专利名称：菜豆萎蔫病菌的检测基因及其检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明菜豆萎蔫病菌的检测基因及其检测试剂盒，属于植物病原菌的检测领域，尤其是对菜豆萎蔫病的病原菌Curtobacterium flaccumfacies pv.flaccumfacies(Cff)的检测。专用于菜豆萎蔫病的田间预防及海关植物检疫的Cff的快速检测。
菜豆萎蔫病是我国的一类危险性病害，本世纪首次在美国被发现，现在澳大利亚、加拿大、欧洲、非洲南部地区均报道有发生；除了危害菜豆外，还可危害大豆、绿豆、豇豆、扁豆、丁葵草、月豆等多种豆科植物，人工接种对玉米也有致病作用。菜豆萎蔫病菌属于革兰氏阳性菌，可侵染菜豆植株地上部分所有组织，在幼苗期引起植株矮化而导致产量下降，可产生带病种子，严重时植株死亡。受害幼苗的叶片萎蔫、枯死，该过程中伴随深绿色或褐色病斑。成株期感病后叶片出现深绿色、褐色或红褐色软化的病斑，病害很快发展成系统性侵染，茎上出现锈色病斑，维管束变褐，豆荚出现黄绿色病斑，感病的种子具有不同大小和形状的黄色病斑，严重时种皮下有厚厚的一层细菌，表面侵染的种子则仅仅在种脐处有少许的黄色菌脓。该病害侵染大豆时表现为细菌性褐斑病，只在叶片上出现症状，侵染其它豆科植物时均表现为萎蔫症状。每年此病害能在世界范围内造成很大的经济损失[张贵等，菜豆萎蔫病及其检疫。现代化农业，1997，221(12)11；C.Stapp，Bacterial plant pathogens，1961，100，Oxford University Press]。
到目前为止还没有特别有效的化学药剂或抗性品种来防治此病害，因为Cff主要通过种子传播，所以目前主要控制方法是通过种子检验检疫。全世界的学者都认为，有必要建立一种准确率和灵敏度均高的快速检测方法来检测Cff，尤其是无症状的植株或种子的检测。由于该病是我国的一类检疫性病害，因此在我国检疫是主要的控制此病害的手段，严格限制或禁止从发生此病害的国家和地区进口菜豆等种子，从其它国家进口的种子必须进行有关的检验。目前Cff具体的检测手段主要是；1.症状观察，但只能作为初步检验，做出初步判断；2.分离、纯化病原菌，进行革兰氏、鞭毛染色和生理生化反应特性测定。对于Cff，可以使用523，NBY+TTC和NBY+刚果红三种选择性培养基做作为分离培养基(赵友福和高泉准等，菜豆萎蔫病菌的种子检验鉴定技术研究。植物检疫，1997(3)129-133)。3.利用BIOLOG鉴定系统来检测。BIOLOG鉴定系统是一种快速、相对准确且标准化程度高的鉴定系统，主要根据细菌鉴定对95种碳源的利用情况，将结果经计算机处理后并与数据库内已知的细菌比较，实现对待测菌的快速鉴定及检测。但此系统对于Cff来说，只能在种水平上进行鉴定，且准确率为98.5％，而且还需对病原菌先进行分离[赵友福等，利用BIOLOG鉴定系统快速鉴定菜豆萎蔫病菌的研究。植物病理学报，1997，23(2)139-144]。4.血清学方法。有人在试验中制备了三种Cff菌株的抗血清，并将之等量混合进行间接免疫荧光染色试验(IIF)，结果表明能与所有的Cff菌株反应，但也能和豌豆带化红球菌和密执安棒型杆菌花叶亚种有弱阳性反应，检测的灵敏度达到4.5×104cfu/ml[赵友福和陈红燕等，菜豆萎蔫病菌的血清检测鉴定技术研究。植物检疫，1997(4)193-198]。事实上用于检测Cff的筛选出的单克隆或多克抗体在特异性和灵敏度上也有缺点，例如不能和所有的Cff菌株杂交或存在与其它相近病菌的交叉反应，影响其阳性鉴定。
最近的一个可选择的检测方法是分子生物学方法。在国外已经有较好的例子报道。巴西曾报道说从Cff染色体基因文库中筛选出一个克隆Ppmp-26经过EcoI/Sac I酶切后，得到一个片段仅与Cff杂交而与其它植物病原细菌包括菜豆上的其它原核生物无反应，将此片段亚克隆后进行测序，与数据库中已经报道的序列无很大的同源性。然后根据此片段的序列设计出一对特异性引物可以仅对Cff有反应而与其它细菌无交叉反应[Guimaraes PM，Palmano S，et.al.，Development ofa PCR test for the detection of Curtobacterium flaccumfacies pv.flaccumfacies，Antonie Van Leeuwenhoek，2001，80(1)1-10]。
