一株产聚3-羟基丁酸酯的嗜热菌的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一株产聚3-羟基丁酸酯的嗜热菌Aneurinibacillus?sp.XH2，保藏于中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC），保藏日期2013年11月6日，保藏号为CCTCC?M2013550。本发明是首次报道Aneurinibacillus属的菌株可以产生聚3-羟基丁酸酯。Aneurinibacillus?sp.XH2能在较高温度50℃下合成聚3-羟基丁酸酯，其发酵温度高于其他聚3-羟基丁酸酯常温生产菌（发酵温度为30-40℃），可以有效避免杂菌的污染，从而具有广阔的应用前景。
【专利说明】一株产聚3-羟基丁酸酯的嗜热菌
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，具体涉及一株产生聚3-羟基丁酸酯的嗜热菌Aneurinibacillus sp.XH2。
【背景技术】
[0002]聚羟基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanoates)是一类由微生物合成的高分子聚合物，是细菌胞内的一种能源储备物，因其具有生物可降解性和较好的环境相容性而被广泛应用，例如:环境友好的生物塑料制品、可生物降解和生物相容的手术植入物、药物控释载体材料、食品和饲料添加物和生物燃料等。目前，微生物来源的聚羟基脂肪酸酯已经形成了包括:工业发酵、材料、医药、生物燃料和精细化工等行业在内的庞大产业价值链。
[0003]根据单体组成，人们把微生物合成的聚羟基脂肪酸酯分成两大类:一类是短链聚羟基脂肪酸酯，如聚3-羟基丁酸酯(p0ly(3-hydr0Xybutyrate)，PHB);另一类是中长链聚羟基脂肪酸酯，如聚羟基己酸酯(Polyhydroxyhexanoate)。聚羟基脂肪酸酯的分子量从几万至几百万不等。影响其结构的因素有共聚单体的个数、侧链基团、聚合单体的数目及羟基的位置等，随着这些不定因素的改变而形成了不同的聚羟基脂肪酸酯，从而使其具有不同的物理化学性质，例如:熔点、韧度、玻璃态温度等。经过对物理性质和分子结构等方面研究，发现:PHB作为高度结晶的晶体与聚丙烯的相似度很高，具体表现在其熔点、结晶度、玻璃化转变温度等方面。除此之外，PHB还具有许多独特的优点，例如光学活性好、比重大、透氧性低、生物组织相溶性、抗凝血等，从而使其具有较好的应用前景。[0004]虽然目前发现有300多种微生物可以产生聚羟基脂肪酸酯，但极端环境下的微生物资源因其具有适应特殊环境的特点，如:嗜热、嗜盐、嗜压等，因此具有重要的应用价值和研究意义。目前PHB的生物发酵合成主要是在常温条件(30-40°C)下进行，在实际生产过程中容易造成杂菌的污染，并且经过基因改造过的工程菌株存在不稳定性及其他潜在风险。自然界存在的嗜热微生物产生PHB的报道较少。因此，开发利用天然嗜热PHB产生菌具有重要的实际意义。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一株新发现的产聚3-羟基丁酸酯(PHB)的嗜热菌Aneurinibacillus sp.XH2。是首次报道该 Aneurinibacillus 属的菌株可以产生 PHB。
[0006]本发明提供的PHB合成菌为Aneurinibacillus sp.XH2,该菌已于2013年11月6日保减在中国典型培养物保减中心(地址:中国.武汉.武汉大学)，保减编号为:CCTCCM2013550。
[0007]本发明的PHB合成菌XH2分离自胜利油田孤岛采油厂原油采出水。该菌在LB培养基上生长良好(LB培养基组成为10g蛋白陈，5g酵母粉，5g NaCl)。菌落呈圆形，乳白色，边缘整齐。菌株为革兰氏阳性。菌体长杆状，大小约为0.5-Ι.Ομπι宽，3.0-6.0 μ m长。该菌的最适生长温度为50°C。其产生PHB细胞内含物的透射电子显微镜见说明书附图1。该菌的16S rRNA基因的核苷酸序列的GenBank登录号为:KF791865。将16S rRNA基因和GenBank中的登录序列进行相似性比对，发现该菌株与已报道的Aneurinibacillus属的16S rRNA基因序列相似性最高。菌株XH2和相似性高的标准菌株的系统进化树见说明书附图2。
[0008]本发明采取以下技术方案:种子培养基为LB。发酵培养基为YPG (m/v):2%葡萄糖、2%蛋白胨、1%酵母粉。将菌种接种到50ml种子培养基，50°C下水浴摇床振荡培养，转速150rpm,培养24小时后，按照1%的接种量接种到液体发酵培养基，摇瓶发酵48_96h。离心发酵液，弃上清，收集菌体后干燥。用氯仿对干细胞中的PHB进行提取:使用量为lg干细胞加入10ml氯仿。于抽提瓶反应釜中，在100°C下密封加热4h ;冷却后，用抽滤法去掉细胞碎片，得到澄清的氯仿溶液；将氯仿溶液加入到10倍体积的冰冷乙醇中，得到PHB沉淀，抽滤；收集沉淀；将收集的PH B沉淀物至40°C真空干燥箱中24h待其溶剂挥发完全后，即可得到PHB ;制作PHB膜的方法即用PHB再溶解于氯仿中，经回流加热充分融解后至平皿中，挥发干溶剂后至真空干燥箱烘干即可。经过鉴定，该菌株Aneurinibacillus sp.XH2产生的聚轻基脂肪酸酯的单体为3-羟基脂肪酸，见说明书附图3-5。
