一种根管-根尖周复合体体外模型的制作方法
【专利摘要】本发明的目的在于提供一种根管-根尖周复合体体外模型。该复合体体外模型的离体牙与活体情况一致，LB固体培养基（可加入各种生物相关的成分）模拟根尖周组织。本发明所述的复合体体外模型无根管外感染来源；能模拟与活体相同的根管自然状态下的感染—感染根管；能观察感染向根尖周侵袭的情况；能观察临床操作对感染向根尖周侵袭的影响；能观察根尖周抗菌物质（免疫物质）对感染根管向根尖周入侵的影响。
【专利说明】一种根管-根尖周复合体体外模型
【技术领域】
[0001]本发明属于根管和根尖周模型领域；更具体地，本发明涉及一种根管-根尖周复合体体外模型。
【背景技术】 [0002]细菌是根尖周炎的主要致病因素。有学者认为根管内的细菌以生物膜的形式存在，在未接受治疗时，细菌不易穿出根尖孔，而是其毒力因子穿出根尖孔导致的根尖周炎。也有学者提出在环境因素的诱导下，根管生物膜中部分浮游菌可穿过根尖孔和牙本质小管侵入根尖周组织形成根尖生物膜。除了细菌对根尖周组织的直接入侵外，根管内细菌的毒力因子如内毒素等也可进入根尖周组织引起根尖周组织的破坏。综合目前的研究，感染根管内的微生物可以进入根尖周形成根尖生物膜。但形成根尖生物膜的微生物是随机的自主的进入，还是受到诸如根管治疗等的刺激后才进入根尖周尚无定论。换言之，在未治疗的情况下，感染根管生物膜导致根尖周病变是细菌进入根尖周组织分泌毒力因子导致的为主，还是根管内细菌的毒力因子进入根尖周引起的为主，抑或二者共同作用还不明了，亦无相关文献报道。
[0003]从病理学的角度可以把根管与根尖周看作一个整体，即:在牙周健康的情况下，根尖周病原刺激物主要来源于根管，而根管一旦受到感染，几乎不可避免的会导致根尖周的炎症。
[0004]许多研究涉及到根尖周炎模型的建立。Perters利用牛牙建立了感染根管模型
[I]。杨卫东[2]则用Beagle犬前牙建立感染根管模型，观察了超声治疗与常规治疗对根管内细菌的影响。郭慧杰、孙拓祺等[3，4]分别用离体双尖牙建立了体外粪肠球菌感染根管模型，用于观察感染根管粪肠球菌定植情况，以及评价激光对生物膜的作用情况。庄沛林等
[5]则将离体牙制成牙本质片，在其上建立粪肠球菌感染根管模型，用以研究无机纳米抗菌剂对生物膜的作用。刘桂香[6]等用离体上颌前磨牙检测了超声冲洗对根管内毒素的灭活和清除效果。以上研究成果表明人工建立感染根管模型是成立的。
[0005]目前对感染根管及根尖周的感染(病变)只能分开研究。对感染根管的研究主要有以下几种方法:(I)经典方法是根管内插入纸尖取材，对细菌及其毒素进行研究；(2)在离体牙根管内接种细菌进行研究；(3)将牙本质制作成磨片，接种细菌进行研究；(4)动物实验:利用狗等动物制作感染根管。对根尖周感染(病变)的研究为拔除患牙对根尖周取材后进行研究或者通过根尖外科手术取材进行研究。
[0006]基于此，本发明提出了根管-根尖周复合体概念，并建立了根管-根尖周复合体体外模型。
【发明内容】
[0007]针对上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种根管-根尖周复合体体外模型。该复合体体外模型可以用于研究感染根管形成根尖周炎的途径和影响因素。[0008]为实现上述目的，本发明采取如下措施:
[0009]本发明所述根管-根尖周复合体体外模型，由如下步骤建立而成:
[0010](I)取因正畸被拔除掉的单根前磨牙，用刮匙和超声洁治器去除牙根表面的软组织和牙石，置于2.5~3.0moI/L的甲醛溶液中，20~30°C保存备用，得离体牙(I)；
[0011](2)取玻璃瓶，玻璃瓶由瓶身(2)和橡皮塞(3)组成，根据离体牙颈部的直径在橡皮塞(3)中心挖孔，将离体牙(I)经孔套入橡皮塞(3)中，离体牙(I)和橡皮塞(3)的接口处采用光固化的流动树脂封闭，将瓶身(2)和固定有离体牙(I)的橡皮塞(3)在温度110~125°C、压力10~20MPa下进行灭菌处理，直至灭菌合格；
