专利名称：一种透性化与超声联用的功能微生物转化方法
技术领域：
本发明属于遗传工程与细胞工程技术领域，，具体涉及一种透性化与超声联用的功能微生物转化方法。
背景技术：
细菌通过吸收外源DNA而获得新的遗传性状的过程被称为转化。将外源DNA分子如质粒或双链DNA导入细菌细胞是微生物学和分子生物学最基础的技术手段之一，也是对微生物进行遗传工程改造的关键过程之一。经过数十年的研究，对一些模式微生物体系已经有相应的较为高效的DNA转化方法，比如对大肠杆菌体系，制备感受态细胞后通过热应激方法转化效率可以达到10_5或10_6。针对非特异的微生物宿主，也研究和开发了适用面更广的技术，其中高压电穿孔法和接合法是最常见的手段，但两者都有其局限性。接合法需要细菌间的物理接触以形成细胞-菌毛-细胞结合形式，若细胞不具备菌毛结构则无法实现转化。高压电穿孔须要低离子强度的反应体系和几千伏的高电压，条件极为苛刻，对细胞的损伤较大，更不利于更大范围内普及使用，电穿孔仪数十万元的价格也限制了其应用。超声波指频率高于20kHz的声波，具有很强的能量。当超声波作用于溶液时，会产生几百大气压的局部高压以及上千度的局部高温，通常超声波的这种作用称为气穴作用。超声波作用下，细胞壁的穿透性增强。由于上述特点，近十年里有不少研究通过高频超声波(频率大于IOOkHz)向细胞内转移药物与DNA，实现癌症或肿瘤的基因疗法，在这些研究中，转化的受体细胞均为真核细胞。但当受体细胞为细菌等原核微生物时，高频超声波并未表现出明显效果。然而通过低频超声波向原核微生物进行DNA转化在近五年里取得了突破。有研究表明，在合适的条件下，使用40kHz超声波可以对好氧的革兰氏阴性菌如恶臭假单胞菌、大肠杆菌，或厌氧的革兰氏阳性菌如嗜热厌氧乙醇杆等进行DNA转化。然而对于厌氧的革兰氏阴性菌，目前尚无对应的超声转化方法付诸实施，更重要的是，单纯的超声转化尽管可以将转化效率提高到1(Γ6的数量级，但与商业化的电转化10_5以上的转化效率相比仍然较低。由于超声转化技术出现时间较短，对其研究尚不深入，该技术是否能与其他的技术手段相结合对学术界和工业界仍属于空白。因此如何改造现有的超声转化技术，并将其与其他技术有效的结合，从而开发新的DNA转化技术，对于提高转化操作的成功率，新功能微生物克隆和培育，具有非常重要的意义。
发明内容
为了解决上述现有技术中存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种透性化与超声联用的功能微生物转化方法，能够实现对更大范围的宿主菌进行DNA转化并且提高转化效率，从而为遗传工程改造和新的功能微生物培育提供有效的技术手段，提高效率并降低成本和操作难度。为达到上述目的，本发明所采用的技术方案是:一种透性 化与超声联用的功能微生物转化方法，包括如下步骤:
I)在液体培养基中培养微生物，使其进入对数生长期，得到菌液；2)对菌液离心，并以透性转化试剂重悬，控制透性转化试剂的用量，使细胞浓度在此过程中浓缩5-20倍，进行细胞透性化处理；3)将经透性化处理的微生物离心后重悬于透性转化试剂，并置于转化用的玻璃瓶；4)在玻璃瓶中加入欲转化的外源核酸分子后，将玻璃瓶置于超声波仪器中，施加频率为20-80kHz的超声，超声采用连续或间歇式；5)微生物复苏，在选择性培养基上进行转化体筛选。步骤I)所述的微生物为好氧菌或厌氧菌。所述的厌氧菌包括脱硫弧菌Desulfovibrio vulgaris,好氧菌包括恶臭假单胞菌Pseudomonas putida。步骤2)中加入的透性转化试剂为Decon、氯化钙与磷酸缓冲溶液的混合液，Decon浓度为0.5%-4% (体积百分比)；氯化钙最终浓度为IO-1OOm mol/L。步骤2)所述的透性化处理的时间为10_40min。步骤4)加入的外源核酸分子包括线性DNA、环状DNA、RNA中的一种或多种。步骤4)中加入的外源核酸分子浓度存在最优范围，当细胞浓度固定时，核酸分子浓度在一定范围内提高，则每个细胞对应的核酸分子数相应提高，二者碰撞概率增加，转化效率提高；但当核酸分子浓度进一步提高时，核酸在细胞壁附近的空间位阻增大，导致转化效率下降。