦、大豆和花生田间除草。普通水稻品种具有对苯达松的抗性，0.5％苯达松溶液喷施于水稻苗期仍表现安全无害，且在各生育期使用均十分安全。日本学者Mori通过辐照水稻品种农林8号(Norin8，简称N8)，发现一个对苯达松极其敏感的突变体农林8号m(Norin8m，简称N8m)0.5～500ppm的苯达松对3.5～4叶期农林8号m即表现为程度不同的伤害(叶卷缩直至全株死亡)。此外1999年我国学者张集文等采用350Gy60Coγ-射线辐照处理水稻光-温敏雄性不育系W6154S并经田间选育获得对苯达松敏感的光-温敏雄性不育系8077S。Mori、张集文等、陈忠明等还研究表明农林8号m、8077s所表现出的苯达松敏感致死性状都由单个隐性核基因控制。因此，苯达松敏感致死基因(以ben表示，其等位苯达松抗性基因用Ben表示)作为一种化学致死标记在杂交稻制种过程中有特殊的意义。若将该基因转育到恢复系中，则能获得可混播制种、进行机械化操作的杂交组合；将其转育到不育系尤其是两系不育系中，可望解决两系杂交稻制种所担心的因温度变化而影响杂交制种纯度的重大难题。但由于ben基因为隐性核基因，杂交的当代性状表现为苯达松抗性，从F2代开始出现分离，特别是在田间选育中，需要喷施苯达松来进行鉴定，若苯达松浓度和剂量控制不当以及喷施不均匀极易造成所需材料的死亡或误选，而且常规的田间选育工作量大、周期长。为此，若利用分子生物学技术寻找到与ben基因紧密连锁的分子标记，以便对农林8号m为供体材料转育的后代进行PCR检测，则可有效地指导田间选育，加速育种进程。
具体内容如下首先提取农林8号和农林8号m(由日本育种学会原会长武田元吉先生赠送、安徽省农科院绿色食品研究所繁殖)基因组DNA，然后用360个10bp寡核苷酸随机引物(美国Operon公司，编号为A、B、C、D、E、F、G、H、I、R、S、T、U、V、W、X等系列引物)进行RAPD多态性标记，最终有5个引物在农林8号和农林8号m之间扩增出7个多态性标记，其中引物OPG18在农林8号和农林8号m之间扩增出共显性多态性标记，分别记作OPG18/972和OPG18/943；对RAPD标记重扩增、纯化、克隆和测序，OPG18/972和OPG18/943全序列见图3。OPG18/972和OPG18/943两端起始10bp均与引物OPG18碱基相同或反向互补，两者相比，仅从第862bp起始，OPG18/972比OPG18/943多29bp，其余序列完全相同。
根据RAPD测序结果人工设计合成以下PCR引物标记 引物序列(5′→3′)SCAR/G18/883正向GGCTCATGTGCATGCATGCTTACT反向GGACTAATTAAGGTCGTAAACTTTTSCAR/G18/890正向GGCTCATGTGCATGCATGCTTACT反向AGGGTGTATATATACTTCTTCCGSCAR/G18/304/333正向GCACCGCACAAAACACTCTA反向CAGTGTCCAGGGGAGTAGGA用上述引物进行PCR反应，将RAPD标记转化为SCAR标记。标记SCAR/G18/883对应OPG18/943位点特有序列，其引物在农林8号m和杂合体(性状表现为苯达松抗性，基因型为杂合型)中均扩增883bp特征带；标记SCAR/G18/890对应OPG18/972位点特有序列，其引物在农林8号和杂合体中扩增出890bp特征带；标记SCAR/G18/304/333为共显性标记，其引物在农林8号m中扩增出304bp特征带，在农林8号中扩增出333bp特征带，在杂合体中同时扩增出304bp和333bp特征带。此外，本发明还成功地将SCAR标记应用于田间辅助育种选择，利用SCAR/G18/883和SCAR/G18/890组合经过两次PCR反应或者仅仅利用SCAR/G18/304/333经过一次PCR反应均可区别出转育材料是否含有ben基因以及是含ben基因的纯合体(ben/ben)还是含ben基因的杂合体(Ben/ben)。这种共显性的分子标记对于选育隐性核基因ben基因更为有效，可以防止在选育的早期漏选，能够有效区别表现为抗性但已转入ben基因的杂合体。
