一种快速检测金银花成分掺伪量的方法
【专利摘要】本发明公开了一种快速检测金银花成分掺伪的方法。该方法是利用焦磷酸测序技术对金银花及其伪品山银花的标志性核酸位点进行定量分析，已达到获得中成药、保健品、食品中金银花成分掺伪结果。本发明的检测方法在3h之内即可完成金银花成分掺伪鉴定工作，具有简单易行、灵敏度高、快速、费用低、便于推广等特点，为中药掺伪鉴定开辟了广阔的前景。
【专利说明】一种快速检测金银花成分掺伪量的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于药物分析领域，具体涉及中成药、食品、保健品中金银花成分掺伪量的 检测方法，是一种利用焦磷酸测序技术对金银花及其伪品标志性核酸位点定量检测的方 法。
【背景技术】
[0002] 来源纯正、品质优良的药用植物资源是中药现代化和标准化生产的重要前提之 一。近年来不断出现中药材掺伪事件，不仅损害了中医药的信誉和消费者的信心，更使误 病害人，造成巨大的经济损失。本发明以大宗药材金银花为材料，基于DNA条形码标记中 Sentinel-base位点，结合焦磷酸测序分析技术，建立快速、高通量、自动化的金银花掺伪鉴 别方法，为规范、监管药材市场提供技术支撑。
[0003] 焦磷酸测序技术（Pyrosequencing)是应用于DNA序列分析的新一代技术。在遗 传分析中，可以提供核酸序列信息的分子检测技术是"黄金标准"，其权威性比其他DNA分 析方法如Northern杂交，基因芯片和实时定量PCR(Taqman探针）技术更好。其原理是：在 DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶4种酶的协同作用下，将引物上 每一个dNTP聚合与一次荧光信号释放偶联起来，通过检测荧光的释放和强度，达到实时测 定DNA序列的目的。该技术用于测量短DNA链序列，是目前唯一能实时得到定量序列结果 的技术，兼有PCR技术的灵敏性和测序技术的准确性，具有准确性高，重复性好，自动化程 度高，操作简单的特点，非常适合用于对蔬菜杂交品种种子纯度的鉴定。迄今为止，尚未有 成功利用焦磷酸测序技术鉴定中药掺伪量的报道。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于公开了一种金银花成分掺伪量检测方法，为实现上述目的，本 发明提供如下的技术方案：
[0005] 用于检测金银花成分掺伪量的PCR扩增及焦磷酸测序特异性引物，包 括引物正向序列：5' -Biotin-ATTATTTATCCTCCCCCTTTTATC-3'，反向引物序列： 5' -AACAITTCCGCTCAGATCTAITT-3'，测序引物序列：5' -GATGAGAAATATAACGAATT-3'。
[0006] 本发明所述快速检测金银花成分掺伪量的方法，该方法以供试样品基因组DNA为 模板，对已知目标片段进行PCR扩增分析，结合应用焦磷酸测序技术对标志性核酸位点进 行AQ分析及掺伪量计算，其包括如下步骤：
[0007] (1)采用引物正向、反向序列的2条PCR特异引物及G〇Taq?Master Mix，加入供 试样品模板DNA进行PCR扩增；其中的PCR扩增反应体系：扩增反应的总体积为50 μ L，其各 种成分分别为：2X GoTaq? Master Mix25 μ L，10 μ mol / L 引物各 1 μ L，模板 DNA2 μ L， 用灭菌去离子水补齐至50 μ L ;
[0008] 反应程序：95°C预变性10min，94°C变性30S，55°C退火30S，72°C延伸45S，循环50 次，最后72°C延伸7min，4°C保存；
[0009] (2)采用焦磷酸测序特异性引物，对供试样品的PCR扩增产物进行焦磷酸测序分 析；其中的焦磷酸测序反应体系：测序反应的总体积为100 μ L，其中各种成分分别为：PCR 产物 50yL，Sepharose Beads3yL，Binding Buffer47yL，10ymol / L 测序引物 1·2μ?， Annealing Buffer38. 8 μ L ；
[0010] (3)测序时间8?lOmin，测序结束后使用"AQ"模式对标志性核酸位点进行分析， 通过观察第二个测序碱基"T"和第三个测序碱基"G"的等位基因频率判定样品中金银花含 量掺伪情况，其中"T"碱基频率为样品中金银花伪品的含量，"G"碱基频率为样品中金银花 正品的含量，两者之和等于一。
[0011] 本发明所述的检测方法，其中的Binding Buffer47y L指的是：10mmol / L Tris-HCl, 2mol / L NaCl, I mmol / L EDTA，0· I % Tween20，ρΗ7· 6 的溶液；Annealing 1?11打6『38.8以1^指的是：2〇1111]1〇1/1^1'1'18-八〇，21111]1〇1/1^]\%八〇2，卩!17.6的溶液。