[0012](3)在超 净工作台中，向经灭菌处理合格的瓶身(2)中注入无菌LB固体培养基(4);然后将固定有离体牙(I)的橡皮塞(3)用无菌封口胶与瓶身(2)紧密相连，所述LB固体培养基(4)刚好到达离体牙(I)牙根的三分之一处；在离体牙(I)和橡皮塞(3)的接口处涂布两层指甲油，即得根管-根尖周复合体体外模型。
[0013]在上述根管-根尖周复合体体外模型的建立中，所述步骤(3)中还包括待LB固体培养基(4)凝固后，将与离体牙(I)牙根接触的一个面的培养基(4)挖除部分，将带软管(5)的针头(6)穿过固定有离体牙(I)的橡皮塞(3)，使针头(6)到达到培养基(4)被挖除的部分，采用橡皮塞(7)封闭软管(5)的开口，其中所述带软管(5)的针头(6)和橡皮塞(7)使用之前在温度110~125°C、压力10~20MPa下进行灭菌处理，直至灭菌合格；在针头(6)和橡皮塞(3)的接口处涂布两层指甲油。所述带软管(5)的针头(6)可以在复合体体外模型建立后，方便外界向LB固体培养基(4)中添加药物，观察根尖周抗菌物质(免疫物质)对感染根管向根尖周入侵的影响。
[0014]本发明将根管-根尖周看做一个整体，建立了根管-根尖周复合体体外模型,其中离体牙与活体情况一致，LB固体培养基(可加入各种生物相关的成分)模拟根尖周组织。所述复合体体外模型可通过对离体牙进行各种处理(如开髓、拔髓、根管预备上2/3、根管预备全长、向根管内接种各种细菌)，研究感染根管形成根尖周炎的途径、临床操作对感染向根尖周扩散的影响等。
[0015]本发明的有益效果在于:
[0016](I)所述复合体体外模型无根管外感染来源；
[0017](2)所述复合体体外模型能模拟与活体相同的根管自然状态下的感染一感染根管；
[0018](3)所述复合体体外模型能观察感染向根尖周侵袭的情况；
[0019](4)所述复合体体外模型能对离体牙根管进行与临床相同的操作，观察治疗对感染向根尖周侵袭的影响；
[0020](5)所述复合体体外模型进一步能观察根尖周抗菌物质(免疫物质)对感染根管向根尖周入侵的影响。
【专利附图】
【附图说明】
[0021]图1是根管-根尖周复合体体外模型的结构示意图。
[0022]图2是实施例3根尖区样本PCR扩增产物电泳图。
[0023]图3是实施例4根管内样本PCR扩增产物电泳图。[0024]图4是实施例5根尖区样本PCR扩增产物电泳图。
[0025]图5是实施例6建模后I天根尖区样本PCR扩增产物电泳图。
[0026]图6是实施例6根管预备后即刻根尖区样本PCR扩增产物电泳图。
[0027]图7是实施例6根管预备后7天根尖区样本PCR扩增产物电泳图。
[0028]图8是实施例6根管预备后14天根尖区样本PCR扩增产物电泳图。
[0029]图9是实施例6根管预备后21天根尖区样本PCR扩增产物电泳图。
[0030]图10是对感染根管进行全长预备后21天，离体牙根尖外表面的SM图。
[0031]图11是对感染根管进行超出根尖孔Imm预备后21天，离体牙根尖外表面的SEM图。
【具体实施方式】
[0032]下面结合【具体实施方式】对本发明的
【发明内容】
作进一步的详细描述。应理解，本发明的实施例只用于说明本发明而非限制本发明，在不脱离本发明技术思想的情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段，做出的各种替换和变更，均应包括在本发明的范围内。
[0033]实施例1根管-根尖周复合体体外模型的建立
[0034](1)取因正畸被拔除掉的单根前磨牙，用刮匙和超声洁治器去除牙根表面的软组织和牙石，置于2.5~3.0moI/L甲醛溶液中，20~30°C保存备用，得离体牙(I)；
[0035](2)取多个青霉素瓶，青霉素瓶由瓶身(2)和橡皮塞(3)组成，根据离体牙颈部的直径在橡皮塞(3 )中心挖孔，将离体牙(I)经孔套入橡皮塞(3 )中，离体牙(I)和橡皮塞(3 )的接口处采用光固化的流动树脂封闭，将瓶身(2)、固定有离体牙(I)的橡皮塞(3)和在温度110~125°C、压力10~20MPa下进行灭菌处理；