图2来源于农林8号和农林8号m的多态性标记OPG18/972和OPG18/943克隆经EcoR酶切鉴定。
图3育种材料的PCR分析。
M为λDNA+EcoRI+HindIII分子量标记，N8为农林8号，N8m为农林8号m，编号1～26同表1A.标记SCAR/G18/883 B.SCAR/G18/890 C.SCAR/G18/304/333
2、RAPD反应及电泳RAPD反应体积为35μl，其中包括0.1mmol·L-1的dNTP混合物，0.2μmol·L-1的10碱基寡核苷酸随机引物(美国operon公司产品，)2u TaqDNA聚合酶和50g左右的水稻基因组DNA，用PE9600 DNA扩增仪(美国Perkin-Elmer公司产品)进行扩增，反应程度为94℃1min、36℃1min、72℃2min的设置进行35个循环，循环结束后在72℃下延伸5min。扩增产物在1.4～2.0％的琼脂糖凝胶上电泳1.5～4h(5v/cm)，以DNA+EcoRI+HindIII为DNA分子量标记，溴化乙锭(ethidium bromide)染色，紫外灯下观察，凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司产品)拍照记录。在前所述的360个10bp寡核苷酸随机引物中，引物OPG18在农林8号和农林8号m之间扩增出共显性标记，如
图1所示，分别记作OPG18/972和OPG18/943。
3、RAPD标记重扩增、克隆和测序RAPD标记产物电泳后，用干净的解剖刀片切下含多态性标记的琼脂糖胶块，放入1.5ml Eppendorf管中，于-20℃冰箱中过夜冻融，取上层液相作为模板在相同的RAPD反应条件下再扩增1次，重扩增产物电泳后切取含标记带的琼脂糖胶块，用QIAEXIIDNA提取试剂盒(美国Qiagene公司产品)提纯。多态性片段经连接反应连接到载体pCRTM2.1(美国Invitrogen公司产品)，按使用说明进行连接反应，分别用CaCl2法和冻融法制备和转化感受态细胞InV。F′，在LB+Km50mg/L+X-gal的培养基上筛选白色单菌落，用质粒提取试剂盒(上海Sangon公司产品)提取质粒DNA，用于酶切鉴定和测序。经提取质粒DNA、EcoRI酶切鉴定表明筛选的单菌落为阳性克隆子，如图2所示。用ABI3700型DNA自动测序仪(美国ABI公司产品)测定多态性标记的DNA碱基序列。测序结果附后(第8页)。
4、根据RAPD标记两端序列人工设计合成以下PCR引物标记 引物序列(5′→3′)SCAR/G18/883 正向GGCTCATGTGCATGCATGCTTACT反向GGACTAATTAAGGTCGTAAACTTTTSCAR/G18/890 正向GGCTCATGTGCATGCATGCTTACT反向AGGGTGTATATATACTTCTTCCGSCAR/G18/304/333 正向GCACCGCACAAAACACTCTA反向CAGTGTCCAGGGGAGTAGGA用上述引物进行PCR反应，将RAPD标记转化为SCAR标记，此SCAR标记可成功地应用于对水稻苯达松敏感致死基因的田间辅助育种的选择。
5、SCAR标记应用实施例(1)含ben基因的恢复系及不育系的田间转育利用农林8号m为ben基因的最初供体材料转育恢复系和两系光温核不育系，转育配组结果见表1。其中r011-4为早期利用农林8号m转育恢复系获得的对苯达松敏感的稳定株系。
