专利名称：一种适用于番茄内标准基因的核酸检测靶序列及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种番茄的核酸检测方法。
背景技术：
随着转基因作物及转基因食品(genetically modified crops/food, GMCs/GMF) 的产业化，其安全性问题逐渐受到广泛关注，各国政府相继出台转基因作物的系列法规、 标准，用以规范GMCs/GMF的研发、生产、上市和贸易流通。欧盟、中国等实行GMCs/GMF的转基因成分标识制度，对转基因植物检测技术的灵敏度和准确性提出了严格的要求。转基因植物基体标准物质和核酸分子标准物质的研制，以及转基因植物定性、定量检测技术研究已成为当前的研究热点，并逐步向国际标准化方向发展。番茄作为重要的GMCs/GMF 之一，在我国已被列入第一批实施标识管理的农业转基因生物(genetically modified organisms, GMOs)目录，建立可与国际接轨的番茄转基因成分标准化检测手段，已是必需。 目前国际上对转基因番茄鉴定方法的研究仍处于起步阶段，对番茄内标准基因的研究报道较少，仍有待研究。内标准基因，是某种植物中具有种间特异性，种内非特异性，低拷贝数特征的一类基因。特定物种的内标准基因是区别其他物种的遗传标志，可用于物种及其产品鉴别、转基因成分检测等诸多领域。内标准基因用于植物基因组DNA的质量或者拷贝数的定量分析， 并且对于转基因的定量检测起着决定性的作用。没有合适的内标准基因是不可能对于转基因植物及其加工产品进行定量分析的，也不能确定转基因植物及其加工产品的准确的转基因含量。寻找、鉴定适宜的内标准基因对转基因作物的检测而言至关重要。番茄内标准基因的研究较玉米、大豆、棉花等农作物略有滞后，国内外的相关报道不多。Mason等在2002 年报道基于番茄apx基因(GenBank Accession No. Y16773)以qPCR方法可估算转基因番茄插入外源基因的量值。深入鉴定具有高度番茄种特异性的内标准基因，进行拷贝数验证及检测体系的特异性、稳定性分析，以建设稳定的具有高度番茄种特异性的内标准检测体系，仍是目前需要解决的重要问题。构建番茄内标准基因核酸检测体系对转基因番茄及其加工产品的定性、定量PCR检测和其生产过程中外源基因拷贝数的测定方面发挥着极其重要的作用。其不但可以对番茄原料，而且对于如番茄酱、番茄饮品等难以从外观上区分的番茄加工品进行定性的检测。对于经过定性检测呈阳性的样品进一步的使用内标准基因为参照的定量PCR的检测如筛选PCR检测、基因特异性PCR检测、构建特异性PCR检测和品系特异性PCR检测，最后通过外源目的基因的拷贝数和番茄内标准基因组拷贝数的比值获得外源目的基因在样品基因组DNA中的百分含量。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种稳定的具有高度番茄种特异性的核酸检测靶标区域的番茄靶基因，该靶基因的拷贝数低且稳定，而且在种间高度特异，种内高度同源，适于作为番茄内标准基因。本发明为解决上述技术问题的方案是—种适用于番茄内标准基因的核酸检测靶序列，该靶序列的序列为，TCTATAAGTG AACTTAACCT TGTCAAGATT TAAATTACTTATTAAGTGAA ATCTGAATAT ATGATTATAT TAACCTTGCCAGGACAAGCC AGAGCCACCA GTGGAAGGTC GCTTGCCGGATGCCACCAAG GGTATGATAG ACTGATAACT TATAGAGCAGATTTTGATTG CAAAACTCCT GTTGAGGAAC ATATTTTTCTTGCAATTTAC CTGTCTTGGT AATCATATGT