全人源抗 cd26 抗体及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种新的可与CD26特异性结合的高亲和力全人源抗体、制备方法及其应用，属于基因工程抗体【技术领域】。CD26是一种普遍存在的多功能Ⅱ型跨膜糖蛋白，具有多种生物学功能，可以和多种蛋白相互作用，如ADA、CD45、FAP-alpha等。本发明提供的一种来源于人源的抗体或其片段，所述抗体或其片段特异性结合人CD26，优选特异性结合CD26胞外区，所述抗体或其片段的氨基酸序列包括选自含有SEQ?ID?NO:2、SEQ?ID?NO:3、SEQ?ID?NO:4、SEQ?ID?NO:6、SEQ?ID?NO:7、SEQ?ID?NO:8一组序列的6个互补决定区的任何区域的单克隆抗体或其片段或其片段的偶联物，或通过氨基酸置换或者修饰得到的氨基酸序列。本发明得到的抗CD26单链抗体与CD26具有高特异性结合，同时也可以明显抑制肿瘤细胞的增殖和侵袭转移。
【专利说明】全人源抗CD26抗体及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于基因工程抗体【技术领域】，尤其是涉及一种新的可与CD26特异性结合的高亲和力全人源抗体、制备方法及其应用。
【背景技术】
[0002]⑶26是一种普遍存在的多功能II型跨膜糖蛋白，具有多种生物学功能，也可以以溶解形式存在于血浆中。CD26常以同源二聚体形式存在，其单体含766个氨基酸，相对分子质量约llOkDa。氨基酸残基从内向外分为5个部分:胞内区(I~6)、跨膜区(7~28)、高度糖基化区(29~323)、富含半胱氨酸区(324~551)和C端催化结构域(552~766)，⑶26分子三维结构与功能密切相关。⑶26的C端催化结构域发挥二肽基肽酶IV (Dipeptidylpeptidase4,DPPIV)活性，可以水解体内多种底物发挥生物学作用，富含半胱氨酸区可以和体内多种分子相互作用，从而参与体内免疫功能。CD26在免疫调节中的作用已被广泛研究，CD26是T细胞活化的分子标志，也在T细胞信号转导过程中作为共刺激分子，还涉及多种T细胞功能，包括T细胞发生成熟及迁移，细胞因子分泌，T细胞依赖的抗体产生，B细胞免疫球蛋白转型等。CD26在自身免疫性疾病的发生发展过程中发挥重要作用，已成为临床疾病的分子标志，并被认为是某些免疫性疾病的治疗或诊断靶点。(Ohnuma et al.(2011)AdvClin Chem, 53，51-84)
[0003]⑶26由于可以和多种蛋白相互作用，如ADA、⑶45、FAP-alpha等，还可以结合ECM,导致表达CD26细胞浸润活性的增加或降低，可见CD26在肿瘤生物学发挥重要作用。⑶26 的表达量在多种的新生瘤细胞表面或血清中会升高，例如，⑶26高表达于某些进攻性T细胞恶性肿瘤，恶性间皮瘤，肾瘤，某些结肠癌(Havre et al.(2008) FrontBiosci, 13，1634-1645)。某些⑶26+结肠癌细胞亚群，⑶26+恶性间皮瘤细胞都有明显肿瘤干细胞特征(Ghani et al.(2011)Biochem Biophys Res Commun, 404，735_742and Pang etal.(2010)Cell Stem Cell, 6，603-615)，因此CD26可作为多种肿瘤的分子标志。
[0004]已有多种结合⑶26的鼠源抗体报道(Havre et al.(2008)FrontBiosci, 13，1634-1645)，在治疗某些⑶26高表达癌症，以及抑制细胞迁移，血管形成方面都能发挥作用。有文献报道抗CD26的鼠单克隆抗体1F7与CD26的结合导致细胞周期停滞在G1/S限制点，并且CD26的结合通过增强表达细胞周期调节蛋白质p21来诱导CD26Jurkat转染子停滞在Gl，用1F7抗体治疗可以抑制CD26+肿瘤的形成，并在小鼠模型中增强存活率。其他抗CD26的鼠单克隆抗体E19和E26，这些抗体表现出抑制成纤维细胞和创伤细胞的细胞迁移来形成单层的抑制作用、对血管形成的抑制效果、以及对人皮肤微血管内皮细胞的侵入和毛细管新支的形成具有抑制效果。由此可见，抗CD26单克隆抗体可通过改变CD26的活性在治疗多种疾病中发挥作用。但是，鼠单克隆抗体在直接应用于人体治疗时会产生人抗鼠抗体反应(Human Ant1-Mouse Antibody, HAMA),人体会产生抗小鼠抗体的抗体，不仅会减弱疗效，也会导致急性致敏反应。为了克服鼠源单抗的缺点，基因工程抗体技术发展出了人-鼠嵌合抗体，嵌合抗体由鼠源性抗体的V区基因与人抗体的C区基因拼接为嵌合基因，使鼠源性成分减少70%左右，以及人源化抗体，在嵌合抗体的基础上进一步用人抗体可变区的骨架区(FR)替代鼠FR，大大减少了抗体的鼠源成分。但残留的少量鼠抗体的序列仍有可能潜在引发HAMA。