步骤4)中加入的外源核酸分子最优浓度按如下公式计算:Cp=L 53 X Cb X NbpXKT19式中，Cp为核酸分子浓度(gL)，Cb为受体细胞浓度(个/L)，Nbp为核酸分子的碱基对数目，若加入多种，则每种均按照上述公式计算最优浓度。步骤4的超声施加时间为5-60s。与现有技术相比，本发明具有如下优点:本发明采用Decon溶液对微生物细胞进行透性化处理，降低细胞壁和细胞质膜的磷脂含量；在透性化处理的同时，通过向体系添加钙离子，帮助外源核酸分子沉降和输运；然后施加低频超声波(20-80kHz)在微生物细胞表面产生瞬时囊泡，将欲转化的脱氧核糖核酸和核糖核酸输运至细胞内。由于超声波对细胞具有破坏性，长时间的超声会造成细胞损伤从而导致转化效率下降。采用Decon对细胞进行透性化处理后，超声转化时超声的功率可以相应降低、超声时间缩短，降低了超声对细胞的损伤。与目前常用的乙醇透性化处理技术相比，本发明中所采用的Decon浓度条件下，对细胞的杀菌作用较弱，因此通过合理的调配，可以获得同时优化应用于细胞透性化与超声转化的介质溶液，而采用乙醇为主要透性化成分的溶液在超声时将使大量乙醇进入细胞膜内部，从而导致细胞死亡或活性抑制，因此难以得到一种同时满足透性化处理与超声转化技术的介质溶液。本发明的另一重要前景在于功率较低的超声发生装置更容易实现工程的扩大化，因此在大规模的原位微生物转化时(如污水处理厂曝气池内施加超声，使活性污泥中的微生物捕获新的降解功能)，具有更大的应用前景。
本发明的创新性在于寻找到了新的透性转化试剂，该试剂能提高细胞壁及细胞膜的穿透性，而同时又不影响超声转化的过程，且能在一定程度上维持细胞的活性及存活率。通过应用该透性转化试剂，首次实现了将细胞的透性化处理技术和现有的低频超声转化技术的有机的结合，创造性的提出了透性化-超声转化的新技术，并且对超声转化时外源核酸分子浓度与细胞浓度的最优配比给出了定量化的计算公式。同时该技术在厌氧的革兰氏阴性菌中的应用也属于本发明的创新点之一。
图1是经透性转化介质处理后的脱硫弧菌DvH与未经透性转化介质处理的细胞电镜照片的对比图。其中左图是未经透性处理的细胞，右图是经过含有1%的Decon的透性试剂处理的细胞。图2是对脱硫弧菌DvH进行透性化-超声联合技术进行DNA转化后的转化效率柱状图。图3是几种转化技术对恶臭假单胞菌KT2440进行质粒转化的效率对比图。
具体实施例方式下面结合附图和具体实施方式
对本发明作进一步详细说明。实施例1:透性化-超声转化技术对脱硫弧菌DesulfovibriovuIgarisHi Idenborough 进行转化的方法: 如无特殊说明，所有的操作在无菌厌氧条件下进行。I)细胞培养:脱硫弧菌Desulfovibriovulgaris HiIdenborough(以下简称DvH)是一株厌氧的革兰氏阴性菌，公众可通过德国微生物保藏和细胞培养中心(DSMZ，菌种编号DSM 644)获得，培养基采用Medium 63 (配制方法参考DSMZ网站说明)。现有对DvH菌的转化技术中，仅有电转化被报道能成功向该菌进行DNA转化。将细菌接种至50mL Medium63培养基，在30 35°C温度下培养72h。2)细胞洗涤
将培养后的菌液在4000rpm转速下离心IOmin,收集菌体，以含有2m mol/LNa2S的80m mol/L磷酸盐缓冲液(记为PBS_s)离心洗涤2次。3)透性转化试剂配制透性转化试剂配制方法如下，在PBS-s缓冲液中，加入不同浓度的MDF500Decon溶液(商业产品，可通过Modec公司获得),使Decon浓度为0.5% 4% (体积比)；之后在体系中加入CaCl2,使CaCl2最终浓度达到50m mol/L。透性化试剂记为PAC_s。4)透性化处理将步骤2)的细胞重悬于5mL透性化试剂PAC_s，接触反应10_40min后，离心重悬于 PAC-s。如图1所示为透性化后细胞的透射电镜照片。左图为未经透性化处理的细胞，右图为通过1%的Decon处理20min后的细胞。通过照片中的细胞形态可见，进行透性化处理的细菌，外膜呈现明显的凹凸不平现象，表明脂类物质溶解，从而细胞通透性增强。而且透性化的处理未造成细胞质的流失，细胞具有良好的生理状态。