AATACCTAATGCAGGCTGTG ACCACTTGAG AGACGTGTTC AAGAAACAAATGGGTCTTTC TGACCAGGAT ATTGTTGCAC TCTCTGGTGCCCATACCTTG GTTTGTTGCC TGTTCTTAAT GTTTAATCTTATTTTTTGCT AGGTTCTATT CCTATATGCT TATTTCTTAGTGATATTTTT CCAGGGAAGG GCACACAAGG AGCGTTCTGGTTTTGAAGGA CCTTGGACTG CCAATCCCCT TATCTTTGACAATTCATACT TCACGTAATG ATACTGAAGT TACACATCTTTTTTCAGTTC TCCATTTTGT GGAACTTGTT CATTTGTGGAGTACTGTTTA ACTGCTAACT AT(SEQ ID NO. 1)。上述核酸检测靶序列的分子量为582bp，分子类型为DNA。本发明所述的靶基因制备方法如下1)分别提取出凤梨、红运6、花城、金丰、金福、金禧、玛利亚、美嘉、蒙罗丽莎、魔域、年丰、夏丰、新铁甲、中原988和益丰15种番茄的总gDNA，并以其为模板，再以5’ -F GTGATTGTTCTCCGTTATGC-3，为上游引物，以 5，-R TGGGACTGATGATAGTTAGC-3‘为下游引物， 按常规PCR进行扩增，获得每一种番茄的扩增片段，其扩增程序为98°C变性IOmin后进入循环，98°C 15s，55°C 15s，72°C 30s，共 30 个循环，最后一步为 72°C IOmin 延伸；2)回收并纯化每一种番茄(共15种)的扩增片段，然后送交广州英俊公司和华大基因公司分别进行三次双向测序，以DNAMAN等生物信息学软件分析，取该扩增片段中15种番茄均呈现同源性100%的区域的DNA序列，即获得SEQ ID NO. 1所示的靶序列。本发明所述的靶基因的拷贝数鉴定采用Southern blot和双重荧光定量PCR技术鉴定，证实其在9种不同地域来源的国内外番茄品种中均呈单拷贝，因此它适于作为番茄内标准基因进而制成质粒标准分子或标准物质，对番茄和转基因番茄及其加工产品的定性和定量检测。其中，所述的质粒标准分子可以是常见的重组质粒，即选用市售的质粒，如 pEasy-T3等，按常规基因克隆方法插入SEQ ID NO. 1所示靶标核酸序列的重组质粒；所述的标准物质可以是上述的质粒标准分子，亦可以是常见的工程菌菌株，如将上述重组质粒 (质粒标准分子)转入E. coli等工程菌所得到的菌株。本发明所述的核酸检测靶序列及含该靶序列的重组质粒可进一步开发成定性和定量检测番茄的试剂盒，该试剂盒的具体方案如下一种检测番茄的荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒由定量阳性模板、阴性对照品、 DNA聚合酶、引物和荧光探针组成，其特征在于
(1)所述的引物为扩增SEQ ID NO. 1所示靶序列的引物，其中，上游引物序列为5，-ACATATTTTTCTTGCAATTTACCTG-3，(SEQID NO. 2)下游引物序列为5，-CTGGTCAGAAAGACCCATTTG-3，(SEQID NO. 3)(2)所述的荧光探针序列为5，HEX-CGTCTCTCAAGTGGTCACAGCCTG-BHQ13，(SEQ ID NO. 4)其中 HEX 标记的是标记探针5’端的荧光基团，BHQl是标记探针3’端淬灭基团；(3)所述定量阳性模板是含序列为SEQ ID NO. 1的DNA片段的重组质粒。本发明所述试剂盒，经常规PCR和qPCR验证，该引物和探针都具有特异性。重复性的扩增效率在 99. 102. 4%, R2在0. 997 0. 999之间，RSD范围在3. 18% 15.之间。采用本发明所述试剂盒对8种非番茄作物和9种番茄的检定证实其具有高度的特异性，LOD达到 5. 5个拷贝(45个循环内)，并且能稳定实现对不同番茄以至混合番茄gDNA量值测试，可广泛应用于对番茄和转基因番茄及其加工产品的定性和定量检测。