(2)PCR分析结果PCR反应体系是每35μl反应体积中含10×反应缓冲液(buffer)3.5μl，dNTP(2mmol·L-1，Promega公司)2μl，正、反向引物(1pmol/μl，上海Sangon公司合成)各2μl，Taq DNA聚合酶(2u/μl，Biostar公司)o.75μl，模板DNA(约50ng/μl)2μl。反应程序为94℃45s、58℃45s、72℃1min30s进行35个循环，最后在72℃延伸5min，反应结束后于4℃贮存备用，1.4％琼脂糖凝胶电泳1.5～2h、5v/cm，溴化乙锭染色、在紫外光下用凝胶成像系统(Bio-Rad公司)观察拍照记录结果。
用标记SCAR/G18/883、SCAR/G18/890、SCAR/G18/304/333引物对上述转育材料在分蘖初期分别进行了PCR检测，表1和图3为部分检测结果。其中，标记SCAR/G18/883引物在含敏感基因纯合体(ben/ben)及杂合体(Ben/ben)中均扩增出883bp的特征带；SCAR/G18/890引物在含抗性基因纯合体(Ben/Ben)及杂合体(Ben/ben)中只扩增出890bp的特征带；SCAR/G18/304引物在含抗性基因纯合体(Ben/Ben)中扩增出333bp特征带，在含敏感基因纯合体(ben/ben)中只扩增出304bp特征带；而在含敏感基因的杂合体(Ben/ben)中同时扩增出304bp和333bp的特征带，并且利用SCAR/G18/883和SCAR/G18/890组合及单独利用SCAR/G18/304/333鉴定结果相同。
(3)田间喷施苯达松鉴定结果本发明研究中，为了验证SCAR标记辅助选择的可靠性，我们依然调查了所有利用分子标记鉴定的转育材料的单株对苯达松的反应情况。在齐穗期喷施0.1％苯达松水溶液、900ml/ha，敏感株在喷施后7d出现伤害症状，表现为叶片呈开水烫伤状卷曲，10d后药伤逐渐消失，而抗性单株未见任何伤害症状，鉴定结果见表1。
根据PCR分析和田间鉴定，二者鉴定结果一致。可以看到表1中，编号2、5、7、8、9、21、23、26均表现为对苯达松抗性，但其中5和8为杂合基因型，其通过自交或再与农林8号m或与敏感株系r011-4杂交可获得苯达松敏感的材料，仍有育种价值；但编号2、7、9、21、23、26的材料均需淘汰。
通过分子标记辅助田间选育，农林8号m转育恢复系H121已到第8代，转育恢复系轮回422及改良的两系不育系培矮64/78039均到第9代，这些世代株系均对苯达松敏感，且保持原恢复系或不育系的优良性状，说明ben基因已转育成功，将可望应用于三系或两系杂交稻新组合的配制。表1水稻苯达松敏感致死基因转育后代的分子标记鉴定结果。植株编号亲缘关系 世代 分子标记鉴定 田间鉴定1 香125s/r011-4 F4 敏感敏感2 (x07s/r011-4)F2//r011-4///x07sF2 抗性(纯合基因型)抗性3 (x07s/r011-4)F2//r011-4///x07sF2 敏感敏感4 (x07s/r011-4)F2//r011-4///x07sF2 敏感敏感5 (x07s/r011-4)F2//r011-4///x07sF2 抗性(杂合基因型)抗性6 香125s/r011-4 F4 敏感敏感7 PA64s//(PA64/r011-4)F3F2 抗性(纯合基因型)抗性8 PA64s//(PA64/r011-4)F3F2 抗性(杂合基因型)抗性9 PA64s//(PA64/r011-4)F3F2 抗性(纯合基因型)抗性10农林8号m×H121F7 敏感敏感11农林8号m×H121F7 敏感敏感12农林8号m×H121F8 敏感敏感13农林8号m×H121F8 敏感敏感14农林8号m×轮回422 F8 敏感敏感15农林8号m//培矮64/78039F9 敏感敏感16农林8号m//培矮64/78039F9 敏感敏感17农林8号m//培矮64/78039F9 敏感敏感18农林8号m//轮回422/78039 F3 敏感敏感19农林8号m//轮回422/78039 F3 敏感敏感20农林8号m//轮回422/78039 F3 敏感敏感21农林8号m//轮回422/78039 