通过对平行对照组进行标准的稀释涂板计数操作可以计算此时菌液中细胞浓度为 IO9 个 /mL。5)超声转化取100 μ L细胞的PAC-s悬液，加入130ng载体质粒pDVUL-YZ (序列见附件)，混合后置于1.5mL的玻璃瓶中。转化体系中的质粒终浓度按如下公式计算:Cp=15.3 X Cb X Nbp X 1(Γ20式中，Cp为质粒浓度g/L，Cb为受体细胞浓度个/L，Nbp为质粒的碱基对数目。在本例中，已测得受体细胞浓度为IO9个/mL,质粒碱基数目为8501,代入上述公式，可以计算得到，质粒浓度应为1.3ng/yL，因此本例中在100 μ L体系中需加入130ng质粒。将玻璃瓶放入充满水的超声波仪器(375H，40kHz，Langford电器公司)，施加超声IOs0另取相同的IOOyL细胞加入与以上相同的载体质粒，但不施加超声，作为阴性对照。6)细胞复苏 将超声转化后的细胞加入到5mL Medium63培养基中培养5h，进行复苏。之后涂布于含有10mg/L的卡那霉素的Medium63平板上，培养72h。7)转化体计数培养72h后，在用Decon透性化处理后施加超声转化的平板上观察到转化体，用Decon作透性化处理但不施加超声的阴性对照平板上没有观察到转化体。通过下式计算转化效率:转化效率=转化体个数/细胞个数转化效率如图2所示。计算表明，在本例中，转化效率达到4.6X10'由结果可以看出，透性化-超声转化技术在很简便的操作的同时，可以有效的对典型的厌氧革兰氏阴性菌进行转化。实施例2:透性化-超声转化技术对恶臭假单胞菌Pseudomonas putidaKT2440进行转化的方法:恶臭假单胞菌Pseudomonas putida KT2440 (以下简称KT2440)是一株好氧革兰氏阴性菌，公众可通过德国微生物保藏和细胞培养中心(DSMZ，菌种编号DSM 6125)获得。培养基采用LB培养基。已有研究者表明，使用超声转化可以向KT2440进行DNA转化，转化效率最高可达9.8X 10_6。本实施例将表明通过透性化-超声转化技术，可以大幅提高转化效率。I)细胞培养:将细菌接种至5mL的LB培养基，在30°C温度下培养16h。2)细胞洗涤菌液在4000rpm转速下离心IOmin,收集菌体，以80m mol/L磷酸盐缓冲液(记为PBS)离心洗涤2次。3)透性转化试剂配制
透性转化配制方法如下，在PBS缓冲液中，加入不同浓度的MDF500 Decon溶液(商业产品，可通过Modec公司获得),使Decon浓度为0.5% 4% (体积比);之后在体系中加入CaCl2，使CaCl2最终浓度达到50m mol/L。透性化试剂记为PAC。4)透性化处理将步骤2)的细胞重悬于5mL透性化试剂PAC，接触反应20_40min后，离心重悬于PAC0通过平行对照的平板计数，此时菌液中细胞浓度为IO9个/mL。5)超声转化取100 μ L细胞的PAC悬液，加入72ng载体质粒pBBRlMCS (常用质粒，可由http://www.addgene.0rg/vector-database/1854/ 获得),混合后置于 1.5mL 的玻璃瓶中。质粒pBBRlMCS大小为4707bp，携带卡那霉素抗性。转化体系中的质粒终浓度按如下公式计算:Cp=15.3 X Cb X NbpX IO-20式中，Cp为质粒浓度g/L，Cb为受体细胞浓度个/L，Nbp为质粒的碱基对数目。在本例中，已测得受体细胞浓度为IO9个/mL,质粒碱基数目为4707,代入上述公式，可以计算得到，质粒浓度应为0.72ng/yL,因此本例中在100 μ L体系中需加入72ng质粒。将玻璃瓶放入充满水的超声波仪器(375H，40kHz，Langford电器)，施加超声10s。