随着近年来我国口岸进口豆类作物的增多，该病菌从疫区进入我国的机会亦增多，但我国口岸缺乏必要的对该病菌的检测方法。病害防治、预测预报及植物检疫需要有准确快速的病菌检测方法，尤其是需要我国拥有自主知识产权的检测方法，从而可以将之投入到商业生产和应用中，目前在这一领域还没有一种既灵敏特异又快速的Cff检测方法的报道。此项发明满足了这些需求。
本发明的目的是提供菜豆萎蔫病菌的检测基因及其检测试剂盒，克隆Cff的一段位于16S-23S rDNA间的ITS序列，并以此设计出一对Cff的特异性引物和其检测试剂盒，使用该试剂盒达到对样本中Cff的快速准确的检测。
本发明菜豆萎蔫病菌的检测基因及其检测试剂盒的技术方案是菜豆萎蔫病菌(Cff)的检测基因，其序列位于16S-23S rDNA之间，长度为387bp，序列如下1AGTGCTGGTC GCCCATCATG GGTGGTTGGT TGCTGGTCCA GGCGCCTGTT TCGGACCGAA61 CGTGTCCGAC GGGTAGCTCA TGGGTGGAAC ATTGACAGTG CAGTTGGGAG TGATGCTTCC121 GACCTCAGTA CGCTCTGCTT GCAGGGTTGG GACGGGTCGA GGGTGGAGCT GCTGGCTGGT181 GCACGTTGTT GGGTCCTGAG GGACCAGGCT TCCTACTGTC ACGTGAGTGG TGGTGGGGGT241 TGGGCCTACG GGTCCTTCGT CGGGCCAGGG TGAACCTACT GTTGTGGTGG GGGAGTGCTG301 GTGCCGATCG TATGTTGAGA ACTACACAGT GGACGCGAGC ATCTTTGATT CGCGTCATCC361 ATGATCAACC TTCGGGTTGG TCTGGTG上述菜豆萎蔫病菌(Cff)的检测基因，其引物序列如下CffA1(5′-3′AGTGCTGGTCGCCCATCAT)/CffA2(5′-3′CACCAGACCAACCCGAAGGT)；检测上述菜豆萎蔫病菌(Cff)基因的试剂盒，含有1)10×PCR缓冲液300mM-500mM KCl；10mM-20mM MgCl2；60mM-100mM Tris-HCl；2)10×dNTP(Mixture)5-10mM；3)10×引物CffA1/引物CffA25-15μM；4)Tag酶本发明与现有其它技术相比，其优点表现在(1)本发明提供一段Cff的检测基因及其高效准确的检测试剂盒。应用该试剂盒可在半天之内达到对Cff快速、简便、准确、灵敏的检测，灵敏度达到2pg纯DNA或3×102CFU/ml，准确性与组织印迹免疫结合分析方法(tissueblot-immunobinding assay，TB-IBA)相当。
(2)不需要对样品中的病原菌进行分离和纯化；步骤简单易操作，不需要太多复杂和高级仪器。因为使用了特异性引物和PCR反应，所以可以达到很高的准确率和灵敏度，可以在半天之内完成对样品的检测。这对于海关的植物检疫工作有重要意义。
(3)内源转录间隔区(Intemal Transcribed Spacers)的英文缩写为ITS，同时包含保守与变异序列，能根据变异序列设计特异性引物进行扩增比较，为病原菌的鉴定和检测提供了很好的靶位点。例如甘蔗叶烧病病原白纹黄单胞的检测(Y.B.Pan，M.P.Grisham，D.M.Bumer，A polymerase chain reaction protocolfor the detection of Xanthomonas albilineans，the causal agent of sugarcane leaf scalddisease.Plant disease，1997，81189-194.)，甘蔗根生苗矮化病病原Cl.xyli subsp.xyli的检测(Y.B.Pan，M.P.Grisham，K.E.Damann，et.，A polymerase chainreaction protocol for the detection of Clavibacter xyli subsp.xyli，the causal agent ofsugarcane ratoon stunting disease.Plant disease，1998，82285-290.)等。
