一种用于甲状腺乳头状癌早期诊断的试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于甲状腺乳头状癌早期诊断的试剂盒，引物序列：TP53INP1?Sense:5’-CTTAACAATGTTCCAGAGGCTGAAT-3’Antisense:5’-AGGGTGCTCAGT?AGGTGACTCTT-3’；TP53INP2Sense:5’-:5’-GGTCCGTGTTGCACCTAA-3’；Antisense:5’-TTGGATCCCACCATGGAGGGCGC-3’AXIN2Sense:5’-5’-CACGGAAACTGTTGACAGTGGATAC-3’；Antisense:5’-GGTGGCTGGTGC?AAAGACATAG-3’；GAPDH?Sense:5’-GCACCGTC?AAGGCTGAGAAC-3’；Antisense:5’-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3’；本发明所述的试剂盒具有高敏感性和高特异性；可以作为甲状腺乳头状癌的筛检和早期诊断技术。
【专利说明】一种用于甲状腺乳头状癌早期诊断的试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明属于分子生物学范畴，特别涉及一种用于甲状腺乳头状癌早期诊断的试剂盒。
【背景技术】
[0002]目前，人类甲状腺癌是较常见的内分泌恶性肿瘤之一，近年来发病率逐年升高。平均发病年龄为50岁，以女性居多，其中甲状腺乳头状癌(papillary thyroidcarcinoma, PTC)的发病率最高，约占所有发病类型的80%。对甲状腺癌的诊断目前主要依靠甲状腺超声以及穿刺活检病理，虽然穿刺活检病理诊断甲状腺癌已经广泛应用于临床，但仍存在30%可疑或不确定是否为甲状腺癌的诊断结果，并且穿刺是一项有创检查，给患者带来较大痛苦。甲状腺癌一般以手术治疗，早期发现进行治疗的患者五年生存率能达95%，晚期发现的患者五年生存率降至59%，因此为提高甲状腺癌诊断的准确性和早期诊断率，有必要寻找一种创伤性小，灵敏度和特异度均较高的新的诊断方法。
[0003]基因组以及高通量基因芯片技术的应用使人们能够更快速全面地了解肿瘤发生发展过程中基因水平的变化。表达谱芯片技术最先应用于疾病的鉴别诊断，其广泛应用乳腺癌、弥漫性大B细胞淋巴瘤、结肠癌、肺癌、卵巢癌以及恶性黑色素瘤等的癌组织中差异基因表达研究，提供了大量的有意义的肿瘤分子标志物。而利用非侵入性检测手段发现肿瘤新的分子标志物已成为人们越来越关心的热点。Liew等学者提出所谓前哨原则(Sentinel Principle)，即外周血细胞存在独特的基因表达谱型，能反映人体组织稳定的(遗传)和动态的(环境和疾病的影响)的变化，外周血可以表达人体基因组80%以上的基因，其中包含组织特异性基因。这就提示我们可以通过检测外周血中表达谱芯片，可以筛选出具有诊断价值的基因，并用实时荧光定量RT-PCR诊断甲状腺癌。
`[0004]近年来，广泛应用于诊断及人群筛选的主要方法是受试者工作特性曲线分析(R0C分析)，美国生物统计百科全书中关于ROC分析的定义是:对于可能或将会存在混淆的两种条件或自然状态，需要试验者、专业诊断学工作者以及预测工作者作出精细判别，或者准确决策的一种定量方法。目前ROC分析已成为广泛应用于临床诊疗和人群筛检研究的一种统计方法。它结合灵敏度和特异度对诊断试验进行综合评价，根据曲线的形状和面积对诊断试验作定量分析，可选取最合适的截割点使试验的灵敏度和特异度达到最优。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是根据保守序列TP53INP1、TP53INP2和AXIN2基因设计了引物，提供一种特异性强，敏感性高，一种用于甲状腺乳头状癌早期诊断的试剂盒及检测方法和应用。
[0006]本发明提供的用于甲状腺乳头状癌早期诊断的试剂盒的引物序列:
[0007]TP53INP1
[0008]Sense: 5 ’ -CTTAACAATGTTCCAGAGGCTGAAT-3 ’[0009]Antisense:5’-AGGGTGCTCAGT AGGTGACTCTT-3’
[0010]TP53INP2
[0011 ] Sense:5 ’ -: 5 ’ -GGTCCGTGTTGCACCTAA-3，