图1为本发明所述的重组质粒pfesy-T3-TZ的构建示意图。图中粗黑色线条示含 SEQ ID NO. 1所示序列的纯化线性DNA片段，自EcoRI位点插入pEasy-T3空载体中，克隆链接获得重组质粒pEasy-T3-TZ。图2为15种不同地域来源的番茄SEQ ID No. 1 qPCR核酸检测区序列比对图，图中左侧标识为具体15种番茄品种名称，SEQ ID No. 1为本发明所述序列；SEQ ID No. 2为本发明中核酸检测试剂盒的上游引物，SEQ ID No. 3 RC为本发明所述核酸检测试剂盒的下游引物的反转互补序列，在图中，引物对以线框示出；SEQ ID No. 4 RC为本发明所述核酸检测试剂盒的Taqman探针的反转互补序列，探针以黑色下划线示出。图3为9种不同地域来源番茄gDNA的Southern blot杂交结果图，图中，M为DNA 分子量标准；1为益丰番茄gDNA ；2为花城番茄gDNA ；3为益丰4号番茄gDNA ；4为金丰番茄gDNA ；5为中研番茄gDNA ；6为中蔬5号番茄gDNA ；7为红运6号番茄gDNA ；8为凤梨番茄gDNA ；9为年丰番茄gDNA。图4为SEQ ID No. 1所示靶序列的扩增曲线图和所建立的标准曲线图.其中，图中5条曲线代表所测定的番茄gDNA的量值自上向下依次为5 X 10，5 X 1，5 X 0. 1，5 X 0. 01， 5X0. 002,5X0. OOlng/μ 1。图5为采用本发明所述核酸检测PCR试剂盒对番茄种特异性测试的结果图，其中，A图为本发明所述核酸检测PCR试剂盒对番茄和非番茄植物品种的PCR产物电泳图谱，A图中，M为DNA分子量标准；1为益丰番茄gDNA ；2为生菜gDNA ；3为白菜gDNA ；4为苹果gDNA ；5为菠菜gDNA ；6为玉米gDNA ；7为土豆gDNA ；8为葡萄gDNA ；9为香蕉gDNA ；B图为本发明所述核酸检测PCR试剂盒对12种番茄的PCR产物电泳图谱，B图中， M为DNA分子量标准；1为阴性对照；2为益丰番茄gDNA ；3为花城番茄gDNA ；4为益丰4号番茄gDNA ；5为金丰番茄gDNA ；6为中研番茄gDNA ；7为中蔬5号番茄gDNA ；8为红运6号番茄gDNA ；9为凤梨番茄gDNA ；10为年丰番茄gDNA ；11为玛利亚番茄gDNA ；12为蒙罗丽莎 gDNA ；C图为本发明所述核酸检测PCR试剂盒对番茄和非番茄植物品种的qPCR结果图，图中9条阳性曲线是9种不同地域来源番茄qPCR测试结果，阴性线(下基线)为对非番茄品种测试结果。
具体实施例方式实施例1 :(核酸检测靶序列的制备及鉴定)1、番茄基因组的提取1. 1) CTAB 法提取番茄 DNA①取国内外不同地域来源的番茄种子，无土栽培，采集番茄幼苗叶片；②取6ml的 3XCTAB，加Iml β-巯基乙醇，置65°C水浴中预热；③用液氮研磨Ig去掉叶柄的幼嫩叶片， 然后迅速加入预热的3XCTAB提取液，摇勻，置65°C水浴60min，期间，每IOmin摇动一次； ④加入等体积的氯仿/异戊醇04 1)，完全混勻后，4°C 5000rpm离心IOmin;⑤取上清， 重复4 一次；⑥取上清，加入等体积的异丙醇，室温沉淀DNA，IOOOOrpm离心lmin，DNA沉淀再用70%乙醇沉淀两次，干燥DNA后，加入TE重悬DNA，加入RNase A溶液，混勻后于37°C 消化50min;⑦分别用等体积的氯仿/异戊醇04 1)抽提一次；⑧分别加入1/10 3M NaAc (PH5. 