【发明内容】
[0005]本发明所要解决的技术问题:本发明旨在提供一种能有效的、特异性结合人CD26的全人源抗体，及其在制备治疗以CD26的表达，特别是过量表达为特征的疾病，诊断CD26变化性表达疾病的药物中的新用途。更具体地说:
[0006]本发明第一个目的是提供一种来源于人源的抗体或其片段，所述抗体或其片段特异性结合人CD26，优选特异性结合CD26胞外区，所述抗体或其片段的氨基酸序列包括选自含有 SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8一组序列的6个互补决定区的任何区域的单克隆抗体或其片段或其片段的偶联物，或通过氨基酸置换或者修饰得到的氨基酸序列。
[0007]优选的是本发明中的抗体或其片段的氨基酸序列含有如SEQ ID NO:2, SEQ IDN0:3和SEQ ID N0:4所示序列的重链可变区的互补决定区。
[0008]优选的是本发明中的抗体或其片段的氨基酸序列含有如SEQ ID NO:6, SEQ IDN0:7和SEQ ID N0:8所示序列的轻链可变区的互补决定区。
[0009]更为优选的是本发明中的抗体或其片段，其重链可变区的氨基酸序列含有以下的互补决定区:如序列SEQ ID NO:2所示的CDRH1，如序列SEQ ID NO:3所示的CDRH2，如序列 SEQ ID NO:4 所示的 CDRH3 ；
[0010]以及其轻链可变区的氨·基酸序列含有以下的互补决定区:如序列SEQ ID NO:6所示的CDRL1，如序列SEQ ID NO:7所示的CDRL2和如序列SEQ ID NO:8所示的CDRL3。
[0011]更为优选的是本发明中的抗体或其片段含有重链可变区如SEQ ID NO:1所示序列和轻链可变区如SEQ ID N0:5所示序列。
[0012]本发明第二个目的是提供一种来源于人源的单链抗体，所述单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO: 11所示。
[0013]本发明第三个目的是提供一种编码上述单链抗体的核苷酸序列，所述核苷酸序列如 SEQ ID NO: 10 所示。
[0014]本发明第四个目的是提供一种含有上述核苷酸序列的表达载体。
[0015]本发明第五个目的是提供一种含有上述表达载体的重组宿主菌。
[0016]本发明第六个目的是提供一种生产上述单链抗体的方法，包括:
[0017]I)在合适的条件下培养上述重组宿主菌表达抗体；
[0018]2)然后从宿主菌中纯化、收集抗体。
[0019]本发明第七个目的是提供上述抗体或其片段在制备治疗CD26高表达肿瘤的药物中的新用途。可治疗以CD26的表达，特别是过量表达为特征的疾病，并为诊断CD26变化性表达疾病提供了基于抗体的方法，相关疾病包括但不限于自身免疫病和癌症。
[0020]发明进一步说明:
[0021]本发明中全人源抗⑶26单链抗体基因序列全长723个核苷酸，预期有241个氨基酸。具有115个氨基酸的重链可变区(SEQ ID NO:1)和111个氨基酸的轻链可变区(SEQ IDNO: 5)，重链可变区和轻链可变区之间由15个氨基酸的柔性肽连接(SEQ ID N0:9)。
[0022]含有本发明CD26单链抗体基因的表达载体和宿主菌均属于本发明的保护范围。扩增本发明单链抗体基因的任意片段的引物对也在本发明的保护范围之内。
[0023]本发明的有益效果有:
[0024]本发明中的抗体或其片段具有多种特性，包括结合并中和CD26的能力。具体而言，本发明得到的抗CD26单链抗体与CD26具有高特异性结合，体外可以抑制肿瘤细胞通过CD26介导的细胞粘附作用，体外抑制肿瘤细胞生长实验结果表明，本发明得到的单链抗体可以明显抑制肿瘤细胞的增殖和侵袭转移。
【专利附图】
【附图说明】
[0025]图1是单链抗体ZHB_2cF9的结构示意图。VH代表重链可变区结构域(SEQ IDNO: 1)，VL代表轻链可变区结构域(SEQ ID NO: 5)，Linker为连接VH，VL的柔性肽(SEQ IDN0:9)。
[0026]图2是⑶26胞外区蛋白的鉴定图。A是纯化后蛋白的SDS-PAGE图，LaneI为标准蛋白，Lane2为纯化后⑶26胞外区蛋白(箭头所指);B是纯化后⑶26胞外区蛋白的WesternBlot鉴定图，Lanel为标准蛋白，Lane2为纯化后(D26胞外区蛋白(fir头所指),一抗为抗CD26鼠抗(购自MBL)，二抗为兔抗鼠-HRP抗体(购自life technology)。
