一种油污染水域生物修复用菌剂及制备方法
【专利摘要】本发明涉及石油污染环境治理【技术领域】，具体涉及一种油污染水域生物修复用菌剂及制备方法。本发明公开一种石油生物修复用菌剂，包括石油降解菌群及生物固定化载体，其特征在于该菌群固定在一种可漂浮、可降解而且能缓释氮、磷等营养物质的生物载体中。本发明所述生物固定化载体以能缓释氮、磷等营养物质的缓释肥料为核心，外围包被固定化有石油降解菌群的生物载体。生物载体内部呈多孔中空结构，以保持其漂浮性；缓释肥料可连续提供氮、磷等营养物质供石油降解菌利用，而无需外加营养物质。本发明所涉及的石油降解菌剂可以用于石油污染水体的生物修复。
【专利说明】一种油污染水域生物修复用菌剂及制备方法
1【技术领域】
[0001]本发明涉及石油污染环境治理【技术领域】，具体涉及一种石油污染水域生物修复用菌剂及制备方法。
2【背景技术】
[0002]随着石油工业的迅速发展，石油对环境的破坏也越来越引起人们的重视。尤其对于海洋环境，层出不穷的各类石油泄漏事故对海洋的生态系统造成了严重危害，制约人类社会和环境的可持续发展。石油污染的生物修复技术被认为是石油污染治理最为有效的途径之一，具有高效、经济和无二次污染等优点，其应用前景看好，正受到世界各国的普遍重视，相关研究也十分活跃。生物修复过程一般包括生物促进和生物强化两种途径。生物强化是指通过添加能够降解石油的微生物；生物促进是指通过添加N、P等营养刺激污染环境中的土著石油降解菌的生长以达到降解石油污染物的目的。由于单独使用生物强化和生物促进通常存在各自的局限性，所以两者联合使用往往能取得更好的修复效果，这也是生物修复的发展趋势。
[0003]在石油污染的自然条件下，接种的石油降解菌面临与土著微生物的竞争作用，需要适应新的生长环境及经受环境污染物的毒性影响等环境压力，导致添加的石油降解菌容易流失和存活时间短，这是限制生物强化修复有效性的主要问题。所以防止接种的石油降解菌的轻易流失和使其长期保持足够活性是生物强化修复有效性的关键。利用载体将石油降解菌固定化后接种到自然环境是解决上述问题的一种有效手段。载体材料能够通过为微生物提供保护性的表面和空隙等，形成微小的生物反应器，从而有利于屏蔽土著菌、噬菌体和毒性物质对微生物体的恶性竞争、吞噬和毒害等，克服环境压力，使其能够长期保持活性，在复杂环境中发挥高效性能。近年来，微生物固定化技术迅速成为生物、环境等领域的一个研究热点。由于石油密度小于水的密度，石油污染物往往漂浮于水面，所以应用于水体石油污染生物修复的固定化载 体应具有漂浮性、可生物降解、无毒性或抑制性及原料来源广泛，价格低廉等特点。
[0004]水体环境中，尤其是海洋环境中N、P等营养物质的缺乏是影响石油污染生物修复有效性的主要因素。石油中含有微生物能利用的大量碳源，但是N、P等营养的缺乏往往是影响细菌生长繁殖的主要原因，实验室和现场的研究均表明添加N、P等营养能有效促进石油的生物降解。水体环境中N、P的添加是一大难题，添加水溶性的一些营养盐往往容易被周围水体稀释，缓释肥料克服了水溶性肥料易被冲刷的缺点，可以为石油污染区域提供连续的营养源，从而相对水溶性肥料其喷洒频率更低，降低了使用成本。
[0005]因此，将微生物固定化技术与缓释肥料相结合，制备具有缓释N、P等营养物质功能的可漂浮、可降解的石油降解菌剂，对解决影响生物修复应用有效性问题具有重要意义，有望应用于各种自然水体的石油污染生物修复。
3
【发明内容】
[0006]本发明旨在提供一种石油污染水域生物修复用菌剂。该菌剂可漂浮于水面，利用自身缓释的N、P等营养物质降解石油，且其自身可生物降解，不引起二次污染。
[0007]本发明还提供该菌剂的制备方法，包括制备该菌剂所用微生物的培养、固定化载体的制备、微生物固定化方法及保存使用方法。
[0008]本发明主要通过以下措施来实现:1、通过富集培养方法，从石油污染水体中分离获得石油降解菌株，并构建高效的石油降解菌群；2、以缓释肥料为核心，外围包被具有生物相容性的生物载体以固定微生物。生物载体内部呈多孔中空结构，以保持其漂浮性；缓释肥料所连续提供的氮、磷等营养物质可供石油降解菌利用，而无需外加营养物质。