0)和2倍体积的无水乙醇，于_20°C放置30min，4°C 14000rpm离心15min ；⑨用 70%乙醇清洗沉淀两次，DNA干燥后溶于适量的双蒸水中，-20°C保存备用。2、核酸检测靶序列的提取2. 1)分别提取出凤梨、红运6、花城、金丰、金福、金禧、玛利亚、美嘉、蒙罗丽莎、魔域、年丰、夏丰、新铁甲、益丰和中原988等1 5种番茄的总gDNA，并以其为模板，再以5’-F: GTGATTGTTCTCCGTTATGC-3，为上游引物，以 5，-R :TGGGACTGATGATAGTTAGC_3，为下游引物， 按常规PCR进行扩增，获得每一种番茄的扩增片段，其扩增程序为98°C变性IOmin后进入循环，98°C 15s，55°C 15s，72°C 30s，共 30 个循环，最后一步为 72°C IOmin 延伸；2. 2)回收并纯化每一种番茄(共1 5种)的扩增片段，然后送交广州英俊公司和华大基因公司分别进行三次双向测序，以DNAMAN等生物信息学软件分析，取该扩增片段中 15种番茄均呈现同源性100%的区域的DNA序列，即获得SEQ ID NO. 1所示的靶序列。实施例2 (重组质粒pEasy-T3_TZ及工程菌株E-coli-pfesy-T3-TZ的制备)1、含本发明所述核酸检测靶序列的重组质粒pEasy-T3-TZ的克隆(1)连接购买北京全式基因公司的T载体试剂盒，具体操作步骤按说明书，简述如下取试剂盒中提供的线性化载体pEasy-T3 Vector 1 μ 1加入微量离心管中，再加入本发明所述的实施例1中方法制备的2μ1含SEQ ID NO. 1所示序列的纯化经测序验证的线性DNA片段1 5ι^/μ1，加入2μ1 dH20，室温放置5-15min，获得重组质粒的连接液。重组质粒的克隆连接图见图1.(2)转化把感受态细胞DH5 α从_80°C冰箱取出，置于冰中；加入步骤(1)中制备获得的含有SEQ ID NO. 1所示序列的重组质粒连接液5 μ 1 ；冰中放置30min ；42°C下放置45s ；冰中放置2 ;3min ；加入37°C LB液体培养基Iml ；37°C下振荡lh(120r/min)；取转化菌液涂布LB氨苄青霉素固体培养平板，37°C恒温培养箱培养12-16小时，挑取其3个菌落放入LB氨苄青霉素液体培养基5. 2ml中摇菌扩增Mh，获得待鉴定的含重组质粒的工程菌。2、重组质粒提取
取步骤1 ( 制备获得的3份待鉴定的重组质粒的工程菌液5ml (注菌液管中留存少许菌，对应做好标记，待鉴定完成后，扩繁制备工程菌株)离心10，OOOglmin ；弃上清， 加入250 μ 1 裂解液/R Nase A悬浮细胞和，上下颠倒4 6次轻轻混勻；加入去污剂， 轻轻混勻，上下颠倒直到白色X状物形成，加入碱性液，轻轻混勻；离心10，OOOg IOmin ； 小心把清澈的上清加入到干净的HiBind DNA Miricolumn中，离心10，OOOg Imin ；去液， 力口 700 μ 1 DNA wash buffer，离心 10，OOOglmin ；弃液，力口 700 μ 1 DNA wash buffer，离心10，OOOg Imin ；把空管放入干净的1. 5ml离心管中，加入去离子水50 μ 1，离心10，OOOg 2min，获得待鉴定的重组质粒。3、重组质粒及其工程菌株的鉴定取步骤2制备的待鉴定重组质粒，初步酶切证实克隆成功后，对应找到所留存的待鉴定的工程菌株，菌株扩繁后与该重组质粒一并送交广州英俊公司和华大基因公司进行序列测定，三次双向测定并经生物信息学软件DNAMAN分析确证序列的准确性，具体序列如SEQ ID NO. 1所示。