[0027]图3A、图3B是噬菌体抗体与⑶26胞外区蛋白结合的ELISA测定结果。图3A是多克隆噬菌体ELISA，⑶26胞外区蛋白包被浓度为I μ g/mL，稀释4轮筛选扩增的噬菌体，与包被⑶26胞外区蛋白的酶标板孵育，抗M13-HRP抗体再次孵育，测定450nm，650nm吸光值，并以OD45tlm1-OD65tlnm作为最终值。结果表明，展示有CD26特异性单链抗体的噬菌体得到了明显的富集。图3B是单克隆噬菌 体ELISA测定结果，挑选单克隆至96孔板中表达噬菌体抗体，与包被CD26胞外区蛋白的酶标板孵育，抗M13-HRP抗体检测结果，测定OD45tol-OD65tlnm作为最终值，结果显示90%以上的单克隆与CD26胞外区蛋白产生阳性结合作用。
[0028]图4是单链抗体ZHB-2cF9的鉴定图。A是镍柱纯化后的ZHB_2cF9的SDS-PAGE图,Lane2为ZHB-2cF9样品蛋白，蛋白fif头所指为目的蛋白大小条带；Lanel为标准蛋白；B是纯化后ZHB-2cF9的Western Blot鉴定图，一抗为抗myc鼠抗,二抗为兔抗鼠-HRP抗体，Lanel为ZHB_2cF9样品，蛋白箭头所指为目的蛋白大小条带，Lane2为标准蛋白。
[0029]图5展示单链抗体ZHB_2cF9与CD26胞外区蛋白结合的Western Blot鉴定图。一抗为抗myc鼠抗，二抗为兔抗鼠-HRP抗体。Lanel为标准蛋白，Lane2为ZHB_2cF9与⑶26胞外区蛋白结合作用，箭头所指显示了与图2中CD26胞外区蛋白大小一致的条带。结果表明表明抗⑶26单链抗体ZHB-2cF9可以特异性与⑶26胞外区蛋白结合。
[0030]图6展示单链抗体与人间皮瘤细胞NC1-H2452结合的免疫荧光图。A是ZHB_2cF9与NC1-H2452细胞的免疫荧光，B是阴性对照抗体与NC1-H2452细胞免疫荧光结合检测的阴性结果，抗体浓度均由5%MPBS稀释至10 μ g/mL。
[0031]图7展示单链抗体抑制人间皮瘤细胞NC1-H2452结合ECM的检测结果。实验所用ECM为纤连蛋白，实验分为Binding组，Blank组,抗体试验组,考察单链抗体作用12h后的细胞对纤连蛋白的粘附情况。
[0032]0D450 (Binding 组)-0D450 (Blank 组)=完全粘附细胞值；[0033]0D450 (抗体试验组)-0D450 (Blank组)=样品组的细胞粘附值；
[0034]IgG control为阴性对照抗体；
[0035]细胞粘附率(％)=样品组的细胞粘附值/完全粘附细胞值
[0036]结果表明，与阴性对照IgG control相比，ZHB_2cF9及阳性对照scFv-YSllO对NC1-H2452细胞粘附均有明显抑制作用。
[0037]图8展示单链抗体对人间皮瘤NC1-H2452细胞增殖抑制的检测结果。细胞以I X IO4/孔的数量孵于96孔板中，在单链抗体ZHB-2CF9，scFv-YSllO及阴性对照抗体IgG(鼠)作用48h后，采用CCK-8试剂反应30min，测定450nm的吸光度值，细胞的增殖抑制率以0D450nm的减少率％表示。实验结果表明ZHB_2cF9及阳性对照scFv-YSllO对NC1-H2452均有明显抑制作用，且呈浓度依赖性。
[0038]图9展示单链抗体对人结肠癌HCT116细胞增殖抑制的检测结果。细胞以8X IO4/孔的数量孵于96孔板中，在单链抗体ZHB-2cF9，scFv-YSllO及阴性对照抗体IgG (鼠)作用48h后，采用CCK-8试剂反应30min，测定450nm的吸光度值，细胞的增殖抑制率以0D450nm的减少率％表示。实验结果表明ZHB-2cF9及阳性对照scFv-YSllO对NC1-H2452均有明显抑制作用，且呈浓度依赖性。
【具体实施方式】
[0039]定义
[0040]“抗体”是能够通过可变区内至少一个抗原识别位点特异性结合靶抗原的免疫球蛋白分子，所述靶抗原如糖、多核苷酸、脂、多肽等。该术语不仅包括完整的多克隆和单克隆抗体，也包括其片段(例如Fab、Fab ’、F (ab ’)2、Fv )、单链抗体(scFv )、其突变体、包含抗体部分的融合蛋白和任一包含抗原识别位点的其他改变构型的免疫球蛋白分子。抗体包括任一类的抗体，如IgG、IgA或IgM (或其亚类)，并且抗体不需要为任一特定类。
[0041]如本文所用，“单链抗体”指的是免疫球蛋白重链可变区(Vh)和轻链可变区(')由10~25个氨基酸多肽连接形成的单一链融合蛋白，连接肽(linker),通常富含甘氨酸和丝氨酸，以利于单链抗体的稳定性与柔韧性。连接方式可将\的N端连接至Vh的C末端，或者相反。尽管去除了恒定区并引入linker，单链抗体依然保留了免疫球蛋白对抗原的特异性。