另取相同的IOOyL细胞加入与以上相同的载体质粒，但不施加超声，作为阴性对照。6)细胞复苏超声后的细胞加入0.9mL SOC培养基培养，在150rpm条件下振荡培养2h，进行复苏。之后涂布于含50mg/L的卡那霉素的LB培养基平板上，培养24h。7)转化体计数培养24h后，在用Decon透性化处理后施加超声转化的平板上观察到转化体，未用Decon透性化处理但施加超声转化的平板上也观察到转化体,但无论是否用Decon作透性化处理，不施加超声的阴性对照平板上没有观察到转化体。通过下式计算转化效率: 转化效率=转化体个数/细胞个数 计算后的转化效率如图3所示。仅施加透性化技术，转化效率为0，仅施加超声转化技术，转化效率为9.3X 10_ 6，而透性化-超声联合技术的转化效率可达7.4X 10_5。该结果充分表明，与单纯的超声转化技术相比，透性化-超声转化技术大幅提高转化效率，为单纯超声转化的8倍。该结果同时高于文献中报道的，采用结合法或电转法的转化效率，其效率分别为结合法的约80倍和电转化法的约30倍。
权利要求
1.一种透性化与超声联用的功能微生物转化方法，其特征在于:包括如下步骤: 1)在液体培养基中培养微生物，使其进入对数生长期，得到菌液； 2)对菌液离心，并以透性转化试剂重悬，控制透性转化试剂的用量，使细胞浓度在此过程中浓缩5-20倍，进行细胞透性化处理； 3)将经透性化处理的微生物离心后重悬于透性转化试剂，并置于转化用的玻璃瓶； 4)在玻璃瓶中加入欲转化的外源核酸分子后，将玻璃瓶置于超声波仪器中，施加频率为20-80kHz的超声，超声采用连续或间歇式； 5)微生物复苏，在选择 性培养基上进行转化体筛选。
2.根据权利要求1所述的透性化与超声联用的功能微生物转化方法，步骤I)所述的微生物为好氧菌或厌氧菌。
3.根据权利要求2所述的透性化与超声联用的功能微生物转化方法，所述的厌氧菌包括脱硫弧菌Desulfovibrio vulgaris,好氧菌包括恶臭假单胞菌Pseudomonas putida。
4.根据权利要求1所述的透性化与超声联用的功能微生物转化方法，步骤2)中加入的透性转化试剂为Decon、氯化钙与磷酸缓冲溶液的混合液，Decon浓度为0.5%_4%(体积百分t匕)；氯化钙最终浓度为IO-1OOm mol/L。
5.根据权利要求1所述的透性化与超声联用的功能微生物转化方法，步骤2)所述的透性化处理的时间为10-40min。
6.根据权利要求1所述的透性化与超声联用的功能微生物转化方法，步骤4)加入的外源核酸分子包括线性DNA、环状DNA、RNA中的一种或多种。
7.根据权利要求6所述的透性化与超声联用的功能微生物转化方法，步骤4)中加入的外源核酸分子最优浓度按如下公式计算:Cp=L 53 X Cb X Nbp X 10, 式中，Cp为核酸分子浓度(g/L)，Cb为受体细胞浓度(个/L)，Nbp为核酸分子的碱基对数目，若加入多种，则每种均按照上述公式计算最优浓度。
8.根据权利要求1所述的透性化与超声联用的功能微生物转化方法，步骤4的超声施加时间为5-60S。
全文摘要
本发明公开了一种透性化与超声联用的功能微生物转化方法，采用Decon溶液对微生物细胞进行透性化处理，降低细胞壁和细胞质膜的磷脂含量；在透性化处理的同时，通过向体系添加钙离子，帮助外源DNA沉降和输运；然后施加低频超声波20-80kHz，将欲转化的脱氧核糖核酸和核糖核酸输运至细胞内；采用Decon透性化处理后，超声转化时超声的功率可以相应降低、超声时间缩短，降低了超声对细胞的损伤；通过合理的选择透性转化试剂及确定相应浓度，得到一种同时满足透性化处理与超声转化技术的介质溶液；能够实现对更大范围的宿主菌进行外源核酸分子转化并且提高转化效率，从而为遗传工程改造和新的功能微生物培育提供有效的技术手段，提高效率并降低成本和操作难度。
文档编号C12N15/63GK103088045SQ20121052664
公开日2013年5月8日 申请日期2012年12月7日 优先权日2012年12月7日
发明者宋一之 申请人:宋一之