经此确证后，即本发明所述含SEQ ID NO. 1所示序列的重组质粒 pEasy-T3-TZ 及其工程菌株 E-coli-pEasy-T3_TZ。4.重组质粒pEasy-T3_TZ及工程菌株E-coli-pfesy-T3-TZ的制备保存鉴定后的重组质粒pEasy-T3-TZ及其工程菌株E-coli-pfeSy-T3-TZ以上述步骤 2方法进行大量制备，其中菌株制备成含15%甘油的甘油菌，于-70°C保存备用。5.重组质粒pEasy-T3_TZ线性化以及纯化因qPCR检测试剂盒中需要制备纯化的线性化质粒，其线性化及纯化步骤如下往微量离心管中加入2μ 1 250-500ng/y 1构建成功、含有SEQ ID NO. 1的重组质粒，1 μ 1 Apa Ι，2μ1 Buffer, 15 μ 1 dH20 ；在 37°C下放置 3_4h ；在 0. 8%琼脂糖电泳 5-lOmin ；切胶后按照重量加入纯化液，60°C水浴15-25min ；小心把清澈的上清加入到干净的HiBindTMDNA Miricolumn 中，10，OOOg 下离心 Imin ；去液，力口 700 μ IDNA wash buffer，10，OOOg 下离心 Imin ；把空管放入干净的1. 5ml离心管中，加入去离子水50 μ 1，10，OOOg下离心lmin，得到纯化的线性化pEasy-T3-TZ重组质粒，_20°C保存备用。实施例3 (试剂盒的组成和制备)针对SEQ ID NO. 1所示序列核酸检测靴序列，应用Beacon Designer version7. 51 软件(美国PREMIER Biosoft International公司)设计出引物和荧光探针(图2)，再按荧光定量PCR试剂盒的常规组成获得下述荧光定量PCR试剂盒上游引物序列为5，-ACATATTTTTCTTGCAATTTACCTG-3，(SEQ ID N0. 2)，浓度为 10 μ mol/L ；下游引物序列为5，-CTGGTCAGAAAGACCCATTTG-3，(SEQ ID N0. 3)，浓度为 10 μ mol/L ；荧光探针序列为5，HEX-CGTCTCTCAAGTGGTCACAGCCTG-BHQ1 3，(SEQ ID N0. 4)， 浓度为10 μ mol/L ；定量阳性模板上述实施例2所制备的纯化的线性化的正确插入SEQ ID NO. 1所示序列的pEasy-T3-TZ重组质粒，浓度为50 μ mol/L ；DNA聚合酶qPCR Mix酶，购自广州复能基因公司；阴性对照品线性化pEasy-T3质粒，购自北京全式基因公司。
上述荧光定量PCR试剂盒的中，上游引物、下游引物和荧光探针均委托大连 TaKaRa生物工程有限公司公司合成。实施例4(本发明所述核酸检测靶序列性能鉴定及其检测试剂盒效能评价)1.具有核酸检测靶序列(SEQ ID NO. 1)的番茄靶基因拷贝数的验证(Southern blot杂交)(1)反应步骤1)杂交探针的设计①杂交引物为F:5，-GCC ACC AAG GGT ATG ATA GA—3，禾口 R :5，-TGT CTG ACG GCAACT GTAA-3，，片段大小为 549bp。②以此对引物常规PCR扩增番茄基因组获得该序列片段后，使用DNA纯化试剂盒进行片段纯化。③按照DIGHigh Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II 说明书操作将纯化PCR片段置于沸水中3-5min再冰浴，加入DIG-High Prime, 37°C孵育过夜后60°C 灭活-20°C保存备用。2)琼脂糖电泳分离DNA配制0.8%琼脂糖凝胶(不加EB)，上样样品要求达到 3μ g，在50v电压下电泳2. 5小时。