[0042]“嵌合抗体和人源化抗体”，一般来说指的是组合了来自不止一个物种的区域的抗体。“嵌合抗体”在传统上包含来自小鼠(或某些情况下为大鼠)的可变区和来自人的恒定区。“人源化抗体” 一般是指非人(例如鼠)抗体形式，其为含有衍生自非人免疫球蛋白最小序列的特定嵌合免疫球蛋白，免疫球蛋白链或其片段(例如Fv、Fab、Fab’、F (ab’)2或抗体的其它抗原结合子序列)。一般而言，在人源化抗体中，除CDR外，整个抗体是由人来源的多核苷酸编码，或者与由人来源的多核苷酸编码的抗体在CDR之外具有同一'丨生。一些或所有的CDR是由非人生物体来源的核酸编码的，将它们移植到人抗体可变区的片层框架区以产生抗体，该抗体的特异性由植入的CDR决定。
[0043]如本文所用，“人源抗体”表示具有与人产生的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列的抗体、和/或用本领域已知或本文公开的制备人源抗体的任一技术制备的抗体。人源抗体可以用多种本领域已知技术产生。例如，人源抗体选自噬菌体文库，其中所述的噬菌体文库表达人源抗体。人源抗体也可以通过将人免疫球蛋白基因座(loci)引入转基因动物来制备，其中所述的转基因动物例如已将内源免疫球蛋白基因部分或完全灭火的小鼠。备选地，人抗体可以通过永生化产生抗靶抗原的抗体的人B淋巴细胞(该B淋巴细胞可以从个人获得或者已在体外进行免疫)来制备。在一些实施方案中，人源抗体为“全人源”，这表示抗体包含人重链和轻链多肽。
[0044]现在结合以下实施例说明本发明。提供这些实施例仅用于说明的目的，本发明不限于这些实施例，而是包含明显由本文提供的教导产生的所有改变。用于构建载体和质粒、将质粒导入宿主细胞和基因，以及基因产物的表达鉴定等常规方法的详细描述可以从各种出版物上获得，例如《分子克隆实验指南第三版》。实施例中涉及的百分比，其中固体试剂为重量百分比，液体试剂为体积百分比。
[0045]部分材料来源说明于此:
[0046]细胞系:HLF细胞，是人的未分化的肝癌细胞，获自JCRB cell bank (JapaneseCollection of Research Bioresources Cell Bank)。NC1-H2452,是人间皮瘤细胞，获自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库/中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。HCT116，是人结肠癌细胞，获自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库/中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。
[0047]培养基和缓冲液等试剂:RPM1-1640(GIBC0，Cat#31800022，添加NaHCO3 1.5g/L,glucose2.5g/L, Sodium Pyruvate0.llg/L), 90% ;优质胎牛血清，(GIBCO) 10%。
[0048]2YT 培养基:IL 内含 Trptone (OXID) 16g, Yeast Extract (OXID) IOg, NaC15g.[0049]2YT-AK培养基:2YT含100 μ g/mL氨苄青霉素和50 μ g/mL卡那霉素.[0050]2YT-AG培养基:2YT含100 μ g/mL氨苄青霉素和2%葡萄糖.[0051]10XPBS:(购自北京索莱宝，Cat#P1022).[0052]5%MPBS 或 2%MPBS:含有 5% 或 2% 脱脂奶粉(OXID)的 PBS.[0053]0.1%PBST:含有 0.l%Tween20 (购自北京索莱宝)的 PBS.[0054]2%BSA:含有 2%BSA (购自 MP Biomedicals)的 PBS
[0055]Amp:氨苄青霉素(购自上`海生工).[0056]Kan:卡那霉素(购自上海生工).[0057]IPTG:(购自 Amresco).[0058]其他常见试剂如盐酸，NaCl, Tris,甘氨酸等购自国药集团化学试剂有限公司。
[0059]菌株:TG1，大肠杆菌(获自中国微生物菌种网)；HB2151，大肠杆菌(获自中国微生物菌种网)
[0060]质粒:p3XFLAG_CMV9(购自 Sigma-Aldrich) ；pHEN2 (获自 Medical ResearchCouncil(UK))
[0061]实施例1⑶26胞外区蛋白的制备
[0062]本研究的目的在于通过重组质粒转染真核细胞，G418抗性筛选获得稳转细胞株，分泌表达⑶26胞外区蛋白，经亲和层析分离纯化出⑶26胞外区蛋白。