[0012] 本发明所述的检测方法，其中每条引物分别配制成浓度为ΙΟΟμπιοΙ / L的贮存 液，工作浓度为IOymol / L。
[0013] 本发明所述的检测方法，模板DNA指的是从待测样品提取的基因组DNA。
[0014] 本发明所述的检测方法，焦磷酸测序全过程为：测序引物与PCR扩增的DNA模板相 结合。然后将其与DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶，以及底物 APS和荧光素一起孵育；四种dNTP(dATP，dTTP，dCTP，dGTP)之一被加入反应体系，如与模 扳配对（A-T，C一G)，此dNTP与引物的末端形成共价键，dNTP的焦磷酸基团（PPi)释放出 来。而且释放出来的PPi的量与和模板结合的dNTP的量成正比；ATP硫酸化酶在三磷酸腺 苷双磷酸酶存在的情况下催化PPi形成ΑΤΡ,ΑΤΡ驱动荧光素酶介导的荧光素向氧化荧光素 的转化，氧化荧光素发出与ATP量成正比的可见光信号，光信号由CCD摄像机检测，并由可 见光信号峰表示。每个光信号的峰高与反应中掺入的核苷酸数目成正比；然后加入下一种 dNTP。最终待测序列顺序，即可从反应光强的信号峰中读出。
[0015] 为了能更加清楚的说明本发明的测定方法，下面对本发明的试验方法做以详细的 说明。
[0016] 1、原理
[0017] 本方法应用一种新型的核酸测序方法其原理是：在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧 光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶4种酶的协同作用下，将引物上每一个dNTP聚合与一次荧光 信号释放偶联起来，通过检测荧光的释放和强度，达到实时测定DNA序列的目的。本发明的 测序方法具有准确性高，重复性好，自动化程度高和操作简单等优点。
[0018] 2、引物设计
[0019] 本发明依据金银花及其常见伪品的差异性片段设计2条PCR扩增特异性引物和1 条焦磷酸测序引物。引物由上海生物工程公司合成。
[0020] 表1引物序列表如下：
[0021]
【权利要求】
1. 用于鉴定金银花成分惨伪量的PCR扩增及焦磯酸测序特异性引物，其特征在 于，包括引物正向序列；5' -Biotin-ATTATTTATCCTCCCCCTTTTATC-3'，反向引物序列： 5, -AACATTTCCGCTCAGATCTATTT-3，，测序引物序列；5, -GATGAGAAATATAACGAATT-3，。
2. -种采用权利要求1所述特异性引物，快速鉴定金银花成分惨伪量的方法，其特征 在于包括如下步骤： (1) 采用权利要求1所述的2条PCR特异引物及GoTaq? Master Mix,加入供试样品 模板DM进行PCR扩增；其中的PCR扩增反应体系；扩增反应的总体积为50 y L，其各种成 分分别为；2XG〇Taq?Master Mix25yL，10ymol / L 引物各 luL，模板 DNA2iiL，用灭 菌去离子水补齐至50yL; 反应程序；95°C预变性10min，94°C变性30S，55°C退火30S，72°C延伸45S，循环50次， 最后72C延伸7min，4°C保存； (2) 采用权利要求1所述的焦磯酸测序测序特异性引物，对供试样品的PCR扩增产物 进行焦磯酸测序分析；其中的焦磯酸测序反应体系；测序反应的总体积为100 y以其中各 种成分分别为；PCR 产物 50 y L, Se地arose Beads3 y L, Binding Buffer47 y L, 10 y mol / L 测序引物 1. 2 y L, Annealing Buffer38. 8 y L ; 做测序时间8?lOmin，测序结束后使用"AQ"模式对标志性核酸位点进行分析，通过 观察第二个测序碱基"T"和第H个测序碱基"G"的等位基因频率判定样品中金银花含量惨 伪情况，其中"T"碱基频率为样品中金银花伪品的含量，"G"碱基频率为样品中金银花正品 的含量，两者之和等于一。
3. 如权利要求2所述的鉴定方法，其中每条引物分别配制成浓度为100 y mol / L的胆 存液，工作浓度为10 y mol/Lo
【文档编号】C12Q1/68GK104419755SQ201310384569
【公开日】2015年3月18日 申请日期:2013年8月28日 优先权日:2013年8月28日
【发明者】兰青阔, 王永, 刘征辉, 赵新, 朱珠, 徐石勇, 陈锐, 郭永泽 申请人:天津市农业质量标准与检测技术研究所