[0009]本发明所涉及的石油污染水域生物修复用菌剂，其特征是所述的石油降解菌可以是假单胞菌属、弧菌、不动杆菌属、黄杆菌属、气单胞菌属、无色杆菌属、产碱杆菌属、肠杆菌科，棒杆菌属、节杆菌属、芽抱杆菌属、葡萄球菌属、微球菌属、乳杆菌属、诺卡氏菌属、假丝酵母属、红酵母菌属、毕赤氏酵母菌属中的一种或是任何组合。 [0010]本发明所涉及的石油污染水域生物修复用菌剂，其特征是所述的缓释肥料可以是含有氮、磷等营养物质的有机物、硝酸盐、铵盐、磷酸盐(KN03、NaN03、NH4N03、K2HPO4,MgNH4PO4, Ca (H2PO4) 2、Na5P3O10)中的一种或是几种组合的具有缓释功能的肥料。
[0011]本发明所涉及的石油污染水域生物修复用菌剂，其特征是所述的生物载体是可形成中空结构的材料，包括海藻酸钙、壳聚糖、明胶、琼脂、角叉菜胶、甲壳素、淀粉。
[0012]本发明所涉及的石油污染水域生物修复用菌剂，其特征是所述的石油污染水域可以是原油、柴油、汽油、机油和润滑油污染的河流、湖泊、海洋、湿地和地下水。
[0013]本发明所涉及的石油污染水域生物修复用菌剂的制备方法步骤如下:
[0014](I)将缓释肥料加入至一定浓度的生物材料原溶液中，再将含有缓释肥料的生物材料原溶液滴入反应液将生物材料反应固化成形；
[0015](2)将固化的包埋有缓释肥料的载体加入石油降解菌群菌液中，培养一定时间进行菌体固定化后，取出作为湿菌剂；
[0016](3)将湿菌剂置于保护剂中在_70°C中预冻后，在冻干机中冷冻干燥后，4°C保藏。
[0017]本发明与已有技术相比，具有如下显著特征:
[0018]1、菌剂中含有缓释性肥料，能提供微生物降解石油所需要的氮、磷等营养物质。已有的菌剂往往只含有石油降解菌，而未含有微生物降解石油所需要的氮、磷等营养物质，而且所含缓释肥料克服了水溶性肥料易被冲刷的缺点，可以为石油污染区域提供连续的营养源。
[0019]2、菌剂具有可降解性和优越的漂浮性。在缓释肥料外围包被的复合膜具有多孔中空结构，使得菌剂能在水体中长期保持漂浮特性，而且全部采用可降解的材料组成。现有的菌剂主要应用硅藻土、高岭土、活性炭、纤维等不具有漂浮性的载体或是应有具有漂浮性的不可降解或是难降解的有机合成泡沫作为载体。
4【专利附图】
【附图说明】
[0020]图1:混合菌群及单菌株的柴油降解率随时间的变化
[0021]图2:菌剂外观性状
[0022]图3:菌剂氮的缓释量随时间的变化[0023]图4:菌剂的柴油降解率5【具体实施方式】
[0024]以下结合具体实施例，进一步阐明本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。
[0025]实施例1石油降解菌的富集分离
[0026]将采集的石油污染海水ImL接种于柴油的体积分数为0.5% (v/v)的IOOmL灭菌的MMC中。在30°C，200r/min的摇床培养5~6d后，从培养液中取出ImL转入IOOmL新鲜培养基中，培养基的油浓度提高至I % (v/v)，在相同的条件下培养；油浓度按梯度(0.5%、1%A.5%,2%,2.5% )提高，富集培养五个周期。用移液枪(枪头已灭菌)吸取ImL富集水样置于9mL无菌水中，作为KT1稀释液；混匀后,再吸取该试管中的ImL液体置于9mL无菌水中，作为10_2稀释液，依此类推，用梯度稀释法分别制成10' 10_4、10_5、10' 10' IO-8稀释液；分别吸取0.2mL不同稀释度的样品滴入LB固体培养基内，涂布8个平板，对应编号，倒置于35°C生化培养箱培养I~2d ;再在平板上挑取单菌落，采取分区划线法，使菌种进一步纯化；纯化后的菌株保存在斜面培养基中，并于4°C冰箱中保藏，分离获得多株高效柴油降解菌。
[0027]实施例2石油降解混合菌群的构建
[0028]将实施例1中分离获得的4株石油降解菌(不动杆菌Y9、W3、F9和戈登氏菌XI)接种至LB液体培养基中，过夜培养后，分别取等量的菌液混合，组成混合菌群，混合菌群经离心收集菌体，接种至含有1%柴油的无机盐培养基中，在180rpm, 30°C条件下培养一定时间后测培养基中的剩余柴油浓度，计算柴油降解率，如图1所示，菌群的柴油降解率要明显高于单菌株的降解率。
[0029]实施例3以海藻酸钙和壳聚糖为材料的菌剂的制备
[0030]称取3g壳聚糖，溶解于90ml的2%醋酸溶液中，制成溶液A ;称取5g尿素和