[0063]CD26胞外区基因是选自Uniprot:P27487序列中氨基酸29-766位“Extracellular”区域的合成基因，将⑶26胞外区基因连入质粒p3XFLAG_CMV9，酶切位点为Hind III，Xba I，构建重组质粒(J.萨姆布鲁克.分子克隆实验指南.第三版.科学出版社.2002.P68)。
[0064]采用Lipofectamine LTX Reagent(购自Invitrogen)并按照说明书方法将含⑶26胞外区基因的重组质粒转入HLF细胞。根据稳定转染细胞系构建方法(Current Protocolsin Molecular Biology, P9.5.5)获得CD26胞外区稳定表达细胞株，记为HLF-4D9，无血清大量培养，分泌表达⑶26胞外区蛋白，该蛋白带有Flag标签，采用ANT1-FLAG M2 AffinityGel (购自Sigma-Aldrich)，对无血清培养上清进行纯化获得⑶26胞外区蛋白纯品，SDS-PAGE (图2A)分析及Western Blot (J.S.博尼费斯农.精编细胞生物学实验指南.科学出版社.2007.P177)鉴定(图2B)，一抗为抗⑶26鼠抗(购自MBL)，二抗为兔抗鼠-HRP抗体(购自 life technology)。
[0065]结果如图2所示，图2A是SDS-PAGE对纯化蛋白的鉴定图，经一步亲和层析获得电泳纯级目的蛋白大小的单条带(Lane2),图2B是对纯化的蛋白进行Western Blot鉴定图，Lane2所示条带与SDS-PAGE鉴定结果蛋白大小一致，表明⑶26胞外区基因经克隆重组转染真核细胞并表达，纯化后获得电泳纯级CD26胞外区蛋白。
[0066]实施例2全人源抗⑶26单链抗体的分离
[0067]该单链抗体从人单链抗体噬菌体展示库，采用CD26胞外区蛋白的固相亲和筛选得到，该人单链抗体噬菌体展示库由江苏众红生物工程创药研究院有限公司构建。该含有人细胞产生的抗体的重链及轻链可变区的噬菌体展示库构建自人外周血淋巴细胞，通过使用抗体可变区基因特异的引物进行首轮扩增，二轮扩增将重链轻链可变区采用柔性连接肽基因连接形成单链抗体基因，并将单链抗体基因克隆入质粒PHEN2中转化大肠杆菌TGl，获得IO8p.f.u.噬菌体单链抗体展示库。(沈倍奋.重组抗体.科学出版社.2005.P107)
[0068]将该单链抗体库原种培养到对数生长阶段，用M13K07辅助噬菌体感染，在2YT-AK培养基中，30°C摇床培养过夜。·噬菌体用4%PEG/2.5M NaCl沉淀，并重悬于PBS中并测定抗体库滴度，获得滴度为IO11P.f.u的噬菌体单链抗体库。(甄永苏.抗体工程药物.化学工业出版社.2002.P51)以PBS稀释⑶26胞外区蛋白至50 μ g/mL ;包被至酶标板(Max1-sorp96, Nunc)中，同时设置空白对照孔(不含⑶26胞外区蛋白)，随后进行封闭。将噬菌体单链抗体库悬浮于2%MPBS，取100 μ L加入到封闭过的空白孔中，室温放置60min后，加入到含有⑶26胞外区蛋白的孔中，室温放置2h ；0.P/oPBST及PBS分别洗涤10次，加入IOOyL0.1M盐酸(用甘氨酸调至pH2.2)，室温振荡IOmin, 15 μ LlM Tris (ρΗ9.0)用于迅速中和洗脱下来的噬菌体；中和后的噬菌体感染5mL对数期的大肠杆菌TG1，取IOOuL,做I~3次100倍系列稀释，然后将系列稀释物铺TYE固体培养基(含有100 μ g/mL Amp和1%葡萄糖)，剩余的菌液再加入20mL含2X 101QM13K07辅助噬菌体的2YT-AG进行扩增和制备噬菌体库，用于下一轮筛选过程，共进行4轮筛选。
[0069]被展示在噬菌体颗粒表面的抗体片段被称为噬菌体抗体，本实验先通过多克隆噬菌体ELISA鉴定4轮筛选后⑶26特异性噬菌体抗体的富集情况，后通过单克隆噬菌体ELISA进一步鉴定挑选出髙亲和力的噬菌体抗体。
[0070]多克隆噬菌体ELISA鉴定，包被抗原即I μ g/mL⑶26胞外区蛋白至酶标板，封闭后，取10 μ L每轮筛选后获得的噬菌体，2%MPBS稀释后加入到抗原包被酶条中。室温孵育90min，洗涤后加入鼠抗M13噬菌体-HRP抗体(购自北京义翘神州生物技术公司)室温孵育Ih，洗涤后，加入IOOyL TMB显色液(购自AMRESC0)。室温孵育IOmin后，IM稀硫酸终止反应。测定OD45tl和OD65tl，并以OD45tl-OD65tl作为最后检测结果。如图3A所示，以BSA包被的酶标板作为阴性对照，随着筛选轮数增加，噬菌体抗体与CD26胞外区蛋白的结合增强，表明带有CD26特异性抗体的噬菌体得到了明显的富集。