图1通用引物L1/L2对14个参试菌的扩增结果电泳图。
M为Marker，1-14依次代表49174、19096、15831、15830、15828、Ta-19、2626、2550、2566、2632、2594、2584、CV30、BR。
图2引物CffA1/CffA2对22个供试菌的扩增结果电泳图。
上排从左至右为2607、5833、Ta-19、2626、2550、Ga5、JM110、psp2、Ch10、LE24、A6；下排从左至右为2566、2632、2594、2584、CV30、BR、49174、19096、15831、5830、15828。
图3引物CtA1/CtA2对22个供试菌的扩增结果电泳图。上排从左至右为2607、5833、Ta-19、2626、2550、Ga5、JM110、psp2、Ch10、LE24、A6；下排从左至右为2566、2632、2594、2584、CV30、BR、49174、19096、15831、5830、15828。
实施例1Cff的特异性引物CffA1/CffA2的PCR扩增。通过原核生物ITS通用引物L1/L2(L15’-AGTCGTAACAAGGTAGCCGT-3’，L25’-GTGCCAAGGCATCCACC-3’)，分别对Cff及其它相关细菌和对照细菌的基因组DNA进行PCR扩增，均得到了一条长度为500bp左右的PCR产物(Cur.plantarum除外)(图1)。这些相关细菌包括萎蔫短小杆菌甜菜致病变种(Curf.pv.betae，ICMP 2594)，萎蔫短小杆菌奥氏致病变种(Cur.f.pv.oortii，ICMP2632)，萎蔫短小杆菌一品红致病变种Cur.f.pv.poinsettiae(ICMP 2566)，落葵叶斑病病原菌(Cur.f.pv.basellae，BR)，甜菜叶斑病病原菌(Cur.f.pv.beticila，CV30)，密执安棒形杆菌密执安亚种(Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis，ICMP 2550)，小麦拉氏杆菌(Cl.tritici，ICMP 2626)，方氏棒形杆菌(Cla.fangii，Ta-19)[陈永芳等，落葵上发现短小杆菌属(Curtobacterium)一个新的致病变种。植物病理学报，2000(2)171-175。]，柠檬色短小杆菌(Cur.citreum，ATCC 15828)，金黄色短小杆菌(Cur.albidum，ATCC 15831)，白色短小杆菌(Cur.luteum，ATCC 15830)，极小短小杆菌(Cur.pusillum，ATCC 19096)，Cur.plantarum(ATCC 49174)[任欣正，植物病原细菌的分类和鉴定。1994，农业出版社。]。将PCR产物进行玻璃奶回收，并连接到PUC-T载体中，转化到大肠杆菌JM110感受态细胞中，进行测序，获得所有的参试菌株的ITS序列。其中Cff的ITS全序列为(522bp)1AGTCGTAACA AGGTAGCCGT ACCGGAAGGT GCGGCTGGAT CACCTCCTTT CTAAGGAGCA61 TCTGGTCAGT GCTGGTCGCC CATCATGGGT GGTTGGTTGC TGGTCCAGGC GCCTGTTTCG121 GACCGAACGT GTCCGACGGG TAGCTCATGG GTGGAACATT GACAGTGCAG TTGGGAGTGA181 TGCTTCCGAC CTCAGTACGC TCTGCTTGCA GGGTTGGGAC GGGTCGAGGG TGGAGCTGCT241 