F3 抗性(纯合基因型)抗性22农林8号m//轮回422/78039 F3 敏感敏感23农林8号m//轮回422/78039 F3 抗性(纯合基因型)抗性24农林8号×轮回422 F9 敏感敏感25农林8号×轮回422 F9 敏感敏感26农林8号//轮回422/78039F3 抗性(纯合基因型)抗性多态性标记OPG18/972和OPG18/943的全序列(5′→3′)Sequences of polymorphic fragments OPG18/972 and OPG18/943(5′→3′)OPG18/972 GGCTCATGTGCATGCATGCTTACTGTGTAACCGATCAGTTCATATTTATCTTTTTTTTTAAAAACACACACACACACACAAATACC 86OPG18/943 GGCTCATGTGCATGCATGCTTACTGTGTAACCGATCAGTTCATATTTATCTTTTTTTTTAAAAACACACACACACACACAAATACC 86OPG18/972 ATGTACTCCACTACAATTGTAGATAGATACCTTAGAGCAGTGGTGTAGTTAGAATTTTCTCACGCCTAAAGCACAACTAGTATAAT 172OPG18/943 ATGTACTCCACTACAATTGTAGATAGATACCTTAGAGCAGTGGTGTAGTTAGAATTTTCTCACGCCTAAAGCACAACTAGTATAAT 172OPG18/972 TTACATAATTTACCTTTATTTTTCGTGTTTTGAAGTTTTTAAATGTAACTTTTAATAGATATTTAAGCTTAGGGCAACAGCCCTAA 258OPG18/943 TTACATAATTTACCTTTATTTTTCGTGTTTTGAAGTTTTTAAATGTAACTTTTAATAGATATTTAAGCTTAGGGCAACAGCCCTAA 258OPG18/9T2 CTGCCCTACCCAGTTTTCGTCACTGCGCCTAGAGAAATATACCTTTTTTTTAAAAAAAAAGAAAAACACTAAAAAGAAAGAAAAGA 344OPG18/943 CTGCCCTACCCAGTTTTCGTCACTGCGCCTAGAGAAATATACCTTTTTTTTAAAAAAAAAGAAAAACACTAAAAAGAAAGAAAAGA 344OPG18/972 AAAAGGAGTAGGAGTCGGCGTCATGGCCACGTCAGGCCGGCGTCGCTGCAGCAGCGGCGGTGGCGTGGCCTCCATTGCGCATACAT 430OPG18/943 AAAAGGAGTAGGAGTCGGCGTCATGGCCACGTCAGGCCGGCGTCGCTGCAGCAGCGGCGGTGGCGTGGCCTCCATTGCGCATACAT 430OPG18/972 GGAGAGCATCCGGCTGATCTGGTCCCTGTACTAGCAGAACCCTAGCTAAGCTTAGCTCCATTGTCTCCAACTTGCGATCGATCCAT 516OPG18/943 GGAGACCATCCGGCTGATCTGGTCCCTGTACTAGCAGAACCCTAGCTAAGCTTAGCTCCATTGTCTCCAACTTGCGATCGATCCAT 516OPG18/972 CCATCCATCCATTAATTTCCGCGATCCAATCGAACCACGATATGTGTAAAGCTATAGCATATCTACAGTCACTCCATGCTGCACCG 602OPG18/943 CCATCCATCCATTAATTTCCGCGATCCAATCGAACCACGATATGTGTAAAGCTATAGCATATCTACAGTCACTCCATGCTGCACCG 602OPG18/972 