[0071]单克隆噬菌体ELISA鉴定，随机挑选第三轮第四轮筛选过程的滴度测定平板上挑取单克隆到96孔细菌培养板(购自Corning)中，每孔已经添加2YT培养基(含有100 μ g/mL Amp和1%葡萄糖)，37°C培养至对数期，每孔加109p.f.u.M13K07辅助噬菌体37°C静置感染30min，37°C培养lh。1800g离心lOmin，弃上清。将菌体沉淀重悬于200 μ L2YT-AK培养基，30°C摇床培养过夜。次日1800g离心IOmin获得的含噬菌体的培养上清，用1/10体积的20%MPBS室温孵育lh，再加入到包被有重组⑶26胞外区蛋白的酶标板中，ELISA鉴定(方法及试剂同多克隆噬菌体ELISA鉴定)。测定OD45tl和OD65tl，并以OD45tl-OD65tl作为最后检测结果。选出读数高的克隆进行DNA序列测定。图3B显示了部分单克隆噬菌体ELSIA的检测结果，90%以上的单克隆显示阳性结合作用，进一步表明通过4轮筛选，带有⑶26特异性抗体的噬菌体得到了明显的富集。从中挑选50个读数高的单克隆测序，获得核苷酸编码序列如SEQ ID NO: 10所示的单链抗体(记为ZHB-2cF9)。所对应的单链抗体ZHB_2cF9的氨基酸序列为SEQ ID NO: 11。
[0072]实施例3抗⑶26单链抗体的可溶性表达及分离纯化
[0073]pHEN2是一个双功能噬菌粒载体，在表达检测标签(c-my tag)与外壳蛋白基因之间有一个琥珀型终止密码子(Amber) TAG。如果噬菌体感染琥珀突变(SupE)抑制型菌株，如TG1，TAG密码子被翻译为谷氨酸，序列可以通读翻译，抗体片段与外壳蛋白p3融合表达于噬菌体表面；当噬菌体感染非琥珀突变抑制型菌株时，如HB2151，翻译在TAG处终止，可得到可溶型表达的抗体片段。抗体片段C端带有6XHis tag及c-myc tag,利于纯化和检测鉴定。ZHB-2cF9单链抗体采用大肠杆菌周质空间的可溶性表达，纯化采用高渗透法提取细胞周质蛋 白，再利用镍柱亲和层析一步分离纯化获得纯度较高的目的蛋白。
[0074]采用质粒小提试剂盒从菌体TGl中提取出含有编码单链抗体ZHB_2cF9基因的质粒(记为2cF9-pHEN2)，用于转化非抑制子大肠杆菌HB2151，转化采用氯化钙法制备和转化感受态大肠杆菌HB2151(J.萨姆布鲁克.分子克隆实验指南.第三版.科学出版社.2002.P96)，所得转化后菌株记为HB2151-2cF9。
[0075]HB2151-2cF9在2YT-AG培养基中，37°C培养至对数期时(OD6tltl=0.8)，加入终浓度ImM的IPTG，30°C诱导过夜(16~20h)，表达可溶性单链抗体ZHB_2cF9。6000rpm，4°C离心15min，收集菌体，高渗溶液(50mM Tris-HCl，20%蔗糖，ImM EDTA, pH8.0)重悬菌体，缓慢搅拌lh，4°C，1000Og离心lOmin，倒出上清进行镍柱亲和层析(购自GE)，纯化步骤按照GE的标准操作流程进行，即采用含有5mM咪唑的平衡缓冲液(Tris50mM，NaC1500mM，pH7.5)平衡ImL镍柱，10个柱体积后上样，再次采用含有5mM咪唑的平衡缓冲液洗涤镍柱上非特异性结合的杂蛋白，用含有50mM咪唑的平衡缓冲液洗涤非特异性杂蛋白，最后用含有IOOmM咪唑的平衡缓冲液洗脱目的蛋白。15%SDS-PAGE检测收集的样品，Western Blot进一步鉴定单链抗体，一抗为抗c-myc鼠抗(购自恩晶生物),二抗为兔抗鼠-HRP抗体。图4A显示纯化后样品中含有目的蛋白大小条带(箭头所指)，Western Blot (图4B)鉴定结果与SDS-PAGE —致，表明经过镍柱一步亲和层析ZHB-2cF9单链抗体得到了较好的纯化。
[0076]实施例4抗⑶26单链抗体与⑶26胞外区蛋白结合的Immunoblot鉴定[0077]该实验目的是为了验证筛选获得的抗⑶26单链抗体ZHB_2cF9与⑶26胞外区蛋白的特异性结合作用。重组⑶26胞外区蛋白进行SDS-PAGE电泳，半干转法lh，将蛋白转印到NC膜(购自Millipore);转印结束，将膜在5%MPBS中室温封闭Ih ;用5%MPBS稀释ZHB-2cF9单链抗体至I μ g/mL,室温孵育lh，TBS洗涤3遍；用鼠anti_Myc抗体(购自恩晶生物)室温孵育lh，TBS洗涤3遍；用兔抗鼠-HRP 二抗孵育Ih后凝胶成像仪(ImageQuantLAS4000, GE)曝光，结果如图5所示，在⑶26胞外区目的蛋白大小处有明显条带，表明抗⑶26单链抗体ZHB-2cF9可以特异性与⑶26胞外区蛋白结合。
[0078]实施例5可溶性单链抗体ZHB_2cF9与人间皮瘤细胞NC1-H2452的免疫荧光