；3) Southern blot 转膜前处理 ①ddH20清洗凝胶，加入碱性变性液，在室温下轻摇两次，每次15min ；②ddH20清洗凝胶，加入中性液，在室温下轻摇两次，每次15min ；③加入20 X SSC,在室温下轻摇30min。4)转膜(向下毛细管转移法)目的建立液体自液池经凝胶向尼龙膜的下行流路，以洗脱凝胶中的变性DNA并使其聚集在尼龙膜上。从下到上纱布一报纸一纸巾一三张干燥的whatman 3mm滤纸一两张湿的Whatman3mm滤纸一POLL尼龙膜一凝胶一开口的保鲜膜一两张湿的whatman3mm滤纸一湿的纱布一玻片一重物，并转膜48小时。5)预杂交和杂交①加入2XSSC，在室温下轻摇5min(可以去除粘着在尼龙膜上的琼脂糖碎片)；②在UV下交联3min，用水清洗；③加入事先预热(42°C )的预杂交液，在42°C下预杂交1小时；④加入事先预热(42°C )的杂交液，在42°C下杂交10小时；6)检测前处理①加入含有2XSSC、0. 5% SDS的溶液，在室温下轻摇两次，每次5min ；②加入含有0. 5XSSC、0. 5% SDS的溶液，在65°C轻摇两次，每次15min ；③加入洗涤液，在室温下轻摇两次，每次5min ；④加入封阻液，在室温下轻摇50min ；⑤加入抗体液，在室温下轻摇25min ；⑥加入洗涤液，在室温下轻摇两次，每次20min ；⑦加入检测液，在室温下轻摇5min。7)检测加化学发光物质到膜上，用保鲜膜封闭膜，且赶去气泡；在30°C放置5min ；曝光3min ；显影 5min ；定影 lmin。(2)结果对益丰、花城、益丰4号、金丰、中研、中蔬5号、红运6号、凤梨、年丰9种番茄基因组进行Asc I的酶切后进行的Southern blot杂交，结果显示，9种番茄均得到单一的条带， 而杂交条带均大于靶基因预期大小。证明该基因在番茄基因组中呈现稳定的单拷贝(图 3)。2.以实施例3构建的试剂盒建立qPCR标准曲线以及重复性分析(1)样品制备取凤梨番茄，采用实施例1步骤1所述方法分别提取得到总gDNA，运用Picogreen 定值后配制成IOng/μ 1，得到gDNA样品。阳性模板如实施例3所述，如实施例2. 4方法制备的纯化的线性化pEasy-T3-TZ重组质粒。(2)qPCR 反应体系具体试剂盒构成如实施例3所述。qPCR反应体系如下，空白对照以超纯水代替模板 DNA。
成分加样量
模板DNA5μ1
上游引物(lOpmol/μΙ)0.5μ1
下游引物(lOpmol/μΙ)0.5μ1
DNA mix10μ1
荧光探针(lOpmol/μΙ)0.4μ1
DEPC 水3.6μ1
总体积20μ1扩增条件95°C预变性IOmin ；95°C IOs,60°C 30s程序进行40个循环。在退火 600C 30s时，Mx3005P qPCR扩增仪进行实时荧光信号收集，记录Ct值。(3)实验方法取凤梨番茄gDNA，稀释成浓度为 5X10,5X1,5X0. 1,5X0. 01,5X0. 002ng/ μ 15 个梯度，作为待测番茄gDNA;将待测番茄gDNA按照上述步骤⑵的条件和方法进行个PCR反应。(4)实验结果其结果如图4所示，荧光定量PCR标准曲线相关系数R2 = 0. 999，扩增效率Eff = 102. 1 %，回归方程 Y = 47. 91-3. 273X。定量检测体系的重复性(Itepeatability)是指不同时间段重复实验之间的差异， 用标准偏差(Standard Deviation, SD)和相对标准偏差(Relative Standard Deviation, RSD)来表示。本研究通过三次重复实验对检测体系的进行评价。三次重复实验的扩增效率在99. 104. 1%，R2在0. 997 0. 999之间。结果如表2，RSD范围在3. 18% 15. 28%之间(表1)。表1.本发明所述试剂盒qPCR测试的重复性分析