GGCTGGTGCA CGTTGTTGGG TCCTGAGGGA CCAGGCTTCC TACTGTCACG TGAGTGGTGG301 TGGGGGTTGG GCCTACGGGT CCTTCGTCGG GCCAGGGTGA ACCTACTGTT GTGGTGGGGG361 AGTGCTGGTG CCGATCGTAT GTTGAGAACT ACACAGTGGA CGCGAGCATC TTTGATTCGC421 GTCATCCATG ATCAACCTTC GGGTTGGTCT GGTGTGACGT TGGATCGCAA TTTTAATCTT481 TGTGGTCAAG TTTCTAAGAG CAAACGGTGG ATGCCTTGGC AC应用分子生物学软件，将所得序列及数据库中已报道序列进行同源性比较，设计出以下Cff引物序列CffA1(5′-3′AGTGCTGGTCGCCCATCAT)/CffA2(5′-3′CACCAGACCAACCCGAAGGT)；使用本发明中的试剂盒配方分别对Cff和其它21个参试菌株的提取的Cff的DNA和纯培养物进行PCR扩增。反应组成(20μl体系)(1)10×PCR缓冲液350mM KCl；15mM MgCl2；75mM Tris-HCl；(2)10×d NTP(Mixture)7 mM；(3)10×引物CffA1/引物CffA28μM；(4)Tag酶。循环过程为(1)95℃ 5分钟；(2)94℃ 30秒，64℃ 30秒，72℃ 40秒，28个循环；(3)72℃ 10分钟。
22个参试细菌除Cff外的21个参试菌株分别是Cur.f.pv.betae(2594)、Cur.f.pv.oortii(2632)、Cur.f.pv.poinsettias(2566)、Cur.flaccumfaciens pv.basellae(BR)、Cur.f.pv.beticila(CV30)、Curtobacterium citreum(15828)、Cur.luteum(15830)、Cur.albidum(15831)、Cur.pusillum(19096)、Cur.plantarum(49174)、Cl.m.subsp.michiganense(2550)、R.tritici(2626)、Cl.fangii(Ta-19)、带化红球菌(Rhodococcus facians，ICMP 5833)，美国冬青节杆菌(Arthrobacterilicis，ICMP 2607)，巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium，Ga5)，茄青枯菌(Ralstonia solanacearum，LE24)，丁香假单胞菌菜豆致病变种(pseudomonassyringae，psp2)，菊欧文氏菌(Erwinia chrysanthemi，Ch10)，根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens，A6)，大肠杆菌(Escherichia coli，JM110)[任欣正，植物病原细菌的分类和鉴定。1994，农业出版社]。引物CffA1/CffA2可以稳定地扩增Cff到分子量为387bp的特异性产物；产物序列为1AGTGCTGGTC GCCCATCATG GGTGGTTGGT TGCTGGTCCA GGCGCCTGTT TCGGACCGAA61 CGTGTCCGAC GGGTAGCTCA TGGGTGGAAC ATTGACAGTG CAGTTGGGAG TGATGCTTCC121 GACCTCAGTA CGCTCTGCTT GCAGGGTTGG GACGGGTCGA GGGTGGAGCT GCTGGCTGGT181 GCACGTTGTT GGGTCCTGAG GGACCAGGCT TCCTACTGTC ACGTGAGTGG TGGTGGGGGT241 TGGGCCTACG GGTCCTTCGT CGGGCCAGGG TGAACCTACT GTTGTGGTGG GGGAGTGCTG301 GTGCCGATCG TATGTTGAGA ACTACACAGT GGACGCGAGC ATCTTTGATT CGCGTCATCC361 ATGATCAACC TTCGGGTTGG TCTGGTGR.tritici也有分子量相近的扩增产物，而其余20个参试菌株则无扩增产物(图2)。平行对照是在各样本中加L1/G1引物，结果均有扩增产物，以排除DNA模板存在问题的可能性。Cff最低检出量是2pg纯DNA或3×102CFU/ml细胞。用生物素标记的522bp的L1/G1引物扩增的PCR产物作为探针，进行Southern杂交，检出灵敏度未能有提高。