[0079]CD26在人间皮瘤细胞NC1-H2452细胞表面高表达(Inamoto et al.(2007)ClinCancer Res, 13，4191-200)，本实验通过鉴定ZHB_2cF9与NC1-H2452细胞的免疫荧光结合情况，进一步验证筛选获得的单链抗体ZHB-2cF9可以与高表达⑶26的NC1-H2452细胞特异性结合，同时证明ZHB-2cF9可以与细胞表面的CD26特异性结合。
[0080]将人间皮瘤细胞NC1-H2452消化，离心后重悬，I X IO5/孔包被24孔板让细胞贴壁12h，4%多聚甲醛固定，PBS洗3次，5%MPBS室温封闭lh。PBS洗3次，不同孔分别加入抗体ZHB-2cF9或阴性对照抗体IgG (鼠)(购自life technology)，37°C孵育2h，以PBS洗涤3次，ZHB-2cF9抗体孔加入鼠抗myc-FITC抗体(购自Sigma-Aldrich),对照抗体孔加入羊抗鼠荧光二抗(购自life technology)，37°C孵育lh，PBS洗涤3次，荧光显微镜(Olympus)观察并拍照，结果如图6所示ZHB-2cF9单链抗体与NC1-H2452有明显的荧光显色，而对照抗体无明显荧光显色，表明筛选获得的单链抗体ZHB-2cF9可以与高表达⑶26的NC1-H2452细胞特异性结合，进一步证明ZHB-2cF9可以与细胞表面的CD26特异性结合。
[0081]实施例6抗⑶26单 链抗体对人间皮瘤细胞NC1-H2452的粘附抑制作用
[0082]⑶26通过与细胞外基质蛋白(ECM)的结合，介导肿瘤细胞的粘附作用，纤连蛋白是常见的ECM之一，CD26与纤连蛋白发生特异性结合作用，从而介导细胞的粘附，而这种结合作用可被抗 CD26 抗体所阻断(Inamoto et al.(2007)Clin Cancer Res, 13，4191-200)，从而阻断肿瘤细胞的粘附作用。
[0083]YSllO为Y’s Therapeutics公司开发的抗0)26单克隆鼠抗的人源化抗体，目前已开展抗⑶26高表达肿瘤的临床实验。根据YSllO抗体的重链及轻链可变区基因序列(CN101282994)，全合成构建YSllO的单链抗体型式，即scFv-YSllO作为本实验的阳性对照，表达及纯化过程同ZHB-2cF9。
[0084]粘附实验采用24孔板，五组平行实验，每组4个复孔，其中一组为空白对照组(Blank),直接用2%BSA封闭，其余四组用10 μ g/mL纤连蛋白(购自BD Biosciences)室温20 ~25°C包被 90min。PBS 洗 3 次后加入 2%BSA37°C封闭 Ih。同时将 10 X IO5 个 NC1-H2452细胞用PBS洗3次后分成等量的五组，三组为抗体试验组，细胞分别用含50 μ g/mL的ZHB-2cF9，阳性对照scFv-YSllO，阴性对照抗体IgG (鼠)的RPM1-1640培养基处理2h，另外两组为对照组(Binding组，Blank组)用与试验组含等量PBS的RPM1-1640培养基处理2h后，等分加入五组封闭后的24孔板中，培养箱继续培养12h。用PBS洗孔3次，洗掉未粘附的细胞，每孔加入270 μ L RPM1-1640及30 μ L的CCK-8 (购自同仁化学研究所)，37°C继续培养30min，在酶标仪450nm波长处测定光吸收值(0D值)，OD值的大小与活细胞数量成正比，据此计算细胞的粘附率。细胞粘附率(％)=[0D (抗体试验组)-OD (Blank组)]/[0D(Binding组)-OD (Blank组)]。图7显示，用scFv-YSllO及ZHB_2cF9处理后的细胞对纤连蛋白的粘附下降，而阴性对照抗体IgG (鼠)则不影响细胞粘附，表明ZHB-2cF9可以抑制CD26对ECM的结合，抑制CD26介导的肿瘤细胞粘附效应，抑制了肿瘤细胞的向其他器官的
侵袭转移。
[0085]实施例7抗⑶26单链抗体对人间皮瘤细胞NC1-H2452的增殖抑制作用
[0086]将NC1-H2452细胞I X IO4/孔接种96孔细胞培养板，100 μ L/孔，培养12h后用1%小牛血清培养基(含作用抗体)替换原培养基。将培养的细胞分为三组，分别对应加入的作用抗体为:不同浓度的单链抗体ZHB-2cF9，阳性对照scFv-YSllO及阴性对照抗体IgG(鼠)。作用抗体终浓度分组为0，0.1, 1.0, 10 μ g/mL,每组5个实验复孔。培养箱继续培养48h，观察细胞生长状况后每孔加入10 μ L的CCK-8 (购自同仁化学研究所)，37°C继续培养30min，在酶标仪450nm波长处测定光吸收值(OD值)，OD值的大小与活细胞数量成正比，据此计算单链抗体ZHB-2cF9对细胞增殖的抑制率。如图8所示，ZHB-2cF9及阳性对照scFv-YSllO对NC1-H2452均有明显抑制作用，且呈浓度依赖性，ZHB-2cF9与阳性对照的活性相当，阴性对照IgG对NC1-H2452没有明显抑制作用，表明ZHB_2cF9可以对高表达⑶26的间皮瘤细胞增殖有抑制作用，可用作⑶26高表达肿瘤的潜在治疗药物，且相比于阳性对照scFv-YSllO，ZHB-pA12为全人源化抗体，消除了外源蛋白对人体免疫系统的影响。
