鉴定不同产地的道地药材麦冬的方法，以及用于该方法的试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明涉及鉴定不同产地的道地药材麦冬的方法，以及用于该方法的试剂盒。具体地，本发明涉及鉴定浙麦冬和川麦冬的方法，其包括以下步骤：（1）从不同道地产区的麦冬样品中提取DNA样品；（2）鉴定如SEQ?ID?NO.1所示的核苷酸序列第88位碱基。进一步地，本发明涉及如SEQ?ID?NO.1所示序列的SNP88A/G作为分子标记物在用于鉴别浙麦冬和川麦冬中的用途，以及用于该用途中的试剂盒。
【专利说明】鉴定不同产地的道地药材麦冬的方法，以及用于该方法的试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明属于不同产地的道地药材种内鉴定【技术领域】，具体涉及用特异的SNP标记对不同产地的道地药材浙麦冬和川麦冬进行鉴定的方法。
【背景技术】
[0002]药材麦冬为百合科植物麦冬(Ophiopogon japonicus) (L.f)Ker-Gawl.的干燥块根，按道地产区不同分为浙麦冬与川麦冬两个品种。麦冬在我国用药历史悠久，被列为“上品”药材，具有养阴生津、润肺清心的功效。由于长期的生长环境及栽培方式的不同，麦冬形成了一定的种内变异，产生了两种不同的“地方性特化基因型”，从而表现出生长周期变化颇大、化学成分的组成与含量也有差异的不同特征。这就需要寻找一种合适的鉴定方法对这两种不同道地产区的麦冬药材进行快速准确的种内鉴定。
【发明内容】
[0003]本发明人利用在麦冬叶绿体基因非编码区psbA-trnH序列上发现SEQ ID N0.1序列，通过primer premier5.0引物设计软件设计引物LA-F20/R260,通过PCR反应并测序得到这段序列，发现其上具有SNP88A/G。并发现该SNP可用于鉴定浙麦冬和川麦冬。SEQ IDN0.1序列如所示序列所示。
[0004]本发明提供了一种鉴定浙麦冬和川麦冬的方法，其包括以下步骤:
[0005](I)从不同道地产区的麦冬样品中提取DNA样品；
[0006](2)鉴定如SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列第88位碱基。
[0007]根据本发明的方法，更具体地，当如SEQ ID N0.1所示序列的第88位碱基为G，则鉴定为浙麦冬；当如SEQ ID N0.1所示序列的第88位碱基为A，则鉴定为川麦冬。
[0008]根据本发明的方法，其进一步包括以所获的DNA样品为模板，扩增含有如SEQ IDN0.1所示序列的DNA片段的步骤。
[0009]本领域技术人员可以使用任何本领域公知的方法，检测上述SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列第88位碱基，例如，但并非限定地，如限制性内切酶片段长度多态性(RFLP)、DNA测序法、根据DNA列阵的微测序法、动态等位基因特异的杂交、寡聚核苷酸特异的连接、DNA芯片以及TaqMan系统方法、单链构象多态性(SSCP)、等位基因特异的寡聚核苷酸杂交(ASO)，等方法。
[0010]本发明的发明人通过大量的引物设计和筛选，最终选出一对特异性好、扩增效率闻的引物，其序列为:
[0011]正向序列LA-F20:ATGCTCACAACTTCCCTCTA (SEQ ID N0.2)；
[0012]反向序列LA-R260: CGCCTACTCTGACTTTCG (SEQ ID N0.3)。
[0013]上述引物用于扩增道地药材浙麦冬或川麦冬的如SEQ ID N0.1所示的序列。
[0014]根据本发明的方法，更具体地，其包括使用如下引物扩增含有如SEQ ID N0.1所示序列的DNA片段:
[0015]正向序列LA-F20:ATGCTCACAACTTCCCTCTA (SEQ ID N0.2)；
[0016]反向序列LA-R260: CGCCTACTCTGACTTTCG (SEQ ID N0.3)。
[0017]另一方面，本发明提供了一种分离的核酸，其具有如SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列，其中在所述核酸的第88位碱基具有SNP88A/G。
[0018]进一步地，本发明提供了如SEQ ID N0.1所示序列的SNP88A/G作为分子标记物在用于鉴别浙麦冬和川麦冬中的用途。