[0036]随机抽取经过高温高压灭菌的2个固定有离体牙(I)的橡皮塞(3)和瓶身(2)放置于盛有无菌LB液体培养基的试管中，37°C孵箱中培养48h,48h后若培养基保持透明，证明灭菌合格，若培养基出现浑浊，说明灭菌不合格，则需重新进行灭菌。
[0037](3)在超净工作台中，向经灭菌合格的瓶身(2)中注入无菌LB固体培养基(4);然后将固定有离体牙(I)的橡皮塞(3)用无菌封口胶与瓶身(2)紧密相连，所述LB固体培养基(4)刚好到达离体牙(I)牙根的三分之一处，在离体牙(I)和橡皮塞(3 )的接口处涂布两层指甲油，即得根管-根尖周复合体体外模型。
[0038]实施例2根管-根尖周复合体体外模型的建立
[0039](I)取因正畸被拔除掉的单根前磨牙，用刮匙和超声洁治器去除牙根表面的软组织和牙石，置于2.5~3.0moI/L甲醛溶液中，20~30°C保存备用，得离体牙(I)；
[0040](2)取多个青霉素瓶，青霉素瓶由瓶身(2)和橡皮塞(3)组成，根据离体牙颈部的直径在橡皮塞(3 )中心挖孔，将离体牙(I)经孔套入橡皮塞(3 )中，离体牙(I)和橡皮塞(3 )的接口处采用光固化的流动树脂封闭，将瓶身(2)、固定有离体牙(I)的橡皮塞(3)在温度110~125°C、压力10~20MPa下进行灭菌处理；
[0041]随机抽取经过高温高压灭菌的2个固定有离体牙(I)的橡皮塞(3)和瓶身(2)放置于盛有无菌LB液体培养基的试管中，37°C孵箱中培养48h,48h后若培养基保持透明，证明灭菌合格，若培养基出现浑浊，说明灭菌不合格，则需重新进行灭菌。
[0042](3)在超净工作台中，向经灭菌处理合格后的瓶身(2)中注入无菌LB固体培养基(4);待培养基(4)凝固后将欲与离体牙(I)牙根接触的一个面的培养基挖除部分；然后将固定有离体牙(I)的橡皮塞(3 )用无菌封口胶与瓶身(2 )紧密相连，所述LB固体培养基(4)刚好到达离体牙(I)牙根的三分之一处，将带软管(5)的针头(6)穿过固定有离体牙(I)的橡皮塞(3)，使针头(6)到达培养基(4)被挖除的部分，采用橡皮塞(7)封闭软管(5)的开口；在离体牙(I)和橡皮塞(3 )的接口处涂布两层指甲油，在针头(6 )和橡皮塞(3 )的接口处涂布两层指甲油，即得根管-根尖周复合体体外模型；其中所述带软管(5)的针头(6)和橡皮塞(7)使用之前在温度110~125°C、压力10~20MPa下进行灭菌处理，随机抽取经过高温高压灭菌的2个带软管(5)的针头(6)和橡皮塞(7)放置于盛有无菌LB液体培养基的试管中，37°C孵箱中培养48h,48h后若培养基保持透明，证明灭菌合格,若培养基出现浑浊，说明灭菌不合格，则需重新进行灭菌。
[0043]本实施例建立的复合体体外模型的结构示意图如图1所示。
[0044]所述带软管(5)的针头(6)可以在复合体体外模型建立后，方便外界向LB固体培养基(4)中添加药物。
[0045]实施例3模拟无根管外感染来源
[0046]将实施例1或2建立的复合体体外模型15个，于第I天随机抽取5个模型检测根尖周组织细菌。若检测到细菌则说明模型制备不成功，重新制作模型；若未检测到细菌，则将余下的10个模型自然放置于空气中，不做任何处理，第21天检测根尖周细菌。同时设置2个阳性对照组:将盛有培养基的青霉素小瓶直接暴露于空气中。用聚合酶联反应(PCR，引物为细菌共有的16SrDNA通用引物:上游:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' ;下游:5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'，片段长度约为1500bp，由上海生工生物工程公司合成。)检测各组有无细菌存在，结果如图2所示，图2为根尖区样本PCR扩增产物电泳图(1.Marker ；
2.阳性对照组；3.双蒸水空白对照组，双蒸水代替模板；4-7.建模后I天部分模型根尖区样本；8-11.建模后21天部分模型根尖区样本)。由图2可知，实验组LB固体培养基(4)中无细菌存在，表明本发明建立的复合体体外模型根尖周无根管外感染来源。