[0087]实施例8抗⑶26单链抗体对人结肠癌细胞HCTl 16的增殖抑制作用
[0088]除人间皮瘤细胞NC1-H2452外，高表达CD26的结肠癌细胞系HCT116 (Abe etal.(2011)BMC Cancer, 2011，11:51)也被用于考察单链抗体对细胞的增殖抑制效果。
[0089]将HCTl 16细胞8 X IO4/孔接种96孔细胞培养板，100 μ L/孔，培养12h后用1%小牛血清培养基(含作用抗体)替换原培养基。将培养的细胞分为三组，分别对应加入的作用抗体为:不同浓度的单链抗体ZHB-2cF9，阳性对照scFv-YSllO及阴性对照抗体IgG (鼠)。作用抗体终浓度分组为0，0.1, 1.0, 10 μ g/mL,每组5个实验复孔。培养箱继续培养48h，观察细胞生长状况后每孔加入10 μ L的CCK-8 (购自同仁化学研究所)，37°C继续培养30min，在酶标仪450nm波长处测定光吸收值(OD值)，OD值的大小与活细胞数量成正比，据此计算单链抗体ZHB-2cF9对细胞增殖的抑制率。如图9所示，ZHB_2cF9及阳性对照scFv-YSllO对HCT116均有明显抑制作用，且呈浓度依赖性，ZHB-2cF9与阳性对照的活性相当，阴性对照IgG对HCT116没有明显抑制作用，表明ZHB-2cF9可以对高表达⑶26的结肠癌细胞增殖有抑制作用，再次证明ZHB-2cF9可用作⑶26高表达肿瘤的潜在治疗药物，且相比于阳性对照scFv-YSllO，ZHB-pA12为全人源化抗体，消除了外源蛋白对人体免疫系统的影响。
【权利要求】
1.一种抗CD26抗体或其片段，其特征在于，所述抗体或其片段特异性结合人CD26，所述抗体或其片段的氨基酸序列包括选自含有SEQ ID NO: 2,SEQ ID NO: 3,SEQ ID NO: 4,SEQID N0:6、SEQ ID NO:7,SEQ ID N0:8—组序列的6个互补决定区的任何区域的单克隆抗体或其片段或其片段的偶联物，或通过对其氨基酸置换或者修饰得到的氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的抗CD26抗体或其片段，其特征在于，所述抗体或其片段的重链可变区的氨基酸序列含有如SEQ ID NO:2,SEQ ID N0:3和SEQ ID NO:4所示的互补决定区，和/或所述抗体或其片段的轻链可变区的氨基酸序列含有如SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7和SEQ ID N0:8所示的互补决定区。
3.如权利要求1所述的抗CD26抗体或其片段，其特征在于，所述抗体或其片段的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述抗体或其片段的轻链可变区的氨基酸序列如 SEQ ID NO:5 所示。
4.一种抗⑶26的单链抗体,其特征在于,所述单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO: 11所示。
5.一种编码如权利要求4所述的单链抗体的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列如SEQ ID NO: 10所示。
6.一种含有如权利要求5所述的核苷酸序列的表达载体。
7.一种含有如权利要求6所述表达载体的重组宿主菌。
8.—种生产如权利要求4所述单链抗体的方法，包括: 1)在合适的条件下培养如权利要求7所述的重组宿主菌并表达抗体； 2)然后从宿主菌中纯化、收集抗体。
9.如权利要求1至3中任一项所述的抗体或其片段在制备抑制CD26高表达的肿瘤细胞增殖或侵袭转移的药物中的新用途。
10.如权利要求4所述的单链抗体在制备抑制CD26高表达的肿瘤细胞增殖及侵袭转移的药物中的新用途。
【文档编号】C12N1/21GK103709251SQ201310704444
【公开日】2014年4月9日 申请日期:2013年12月19日 优先权日:2013年12月19日
【发明者】马永, 周雅琼, 高云霞, 黄粱敏, 徐春林, 陈晨, 王耀方 申请人:江苏众红生物工程创药研究院有限公司, 常州京森生物医药研究所有限公司