权利要求
1.一种适用于番茄内标准基因的核酸检测靶序列，该靶序列的序列为，TAAATTACTT TAACCTTGCC GCTTGCCGGA TATAGAGCAG ATATTTTTCT AATACCTAAT AAGAAACAAA TCTCTGGTGC GTTTAATCTT TATTTCTTAG AGCGTTCTGG TATCTTTGAC TACACATCTT CATTTGTGGA AT (SEQ ID NO. 1)。
2.一种重组质粒，其特征在于，该重组质粒内插有权利要求1所述的核酸检测靶序列。
3.—种工程菌，其特征在于，该工程菌为转有权利要求2所述重组质粒的工程菌菌株。
4.一种检测番茄的荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒由定量阳性模板、阴性对照品、DNA 聚合酶、引物和荧光探针组成，其特征在于(1)所述的引物为扩增权利要求1所述靶序列的引物，其中， 上游引物序列为5，-ACATATTTTTCTTGCAATTTACCTG-3，(SEQ ID NO. 2) 下游引物序列为5’-CTGGTCAGAAAGACCCATTTG-3’ (SEQ ID NO. 3) (2)所述的荧光探针为扩增权利要求1所述靶序列的探针，序列为5‘HEX-CGTCTCTCAAGTGGTCACAGCCTG-BHQ1 3，(SEQ ID NO. 4)其中 HEX 标记的是标记探针5’端的荧光基团，BHQl是标记探针3’端的淬灭基团；(3)所述的定量阳性模板是含权利要求1所述核酸检测靶序列的重组质粒。TCTATAAGTG ATTAAGTGAA AGGACAAGCC TGCCACCAAG ATTTTGATTG TGCAATTTAC GCAGGCTGTG TGGGTCTTTC CCATACCTTG ATTTTTTGCT TGATATTTTT TTTTGAAGGA AATTCATACT TTTTCAGTTC GTACTGTTTAAACTTAACCT ATCTGAATAT AGAGCCACCA GGTATGATAG CAAAACTCCT CTGTCTTGGT ACCACTTGAG TGACCAGGAT GTTTGTTGCC AGGTTCTATT CCAGGGAAGG CCTTGGACTG TCACGTAATG TCCATTTTGT ACTGCTAACTTGTCAAGATT ATGATTATAT GTGGAAGGTC ACTGATAACT GTTGAGGAAC AATCATATGT AGACGTGTTC ATTGTTGCAC TGTTCTTAAT CCTATATGCT GCACACAAGG CCAATCCCCT ATACTGAAGT GGAACTTGTT
全文摘要
本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种适用于番茄内标准基因的核酸检测靶序列，该序列如SEQ ID NO1所示。本发明所述的核酸检测靶序列的拷贝数是恒定的单拷贝，而且在种间高度特异，种内高度同源，适于作为番茄内标准基因。本发明所述的具有SEQ ID NO1序列的核酸检测靶序列可制备成常规的重组质粒及转入所述重组质粒的工程菌和检测番茄的荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒由SEQ ID NO2-4组成，可广泛应用于对番茄和转基因番茄及其加工产品的定性和定量检测，且具有特异性高，重复性好的优点。
文档编号C12Q1/68GK102321744SQ20111022303
公开日2012年1月18日 申请日期2011年8月4日 优先权日2011年8月4日
发明者周伦彬, 周晓红, 胡良勇, 陈晓光, 麦荣嘉 申请人:南方医科大学