实施例2R.tritici的特异性引物CtA1/CtA2的扩增R.tritici(小麦蜜穗病棒形杆菌)是引起小麦蜜穗病的病原菌，它只能侵染小麦和毒麦及一年生牧草，不能侵染双子叶的大豆等。被侵染的幼苗生长受阻，扭曲，有时花部或植物其它部位产生黄色粘质菌脓。小麦粒线虫是传病的媒介。
依照实施例1的方法，得到R.tritici的ITS全序列，参照其它细菌的ITS序列得到其特异性的引物CtA1(5′-3′TTGTCAGTGTTGCCCATTGC)/CtA2(5′-3′ACACCCACACCACAGGCAT)。使用本发明中的试剂盒配方(将引物替换为CtA1/CtA2)对22个参试细菌的提取的DNA和纯培养物进行进行PCR扩增。反应组成(20μl体系)(1)10×PCR缓冲液400mM KCl；12mM MgCl2；70mM Tris-HCl；(2)10×d NTP(Mixture)8mM；(3)10×引物CtA1/引物CtA28μM；(4)Tag酶。循环过程为(1)95℃ 5分钟；(2)94℃ 30秒，64℃ 30秒，72℃ 40秒，30个循环；(3)72℃ 10分钟。扩增结果是Arthrobacter ilicis和目标菌R.tritici均可扩增得到一条分子量相似的产物。而其余的20个菌株包括Cff则无产物。(图3)实施例3对海关截获的带病大豆种子进行的检测。
用2％的次氯酸钠将30克种子表面消毒，无菌条件下打碎，加45ml的0.01MPBS缓冲液(pH7.2)。在样本中加入本发明的试剂盒各组分进行PCR反应。反应组成和循环参数下反应组成(20μl体系)(1)10×PCR缓冲液350mM KCl；10mMMgCl2；80mM Tris-HCl；8％PVP；(2)10×dNTP(Mixture)8mM；(3)10×引物CffA1/引物CffA28μM；(4)Tag酶1U；(5)模板DNA5μl提取液。循环参数预扩增95℃5分钟；94℃30秒，64℃30秒，72℃40秒，28个循环；72℃10分钟延伸。
电泳检测到387bp的清晰产物(呈阳性反应)，阴性对照是相同重量的国内健康的大豆种子。再在样品中加入引物CtA1/CtA2，进行第二轮PCR(反应组成、循环过程同实施例2)，未出现扩增产物(以R.tritici的纯DNA作为阳性对照组模板)，此结果说明样品中存在Cff。
事实上，因为小麦蜜穗病菌不能侵染豆类植物，即使豆类种子中附有少量菌体，经过表面消毒后，存在量一般达不到检测的极限。所以一般情况下，只要在第一轮的PCR中检测到阳性，就可以判断检测物中含有菜豆萎蔫病菌，而不需要进行第二次的CtA1/CtA2为引物的扩增。
实施例4对接种菜豆植株体的检测利用浓度为106-108CFU/ml细菌悬浮液接种二叶期Cff，菜豆品种为农友矮生菜豆。接种方法为针刺法，在真叶和子叶之间的茎上，用针划出约1cm的垂直伤口，涂上菌液，凡士林封伤口，16℃-18℃培养20天。共取50株接种植株分别提取汁液，并在每个样本中加入本发明中的试剂盒各组分进行PCR扩增。反应组成、循环参数如下反应组成(20μl体系)(1)10×PCR缓冲液450mM KCl；17mMMgCl2；90mM Tris-HCl；8％菲可；(2)10×d NTP(Mixture)6mM；(3)10×引物CffA1/引物CffA29μM；(4)Tag酶1U；(5)模板DNA(20ng/μl)3μl。循环参数同实施例3。同时用组织印迹免疫结合分析(tissueblot-immunobinding assay，TB-IBA)的结果作比较(所用的抗体是Cff的多克隆抗体)。比较结果如下