1.2gNaH2P04,溶解于IOml纯水中，制得溶液B ;将溶液A、B混合搅匀溶解后，滴入lmol/L的NaOH溶液中，固化5min，形成的固化小球经清水冲洗至中性后，加入至3%海藻酸钠溶液中，搅匀后，滴入含有2% CaCl2和0.5%壳聚糖溶液中，固化30min，制得的湿载体加入实施例2中的混合菌液的LB菌液中，在140rpm，30°C条件下培养3h，取出固定有降解菌的载体，加入保护剂，-70°C中预冻后，在冻干机中真空冻干，即制得菌剂，4°C保藏，菌剂外观如图2所示。
[0031]实施例4石油污染水域生物修复用菌剂氮的缓释性
[0032]取0.2g实施例3中制备的菌剂于100ml水中，置于4°C条件下，每隔段时间，取Iml海水，采用碱性过硫酸钾法测水体中的总氮含量，以时间为横坐标，氮含量为纵坐标，绘制菌剂中氮的缓释曲线，实验结果如图3所示，菌剂中的氮具有良好的缓释性。
[0033]实施例5石油污染水域生物修复用菌剂对柴油的降解
[0034]称取0.5g实施例3中制备的菌剂于100ml含有1% (v/v)柴油的海水中，同时设置以接种有实施例2中构建的混合菌菌体的作为阴性对照，以未接菌的作为空白对照，在120rpm，30°C条件下培养7d，加入5mL硫酸(体积比为1:1)酸化及20mL石油醚(沸程为60~90°C )，在分液漏斗中剧烈振荡2~3min，静置分层，收集上清液，下层水样放回分液漏斗中，重复萃取两次，合并有机相。加入2g无水硫酸钠去除水分，过滤至容量瓶中，用石油醚稀释后，在紫外-可见光分光光度计上，以石油醚作参比，在255nm入射波长处测定OD值，通过标准曲线计算柴油的浓度。柴油降解率n降解计算公式为:n降解=(C0-C1)/Ctl X 100 %，其中，Ctl和C1分别为柴油的初始浓度和降解后浓度。实验结果如图4所示，菌剂组的柴油降解率明显高于对照组。
[0035]本发明提出的石油污染水域生物修复用菌剂及制备方法，本领域技术人员可通过借鉴本文，明显能不脱离本
【发明内容】
、精神和范围内，适当改变原料、工艺等来实现本产品。特别需要指出的是，所有相 类似 的替换和改动，都被视为在本发明精神、范围和内容中。
【权利要求】
1.一种石油污染水域生物修复用菌剂，其特征在于将含有氮、磷营养物质的缓释肥料，包被固定有石油降解菌群的中空结构的生物载体中，制成的可漂浮、可降解的菌剂。
2.如权利要求1所述的石油污染水域生物修复用菌剂，其特征是所述的石油降解菌可以是假单胞菌属、弧菌、不动杆菌属、黄杆菌属、气单胞菌属、无色杆菌属、产碱杆菌属、肠杆菌科，棒杆菌属、节杆菌属、芽抱杆菌属、葡萄球菌属、微球菌属、乳杆菌属、诺卡氏菌属、假丝酵母属、红酵母菌属、毕赤氏酵母菌属中的一种或是任何组合。
3.如权利要求1所述的石油污染水域生物修复用菌剂，其特征是所述的缓释肥料可以是含有氮、磷营养物质的有机物、硝酸盐、铵盐、磷酸盐(KN03、NaNO3> NH4NO3^ K2HPO4,MgNH4PO4, Ca (H2PO4) 2、Na5P3O10)中的一种或是几种组合的具有缓释功能的肥料。
4.如权利要求1所述的石油污染水域生物修复用菌剂，其特征是所述的生物载体是可形成中空结构的材料，包括海藻酸钙、壳聚糖、明胶、琼脂、角叉菜胶、甲壳素、淀粉。
5.如权利要求1所述的石油污染水域生物修复用菌剂，其特征是所述的石油污染水域可以是原油、柴油、汽油、机油和润滑油污染的河流、湖泊、海洋、湿地和地下水。
6.如权利要求1所述的石油污染水域生物修复用菌剂的制备方法，其特征是步骤如下: (1)将缓释肥料加入至一定浓度的生物材料原溶液中，再将含有缓释肥料的生物材料原溶液滴入反应液将生物材料反应固化成形； (2)将固化的包埋有缓释肥料的载体加入石油降解菌群菌液中，培养一定时间进行菌体固定化后，取出作为湿菌剂； (3)将湿菌剂置于保护剂中在`_70°C中预冻后，在冻干机中冷冻干燥后，4°C保藏。
【文档编号】C12N11/10GK103523928SQ201310298190
【公开日】2014年1月22日 申请日期:2013年7月16日 优先权日:2013年7月16日
【发明者】罗群, 沈先荣, 侯登勇, 何颖, 刘琼, 王庆蓉, 张建国 申请人:中国人民解放军海军医学研究所