[0012]Antisense:5’ -TTGGATCCCACCATGGAGGGCGC-3’
[0013]AXIN2
[0014]Sense:5 ’ -5 ’ -CACGGAAACTGTTGACAGTGGATAC-3，
[0015]Antisense:5’ -GGTGGCTGGTGC AAAGACATAG-3’
[0016]GAPDH[0017]Sense:5，-GCACCGTC AAGGCTGAGAAC-3，
[0018]Antisense:5，-TGGTGA AGACGCCAGTGGA-3’
[0019]用于甲状腺乳头状癌早期诊断的试剂盒的检测方法包括以下步骤:
[0020]A、常规方法提取待检样品RNA ;
[0021 ] B、将待检样品RNA反转录成cDNA ；
[0022]C、将上述引物分别与PCR混合液加入PCR反应管中混合后加入待检样品cDNA ；
[0023]D、放入荧光PCR检测仪中进行反应；
[0024]E、有扩增曲线且待检样品经过标准品定量后得出的数值符合判断阈值为阳性，否则为阴性；
[0025]步骤C所述的引物终浓度均为0.4 μ M，步骤C所述的PCR混合液包括:SYBR?Premix Ex Taq?II (Tli RNaseH Plus) (2XConc.)和 ROX Reference Dye (50XCone.)或 ROX Reference Dye II (50XCone.) ；SYBR? Premix Ex Taq?II (Tli RNaseH Plus)(2XCone.)内含 TaKaRa Ex Taq HS, dNTP Mixture, Mg2+，Tli RNaseH,SYBR? Green I等，ROX Reference Dye (50XCone.)或 ROX Reference Dye II (50XCone.)只使用在Life Technologies等公司的Real Time PCR扩增仪上，用以校正孔与孔之间产生的荧光信号误差。Applied Biosystems 7300 Real-Time PCR System 和 StepOnePlusTM 使用 ROXReference Dye, 7500 Real-Time PCR System 和 7500 Fast Real-Time PCR System 使用ROX Reference Dye II。Thermal Cycler Dice Real Time System I1、LightCvCler?/ Li ghtCyc I er?.480 System (Roche Diagnostics)或 CFX96?Real-Time PCR DetectionSystem(Bio-Rad)等Real Time PCR扩增仪不必使用。待检测样品cDNA溶液占总反应液的8% ；
[0026]步骤0按第一阶段951:、308，1个循环；第二个阶段951:、208，601:、208，各45个循环；
[0027]在第二阶段延伸时即60°C、20s，收集荧光信号观察扩增曲线，记录Ct值，采用比较阈值法，即目的基因的量=2—，进行基于表达量的计算；
[0028]本发明甲状腺乳头状癌早期诊断的试剂盒进行相对定量的标准品为ΗΕΚ293细胞cDNA ；
[0029]相对定量的标准品为HEK293细胞cDNA的浓度6.25ng/ μ I。
[0030]用于甲状腺乳头状癌早期诊断的试剂盒它包括:
[0031 ] 溶液1:浓度10 μ M弓丨物SEQ IDN0.1和浓度10 μ M弓丨物SEQ IDN0.2的1:1混合液；[0032]溶液2:浓度10 μ M弓丨物SEQ IDN0.3和浓度10 μ M弓丨物SEQ IDN0.4的1:1混合液；
[0033]溶液3:浓度10 μ M弓丨物SEQ IDN0.5和浓度10 μ M弓丨物SEQ IDN0.6的1:1混合液；
[0034]溶液4:浓度10 μ M弓丨物SEQ IDN0.7和浓度10 μ M弓丨物SEQ IDN0.8的1:1混合液；
[0035]溶液5:PCR混合液。 [0036]所述的试剂盒还包括浓度为6.25ng/ μ I的ΗΕΚ293细胞cDNA作为实时荧光相对定量标准品。
[0037]所述的混合液是由SYBR?Premix Ex Taq?II (Tli RNaseH Plus) (2XCone.)和ROX Reference Dye (50XCone.)或 ROX Reference Dye II (50XCone.)按 25:1 比例配制的。