注+表示检测出Cff；-表示未检出Cff。实施例5对大豆植株体的检测随机选取海关获取的大豆种子，在灭菌土中播种，25～30℃条件下生长10天后共取50株幼苗分别提取汁液(提取方法同实施例4)；进行以下PCR扩增反应组成(20μl体系)(1)10×PCR缓冲液400mM KCl；13mMMgCl2；60mM Tris-HCl；8％PVP；(2)10×dNTP(Mixture)5mM；(3)10×引物CffA1/引物CffA213μM；(4)Tag酶1U；(5)模板DNA3μl。循环参数同实施例3。同时用组织印迹免疫结合分析(tissue blot-immunobinding assay，TB-IBA)的结果作比较(所用的抗体是Cff的多克隆抗体)。比较结果如下
注+表示检测出Cff；-表示未检出Cff。
实施例6CffA1/CffA2对海关进口的Cff其它寄主种子的检测结果每种寄主分别检查4批种子，每一批随机抽取5份样本，即每个寄主共20个样本。每个样本取30g种子进行处理(处理方法同实施例4)，进行以下PCR扩增反应组成(20μl体系)(1)10×PCR缓冲液350mM KCl；16mMMgCl2；70mM Tris-HCl；8％PVP；(2)10×dNTP(Mixture)10mM；(3)10×引物CffA1/引物CffA211μM；(4)Tag酶1U；(5)模板DNA3μl。循环参数同实施例4。对照实验依然是用Cff的多克隆抗体进行TB-IBA试验。结果如下
注以上数字表示检测出的阳性样本数。
权利要求
1.菜豆萎蔫病菌(Cff)的检测基因，其序列位于16S-23S rDNA之间，长度为387bp，序列如下1 AGTGCTGGTC GCCCATCATG GGTGGTTGGT TGCTGGTCCA GGCGCCTGTT TCGGACCGAA61 CGTGTCCGAC GGGTAGCTCA TGGGTGGAAC ATTGACAGTG CAGTTGGGAG TGATGCTTCC121GACCTCAGTA CGCTCTGCTT GCAGGGTTGG GACGGGTCGA GGGTGGAGCT GCTGGCTGGT181GCACGTTGTT GGGTCCTGAG GGACCAGGCT TCCTACTGTC ACGTGAGTGG TGGTGGGGGT241TGGGCCTACG GGTCCTTCGT CGGGCCAGGG TGAACCTACT GTTGTGGTGG GGGAGTGCTG301GTGCCGATCG TATGTTGAGA ACTACACAGT GGACGCGAGC ATCTTTGATT CGCGTCATCC361ATGATCAACC TTCGGGTTGG TCTGGTG
2.根据权利要求1所述的菜豆萎蔫病菌(Cff)的检测基因，其引物序列如下CffA1(5′-3′AGTGCTGGTCGCCCATCAT)/CffA2(5′-3′CACCAGACCAACCCGAAGGT)；
3.检测权利要求1或2的菜豆萎蔫病菌(Cff)基因的试剂盒，含有1)10×PCR缓冲液300mM-500mM KCl；10mM-20mM MgCl2；60mM-100mM Tris-HCl；2)10×d NTP(Mixture)5-10mM；3)10×引物CffA1/引物CffA25-15μM；4)Tag酶
全文摘要
菜豆萎蔫病菌(Cff)的检测基因及其检测试剂盒,属于农作物防病治病及植物检疫范畴。基因位于16S－23SrDNA间的内源转录间隔区的核酸序列,试剂盒包括10×PCR缓冲液、10×dNTP(Mixture)、10×引物CffA1/引物CffA2和Tag酶。使用该试剂盒对22个参试细菌进行PCR扩增,Cff产生分子量为387bp的特异性扩增产物,其余不明显。达到对Cff快速、简便、准确、灵敏的检测效果。图为:引物CffA1/引物CffA2对22个供试菌的扩增结果电泳图。
文档编号C12N15/11GK1389571SQ0213795
公开日2003年1月8日 申请日期2002年7月15日 优先权日2002年7月15日
发明者郭坚华, 葛芸英 申请人:南京农业大学