[0047]实施例4模拟与活体相同的根管自然状态下的感染一感染根管
[0048]将实施例1或2建立的复合体体外模型10个，将模型中的离体牙(I)开髓，开放离体牙(I)的根管，暴露于空气中21天，作为实验组，用聚合酶联反应(PCR)检测根管内有无细菌存在，结果如图3所示，图3为根管内样本PCR扩增产物电泳图(1.Marker ；2.阳性对照组，同实施例3 ;3.双蒸水空白对照组，双蒸水代替模板；4-9.平行实验组)。由图3可知，实验组根管内有细菌存在，表明感染根管建立成功。
[0049]实施例5观察感染向根尖周侵袭的情况
[0050]将实施例1或2建立的复合体体外模型25个，于第I天随机抽取对照组5个模型检测根尖周组织细菌。若检测到细菌则说明模型制备不成功，重新制作模型；若未检测到细菌，则将余下的20个模型分为对照组及实验组，每组各10个模型，实验组做开髓处理，对照组不做任何处理，自然放置于空气中，第21天检测实验组、对照组根尖周细菌(聚合酶联反应PCR)及内毒素(终点显色法)。细菌检测结果如图4所示，图4为根尖区样本PCR扩增产物电泳图(1.Marker ；2.阳性对照组，同实施例3 ；3.双蒸水空白对照组，双蒸水代替模板；4-7.部分对照组根尖区样本；8-11部分实验组根尖区样本)。由图4可知，实验组LB固体培养基(4)中无细菌，表明在未对根管做处理时，根管内的细菌不易由感染根管向根尖周入侵。
[0051]对照组和实验组根尖周的内毒素含量检测结果如表1所示。实验组的内毒素含量为10.525EU/mL，高于基线水平，表明在本发明建立的复合体体外模型中，细菌毒素可由感染根管向根尖周扩散。内毒素是革兰阴性细菌的主要毒力因子，是公认的炎症启动因子，可导致组织溶解和骨质吸收，在根尖周病发生发展中具有重要地位。有研究显示内毒素具有很强的渗透性，容易通过根尖孔进入尖周组织，且微小浓度的内毒素即可对根尖周组织产生明显的损害并导致根尖周的骨破坏。因此即使细菌没有进入根尖周，感染根管同样可以导致根尖周组织病变的发生发展。
[0052]表1实施例5根尖周内毒素含量
【权利要求】
1.一种根管-根尖周复合体体外模型，其特征在于，由如下步骤建立而成: (I)取因正畸被拔除掉的单根前磨牙，用刮匙和超声洁治器去除牙根表面的软组织和牙石，置于2.5~3.0moI/L的甲醛溶液中，20~30°C保存备用，得离体牙(I)； (2 )取玻璃瓶，玻璃瓶由瓶身(2 )和橡皮塞(3 )组成，根据离体牙颈部的直径在橡皮塞(3 )中心挖孔，将离体牙(I)经孔套入橡皮塞(3 )中，离体牙(I)和橡皮塞(3 )的接口处采用光固化的流动树脂封闭，将瓶身(2)和固定有离体牙(I)的橡皮塞(3)在温度110~125°C、压力10~20MPa下进行灭菌处理，直至灭菌合格； (3 )在超净工作台中，向经灭菌处理合格的瓶身(2 )中注入无菌LB固体培养基(4 );然后将固定有离体牙(I)的橡皮塞(3)用无菌封口胶与瓶身(2)紧密相连，所述LB固体培养基(4)刚好到达离体牙(I)牙根的三分之一处；在离体牙(I)和橡皮塞(3 )的接口处涂布两层指甲油，即得根管-根尖周复合体体外模型。
2.根据权利要求1所述的根管-根尖周复合体体外模型，其特征在于:所述步骤(3)中还包括待LB固体培养基(4)凝固后，将与离体牙(I)牙根接触的一个面的培养基(4)挖除部分，将带软管(5)的针头(6)穿过固定有离体牙(I)的橡皮塞(3)，使针头(6)到达到培养基(4)被挖除的部分，采用橡皮塞(7)封闭软管(5)的开口，其中所述带软管(5)的针头(6)和橡皮塞(7)使用之前在温度110~125°C、压力10~20MPa下进行灭菌处理，直至灭菌合格；在针头(6 )和橡皮塞(3 )`的接口处涂布两层指甲油。
【文档编号】C12M1/00GK103710256SQ201310737665
【公开日】2014年4月9日 申请日期:2013年12月27日 优先权日:2013年12月27日
【发明者】钟晓波, 何斌, 王容, 骆书美, 赵洁, 曹祥莉 申请人:重庆医科大学附属口腔医院