CACAAAACACTCTAATCAGAATTAATTAATTAATTAATTATATAATCATCCATCCTATTTTAAATACATTAGCGGGTTTCCGTGTT 688OPG18/943 CACAAAACACTCTAATCAGAATTAATTAATTAATTAATTATATAATCATCCATCCTATTTTAAATACATTAGCGGGTTTCCGTGTT 688OPG18/972 TGTCGTTTGACCGCACATCTTATTTAACGAATTTATAAAAAAAATAAAAAAAAGTCGCGCATAAAATATTATTCATGTTTTATCAT 774OPG18/943 TGTCGTTTGACCGCACATCTTATTTAACGAATTTATAAAAAAAATAAAAAAAAGTCGCGCATAAAATATTATTCATGTTTTATCAT 774OPG18/972 CTAATAGCAACAAAAATACTAATCAAAAAGTTTAAAACAAAACGAACGATCAAACTTTAGACATAGAAATCCACATACATACTTAA 860OPG18/943 CTAATAGCAACAAAAATACTAATCAAAAAGTTTAAAACAAAACGAACGATCAAACTTTAGACATAGAAATCCACATACATACTTAA 860OPG18/972 AATGGAACGGAAGAAGTATATATACACCCTAGTTTACGACCTTAATTAGTCCTACTCCCCTGGACACTGCCCTCTTCTTTAATTAA 946OPG18/943 AA-----------------------------GTTTACGACCTTAATTAGTCCTACTCCCCTGGACACTGCCCTCTTCTTTAATTAA 946OPG18/972 CTAAATAATTAATTAACACATGAGCC 1032OPG18/943 CTAAATAATTAATTAACACATGAGCC 103权利要求
1.一种人工设计合成的核苷酸分子，其特征在于具有下列碱基组成的特定序列的寡聚体(1)正向5′GGCTCATGTGCATGCATGCTTACT3′反向5′GGACTAATTAAGGTCGTAAACTTTT3′(2)正向5′GGCTCATGTGCATGCATGCTTACT3′反向5′AGGGTGTATATATACTTCTTCCG3′(3)正向5′GCACCGCACAAAACACTCTA3′反向5′CAGTGTCCAGGGGAGTAGGA3′。
2.一种鉴别水稻苯达松敏感致死基因的分子标记方法，包括基因组DNA的提取、RAPD多态性标记及其重扩增、纯化、克隆和测序，其特征在于以权利要求1叙述的核苷酸分子为引物，通过PCR反应得到SCAR标记。在SCAR标记中，引物(1)对含ben基因的纯合体和杂合体有883bp特征带；引物(2)对Ben基因的纯合体和杂合体有890bp特征带；引物(3)对含ben和Ben基因的纯合体分别有304bp和333bp特征带，对杂合体则同时具有304bp和333bp特征带。
全文摘要
一种鉴别水稻苯达松敏感致死基因的分子标记方法，包括基因组DNA的提取、RAPD多态性标记及其重扩增、纯化、克隆和测序，其特征在于根据RAPD多态性标记两端序列人工合成由一定数量的碱基组成特定序列的核苷酸分子，以此核苷酸分子为引物，通过PCR反应得到SCAR标记，分析SCAR标记中的特征带就能鉴别出转育的材料中是否有ben基因(水稻苯达松敏感致死基因)，并能进一步区别ben基因的纯合体和杂合体，从而指导田间选育，加速育种进程。
文档编号C12Q1/68GK1415623SQ02138080
公开日2003年5月7日 申请日期2002年8月5日 优先权日2002年8月5日
发明者杨剑波, 向太和, 李莉, 汪秀峰, 倪大虎, 张毅, 朱启升, 杨前进 申请人:安徽省农业科学院