[0019]更具体地，根据本发明的用途，当如SEQ ID N0.1所示序列的第88位碱基为G，则鉴定为浙麦冬；当如SEQ ID N0.1所示序列的第88位碱基为A，则鉴定为川麦冬。
[0020]另一方面，本发明提供了一种用于鉴别浙麦冬和川麦冬的试剂盒，所述试剂盒含有至少一种用于检测如SEQ ID N0.1所示序列的SNP88A/G的试剂。
[0021]进一步地，根据本发明的试剂盒，其含有如下序列所示的引物:
[0022]正向序列LA-F20: ATGCTCACAACTTCCCTCTA ；
[0023]反向序列LA-R260: CGCCTACTCTGACTTTCG。
[0024]本发明 方法适用性广，能检测所有能提取出DNA的麦冬道地药材。因此，能够对麦冬原植物、药材、饮片和粉末进行快速、准确的种内鉴定。
【专利附图】
【附图说明】
[0025]图1所示为浙麦冬和川麦冬LA序列的比对结果。
【具体实施方式】
[0026]下面结合附图对本发明进一步说明。
[0027]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0028]实施例1道地药材麦冬及其原植物的种内鉴定方法
[0029]I)从不同道地产区收集93份道地药材及其原植物样品，分别取IOOmg药材或40mg叶片，在MM400球磨仪(德国Retsch)上进行研磨粉碎后，先用700 μ L的核分离液清洗3次，再用天根生化科技(北京)有限公司的植物基因组DNA试剂盒提取总DNA。
[0030]表1核分离液配制表
[0031]
【权利要求】
1.一种鉴定浙麦冬和川麦冬的方法，其包括以下步骤: (1)从不同道地产区的麦冬样品中提取DNA样品； (2)鉴定如SEQID N0.1所示的核苷酸序列第88位碱基。
2.根据权利要求1所述的方法，其中当SEQID N0.1所示序列的第88位碱基为G，则鉴定为浙麦冬；当SEQ ID N0.1所示序列的第88位碱基为A，则鉴定为川麦冬。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其进一步包括以所获的DNA样品为模板，扩增含有SEQ ID N0.1所示序列的DNA片段的步骤。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中可以使用选自限制性内切酶片段长度多态性(RFLP),DNA测序法、根据DNA列阵的微测序法、动态等位基因特异的杂交、寡聚核苷酸特异的连接、DNA芯片以及TaqMan系统方法、单链构象多态性(SSCP)、等位基因特异的寡聚核苷酸杂交(ASO)的方法检测上述SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列第88位碱基。
5.根据权利要求3所述的方法，其中使用如下引物扩增含有SEQID N0.1所示序列的DNA片段: 正向序列 LA-F20:ATGCTCACAACTTCCCTCTA ； 反向序列 LA-R260: CGCCTACTCTGACTTTCG。
6.一种分离的核酸，其具有SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列，其中在所述核酸的第88位碱基具有SNP88A/G。
7.如SEQID N0.1所示序列的SNP88A/G作为分子标记物在用于鉴别浙麦冬和川麦冬中的用途。
8.根据权利要求7所述的用途，其中当SEQID N0.1所示序列的第88位碱基为G，则鉴定为浙麦冬；当SEQ ID N0.1所示序列的第88位碱基为A，则鉴定为川麦冬。
9.一种用于鉴别浙麦冬和川麦冬的试剂盒，所述试剂盒含有至少一种用于检测SEQ IDN0.1所示序列的SNP88A/G的试剂。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其含有如下序列所示的引物: 正向序列 LA-F20:ATGCTCACAACTTCCCTCTA ； 反向序列 LA-R260: CGCCTACTCTGACTTTCG。
【文档编号】C12N15/11GK103540674SQ201310526080
【公开日】2014年1月29日 申请日期:2013年10月30日 优先权日:2013年10月30日
【发明者】陈士林, 刘霞, 林韵涵, 马晓冲, 张雅琴, 宋明, 王俊 申请人:中国中医科学院中药研究所