[0038]甲状腺乳头状癌早期诊断的试剂盒的使用方法:
[0039]A、将所述溶液1:2μ 1、溶液5:13μ UddH2O:8 μ I加入PCR反应管内混合后，加入待检样品cDNA溶液，加入量为2 μ I ;
[0040]B、将所述溶液2:2 μ 1、溶液5:13 μ l、ddH20:8 μ I加入PCR反应管内混合后，加入待检样品cDNA溶液，加入量为2 μ I ;
[0041]C、将所述溶液3:2 μ 1、溶液2:13 μ l、ddH20:8 μ I加入PCR反应管内混合后，加入待检样品cDNA溶液，加入量为2 μ I ;
[0042]D、将所述溶液4:2 μ 1、溶液2:13 μ l、ddH20:8μ I加入PCR反应管内混合后，加入标准品ΗΕΚ293细胞cDNA溶液，加入量为2 μ I ;
[0043]Ε、将所述溶液4:2 μ 1、溶液2:13 μ l、ddH20:8μ I加入PCR反应管内混合后，分别加入待检样品cDNA溶液、标准品HEK293细胞cDNA溶液，加入量为2 μ I ;
[0044]F、将加好样品的荧光PCR反应管按顺序放入荧光PCR检测仪中，按第一阶段95°C、30s, I个循环；第二个阶段95°C、20S，6(TC、2()S，各45个循环；设定反应条件；将E步骤设定为内参；
[0045]G、在第二阶段延伸时即60°C、20s，收集荧光信号观察扩增曲线，记录Ct值，采用比较阈值法，即目的基因的量=2_ΛΛετ，进行基于表达量的计算；
[0046]H、以ΗΕΚ293细胞内GAPDH的表达量为标准值对待检样品ΤΡ53ΙΝΡ1、ΤΡ53ΙΝΡ2和ΑΧΙΝ2的表达进行相对定量，得出表达数值，并根据试剂盒给出的判断方法及范围进行判断。
[0047]判定标准:
[0048]1、判定标准的获取:利用甲状腺乳头状癌患者和正常人的外周血样本中的总RNA进行荧光定量PCR检测，并使用ΗΕΚ293细胞内GAPDH的表达量作为标准，得到样本中本文前述3个基因标志物的相对表达量，用一种基因标志物的相对表达量或两种的比值进行ROC分析，得到灵敏度，特异度，曲线下面积和截断点，即诊断阈值，，选择灵敏度、特异度和曲线下面积均较高的基因及组合作为判断标准，最终得出表1三个检测指标及标准。该指标ROC曲线见附图1、2、3。由附图1、2、3可见，该模型ROC曲线的AUC分别为0.959，0.991和0.970，该模型具有较高的分类正确率(阳性符合率)[0049]表1
[0050]
【权利要求】
1.一种用于甲状腺乳头状癌早期诊断的试剂盒，它包括:引物如序列表SEQ IDN0.1,SEQ IDN0.2, SEQ IDN0.3, SEQ IDN0.4, SEQ IDN0.5, SEQ IDN0.6, SEQ IDN0.7和 SEQ IDN0.8所示。
2.根据权利要求1所述的一种用于甲状腺乳头状癌早期诊断的试剂盒，其特征在于，它包括: 溶液1:浓度10 μ M引物SEQ IDN0.1和浓度10 μ M引物SEQ IDN0.2的1:1混合液； 溶液2:浓度10 μ M引物SEQ IDN0.3和浓度10 μ M引物SEQ IDN0.4的1:1混合液； 溶液3:浓度10 μ M引物SEQ IDN0.5和浓度10 μ M引物SEQ IDN0.6的1:1混合液； 溶液4:浓度10 μ M引物SEQ IDN0.7和浓度10 μ M引物SEQ IDN0.8的1:1混合液； 溶液5 =PCR混合液。
3.根据权利要求2所述的一种用于甲状腺乳头状癌早期诊断的试剂盒，其特征在于:所述的混合液是由SYBR1? Premix Ex Taq?II(Tli RNaseH Plus) (2XCone.)和 ROXReference Dye (50XCone.)或 ROX Reference Dye II (50XCone.)按 25:1 比例配制的。
4.根据权利要求1、2或3所述的一种用于甲状腺乳头状癌早期诊断的试剂盒，其特征在于:它包括浓度为6.25ng/ μ I的ΗΕΚ293细胞cDNA作为实时荧光定量标准品。
5.根据权利要求1所述的试剂盒在制备检测甲状腺乳头状癌早期诊断中的应用。
【文档编号】C12Q1/68GK103710459SQ201410017058
【公开日】2014年4月9日 申请日期:2014年1月15日 优先权日:2014年1月15日
【发明者】刘晓冬, 李文兴, 贺梦子, 杨淑娟, 马淑梅 申请人:吉林大学