[0009]本发明与现有技术相比所具有的突出优点在于:首次报道Aneurinibacillus属的菌株能产生PHB，该菌株XH2能在高温50°C下合成PHB。其嗜热的特点，使发酵温度高于其他绝大多数天然PHB产生菌和工程菌(30-40°C)，可以有效避免杂菌的污染，从而具有广阔的应用前景。利用本专利提供的方法，该菌发酵产生PHB的主要单体形式为3-羟基脂肪酸(占提取物的95%以上)，有效的避免了其他杂合形式PHB造成的影响。
【专利附图】
【附图说明】
[0010]图1是菌株Aneurinibacillus sp.XH2的透射电镜照片；
[0011]图2是菌株Aneurinibacillus sp.XH2的系统进化树；
[0012]图3是菌株Aneurinibacillus sp.XH2合成的PHB单体的甲醇酯化产物质谱图和化学结构式；
[0013]图4是菌株Aneurinibacillus sp.XH2合成的PHB产物红外图谱和购买的标准品的红外图谱；
[0014]图5是菌株Aneurinibacillus sp.XH2合成PHB的核磁共振图谱。
【具体实施方式】
[0015]在下面的实施例中，所用菌种均为Aneurinibacillus sp.XH2。
[0016]实施例中所用的不同培养基配方如下:
[0017](1)筛选培养基:
[0018]牛肉浸膏lg,蛋白胨lg,NaC10.5g,葡萄糖2g,琼脂粉1.5g,蒸懼水100ml,ρΗ7.0。
[0019](2)富集培养基和发酵培养基:
[0020]YPG培养基(m/v):2%葡萄糖、2%蛋白胨、1%酵母粉，ρΗ7.0。
[0021]实施例1 分离筛选 Aneurinibacillus sp.XH2
[0022]实验材料来自胜利油田孤岛采油厂的原油采出水。
[0023]具体实施步骤如下:
[0024]富集培养:在水样品中加入富集培养基，然后将上述富集培养物分装到锥形瓶中，迅速加热至100°c，然后再迅速转入60°C的水浴摇床中进行往复震荡(150rpm)培养2d。
[0025]菌株分离纯化:配制固体种子培养基，每升中含有:20g葡萄糖,20g蛋白胨,10g酵母粉，17g琼脂粉。调整pH值至7.0 ;将富集培养液用无菌生理盐水进行梯度稀释，涂布到上述固体种子培养基上，置于60°C的恒温箱中培养2d，用接种环挑取单菌落，得到纯菌。
[0026]实施例2Aneurinibacillus sp.XH2 鉴定与保藏
[0027](1)形态特征
[0028]菌株XH2的菌落在LB培养基上呈圆形，乳白色，边缘整齐。为革兰氏阳性菌。菌体长杆状，大小约为0.5-1.0 μ m宽，2.0-6.0 μ m长，细胞内可见大量的颗粒状内含物(透射电镜见说明书附图1)。
[0029](2)菌株16S rRNA鉴定与保藏
[0030]使用细菌16S rRNA通用引物27F和1492R作为扩增引物，采取PCR方法扩增菌株Aneurinibacillus sp.XH2的16S rRNA片段，电泳检测后，送上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序，获得测序结果，并用美国国立生物技术信息中心(NCBI)的BLAST程序对该菌的16S rRNA序列和GenBank已收录的序列进行核苷酸同源性比对。发现与之序列相似性大于99%的已知菌株是Aneurinibacillus属，因此本发明菌株鉴定为Aneurinibacillus属，并命名为Aneurinibacillus sp.XH2。根据相似标准菌株的16S rRNA序列构建的系统发育树如说明书附图2。本发明菌株Aneurinibacillus sp.XH2已于2013年11月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M2013550。该菌株的16S rRNA序列已提交到GenBank数据库中，登录号为KF791865。
[0031](3)菌株生理生化特征
[0032]对菌株Aneurinibacillus sp.XH2进行了生理生化特征鉴定，结果如表1所示。
[0033]表lAneurinibacillus sp.XH2 的生理生化特征
[0034]
【权利要求】
1.一株产聚3-羟基丁酸酯的嗜热菌Aneurinibacillus sp.XH2,其特征在于:该菌株已于2013 年11月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC M2013550。
【文档编号】C12R1/01GK103667153SQ201310705052
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年12月19日 优先权日:2013年12月19日
【发明者】郗丽君, 肖梓军, 张瑜, 朱贤琨, 钟骏, 吕建仁 申请人:中国石油大学(华东)