专利名称：接种法提高茯砖茶发花率制备工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及农产品加工技术领域，具体涉及一种接种法提高茯砖茶发花率制备工艺，其发花所述的花即冠突散囊菌(及woiia cristarum (Raper & Fennell) Malloch &Cain),俗称金花。
背景技术：
茯砖茶是边疆少数民族不可缺少的重要饮料。金花普遍茂盛、色泽鲜艳金黄、颗粒肥大历来是优质茯砖茶的最重要品质特征。金花是在茯砖茶加工过程中发花阶段形成的。过去，对茯砖茶发花技术研究只停留在自然状态下控制温度、湿度发花工艺上，发花率较低，因而亟待研制一种提高茯砖茶发花率的具体工艺。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是:解决上述现有技术存在的问题，在不改变现有茯砖茶生产线条件下而提供一种接种法提高茯砖茶发花率制备工艺，能在7-15天短期内实现发花，而且金花普遍茂盛，色泽鲜艳金黄，颗粒肥大，用不同黑毛茶原料其发花率均能达到 100%O本发明采用的技术方案是:
一种接种法提高茯砖茶发花率制备工艺，具体步骤如下:
①冠突散囊菌的纯化分离；
②一定老化度冠突散囊菌孢子悬液制备与浓度确定；
③黑毛茶样品的处理；
④添加冠突散囊菌孢子悬液；
⑤压制；
⑥发花；
⑦干燥和保存。上述技术方案中，所述的冠突散囊菌的纯化分离为:用添加10%茯砖茶茶汁的PDA琼脂固体培养基平板梯度稀释分离；所述的一定老化度冠突散囊菌孢子悬液制备与浓度确定为:挑取纯化的金花菌落，接种至添加10%茯砖茶茶汁、20%蔗糖和10%NaCl的PDA液体培养基培养，28°C静置培养2天，然后升高温度至30-32°C培养12-28天，震荡分散孢子，无菌水稀释孢子悬液浓度控制在IO7-1O8个/mL ;所述的黑毛茶样品的处理为:将黑毛茶按照传统处理方式分筛、拼配、渥堆、发酵处理；所述的添加冠突散囊菌孢子悬液:添加量为0.25mL/100g，添加时机为压制前；所述的压制、发花、干燥及发花后保存条件均按照传统处理方式。PDA 指 Potato Dextrose Agar 的简称。PDA琼脂固体培养基指将马铃薯洗净去皮，称取200g，切成小块放入烧杯中，加适量蒸馏水，煮沸I小时，稍冷后用双层纱布过滤，在滤液中加入15g琼脂，加热熔化，最后加入蔗糖20g，混匀，用量筒定容至IOOOmL,趁热分装在三角瓶中，在1.1 kg/cm2 (121°C)中保持20分钟灭囷。PDA液体培养基指上述培养基配制过程操作，但不添加琼脂。PDA琼脂固体培养基平板指上述培养基灭菌结束后冷却至50°C左右，在超净工作台上将培养基倒入事先已经灭菌并干燥的培养皿中，待冷却即为制得的PDA琼脂固体培养基平板。添加10%茯砖茶茶汁的PDA固体培养基指将马铃薯洗净去皮，称取200g，切成小块放入烧杯中，加适量蒸馏水，煮沸I小时，稍冷后用双层纱布过滤，在滤液中加IOOmL制备好的茯砖茶茶汁，然后加入15g琼脂，加热熔化，最后加入蔗糖20g混匀，用量筒定容至IOOOmL,趁热分装在三角瓶中，在1.lkg/cm2(12rC )中保持20分钟灭菌。灭菌结束后冷却至50°C左右，在超净工作台上将10%茯砖茶茶汁的PDA琼脂固体培养基倒入事先已经灭菌并干燥的培养皿中，待冷却即为制得的10%茯砖茶茶汁的PDA琼脂固体培养基平板。10%茯砖茶茶汁的PDA液体培养基与上述操作过程相同，但不添加琼脂。平板梯度稀释法为:
将成品茯砖样本用植物微型粉碎机将样品粉碎，200目过筛、65°C干燥2小时后称取Ig样品，定容IOmL,即配成I X 10 — i/mL的获砖样本溶液,从上述溶液中取I mL定容10 mL配成I X 10 — 'g/mL的茯砖样本溶液，依次配制成浓度I X 10 —3、I X 10 —4、I X 10 — 5g/mL的茯砖茶样本溶液各10 mL备用。取1X10 —3、IX 10 —4、1X10 —5g/mL的茯砖样本溶液各0.5mL，用涂布器涂布到冠状散囊菌快速分离培养基平板上，超净台上吹干15分钟左右，倒置平皿，28°C培养，3 — 4天后挑取优势菌——金花同样条件培养直至纯化。画线接种指用灭菌的接种针在超净台上将已经生长好的菌落挑取，在新的固体培养基平皿画线分离相应微生物。金花菌落指金花菌在10%茯砖茶茶汁PDA固体培养基平板上生长到一定时候形成的一个菌落集合体，菌落是指聚集在一起的微生物团。茯砖茶茶汁的具体制备方法:按照Ig茯砖茶样本比30mL蒸馏水的比例称取20g茯砖茶，加入600mL蒸馏水，100°C水浴2小时，待稍冷却后用量筒定容至600mL即为制备好的茶汁。配成10'10'10'10'1(Γ5是指浓度，单位为g/mL。孢子悬液浓度IO7-1O8个/ml中的“个”是指单个的金花菌的子囊孢子。计数方法为用梯度稀释法涂布在添加10%茶汁的PDA琼脂固体培养基平板上生长计数或用722型分光光度计测量其OD值，控制在0.6左右，使金花孢子悬液浓度控制在每毫升IO7-1O8个金花孢子。本发明提供了一种在不改变现有茯砖茶生产线条件下，能在7 — 15天的短期内实现发花，而且金花普遍茂盛、色泽鲜艳金黄、颗粒肥大，茯砖茶发花率达到100%，极大地提高茯砖茶的发花率。
图1为本发明培养7天分离纯化的冠突散囊菌落照片；
图2为本发明冠突散囊菌的孢子悬液15天培养结果照片；
图3为极品茯砖茶、一品茯砖茶、百姓茯砖茶发花结果照片；图4为益阳茶厂极品茯砖、一品茯砖、百姓茯砖发花率的验证表。
具体实施例方式1.金花的分离、纯化:
冠突散囊菌即金花从益阳茶厂成品湘益牌茯砖样本中分离。具体分离和纯化过程为:将成品湘益牌茯砖样本粉碎，用平板梯度稀释法在添加10%茯砖茶茶汁的PDA琼脂固体培养基平板上28 °C培养直至纯化。2.金花的孢子悬液制备与浓度确定:
挑取纯化的金花菌落，接种至添加10%茯砖茶茶汁、20%蔗糖和10%NaCl的PDA液体培养基培养，28°C静置培养2天，然后升高温度至30-32°C培养12-28天，震荡分散孢子，无菌水稀释孢子悬液浓度控制在IO7-1O8个/mL。3.黑毛茶样品的处理:
将黑毛茶按照按照传统处理方式分筛、拼配、渥堆、发酵处理。4.添加金花孢子悬液:
按照每IOOg茶添加0.25mL金花孢子悬液的比例，以喷雾的形式在压制前添加，混匀。5.压制:
按照传统处理方式压制。6.发花:
控制湿度和温度发花条件为按照传统处理条件。7.干燥和保存:
按照传统处理条件。实施例1:金花的分离、纯化:
将成品湘益牌茯砖样本用植物微型粉碎机粉碎，200目过筛、65°C干燥2小时后称取Ig 样品，定容 10mL，配成 ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ—4、10_5 各 10mL，取 10' 10_4、10_5 三个梯度各
0.5mL涂布添加10%茯砖茶茶汁的PDA琼脂固体培养基平板，超净台上吹干，28°C培养3天，挑取金黄色优势菌落，画线至添加10%茯砖茶茶汁的PDA平板上，同样条件继续培养直至纯化。分离纯化的金花菌落见附图1。实施例2:金花的孢子悬液制备:
挑取纯化的金花菌落，接种至添加10%茯砖茶茶汁、20%蔗糖和10%NaCl的PDA液体培养基培养，28°C静置培养2天，然后升高温度至30-32°C培养12-28天，震荡分散分生孢子，用双层无菌纱布过滤，再后280rpm振荡培养分散分生孢子，无菌水稀释孢子悬液至OD值为
0.6，即为可用的金花孢子悬液。上述升高温度至30— 32°C培养12 — 28天，实例:升高温度至30°C，培养28天；或升高温度至32°C，培养12天；或升高温度至31°C，培养20天。金花的孢子悬液培养结果见附图2。实施例3:益阳茶厂极品茯砖、一品茯砖、百姓茯砖的黑毛茶发花率提高的验证 分别取益阳茶厂极品茯砖、一品茯砖 、百姓茯砖的黑毛茶各20Kg，以不接种作为对照，
按照具体实施方式
中1-7步在益阳茶厂进行发花实验(其中第3、5、6、7步为益阳茶厂处理方法)，三种茯砖发花率均能达到100%。黑毛茶发花结果见附图3。图中左为极品茯砖发花，中为一品茯砖发花，右为百姓茯砖发花。其发花效率统计见图4的验证表。
权利要求
1.一种接种法提高茯砖茶发花率制备工艺，其特征在于:具体步骤如下: ①冠突散囊菌的纯化分离； ②一定老化度冠突散囊菌孢子悬液制备与浓度确定； ③黑毛茶样品的处理； ④添加冠突散囊菌孢子悬液； ⑤压制； ⑥发花； ⑦干燥和保存。
2.根据权利要求1所述的接种法提高茯砖茶发花率制备工艺，其特征在于:所述的冠突散囊菌的纯化分离为:用添加10%茯砖茶茶汁的PDA琼脂固体培养基平板梯度稀释分离；所述的一定老化度冠突散囊菌孢子悬液制备与浓度确定为:挑取纯化的金花菌落，接种至添加10%茯砖茶茶汁、20%蔗糖和10%NaCl的PDA液体培养基培养，28°C静置培养2天，然后升高温度至30-32°C培养12-28天，震荡分散孢子，无菌水稀释孢子悬液浓度控制在IO7-1O8个/mL ;所述的黑毛茶样品的处理为:将黑毛茶按照传统处理方式分筛、拼配、渥堆、发酵处理；所述的添加冠突散囊菌孢子悬液:添加量为0.25 mL/100g，添加时机为压制前；所述的压制、发花、干燥及发花后保存条件均按照传统处理方式。
全文摘要
一种接种法提高茯砖茶发花率制备工艺，具体步骤如下①冠突散囊菌的纯化分离；②一定老化度冠突散囊菌孢子悬液制备与浓度确定；③黑毛茶样品的处理；④添加冠突散囊菌孢子悬液；⑤压制；⑥发花；⑦干燥和保存。本发明研制成功了接种法提高茯砖茶发花率制备工艺条件，使之能在7-15天短期内实现发花，而且金花普遍茂盛，色泽鲜艳金黄，颗粒肥大，用不同黑毛茶原料其发花率均能达到100%。
文档编号A23F3/06GK103168866SQ20131011222
公开日2013年6月26日 申请日期2013年4月2日 优先权日2013年4月2日
发明者刘石泉, 赵运林, 龙立平, 徐迪军, 刘杏益 申请人:益阳茶厂有限公司, 湖南城市学院