绵羊多核绒毛膜滋养层细胞的培养技术的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种绵羊多核绒毛膜滋养层细胞的培养技术，具体包括以下步骤：(1)进行多核滋养层细胞原代培养；(2)进行多核滋养层细胞的传代培养；(3)针对上述制备细胞进行检测分析，包括：(3a)H·E染色：①胎盘子叶组织切片H·E染色；②滋养层细胞爬片H·E染色；(3b)免疫组织化学：①胎盘子叶免疫组织化学检测；②滋养层细胞爬片免疫组织化学检测；(3c)透射电镜法检测。本发明技术能够成功培养多核的绵羊绒毛膜滋养层细胞，细胞形态明显，大多是双核、多核细胞，且细胞核大而圆。该发明中的滋养层细胞能为类似关于该领域体外细胞的实验提供细胞基础，可以为推动妊娠滋养细胞疾病的诊断和治疗提供良好的实验基础。
【专利说明】绵羊多核域毛膜滋养层细胞的培养技术
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种绵羊多核绒毛膜滋养层细胞的培养技术，属于细胞培养【技术领域】。
【背景技术】
[0002]本发明从取材及分离培养方法两方面对国内外培养绵羊绒毛膜滋养层细胞进行了改进。在取材方面，先前学者的取材部位是胎盘绒毛膜比较容易得到，而本发明在基于大量国内外文献的基础上发现，该细胞主要分布于胎盘子叶与肉阜的接触部位和子叶中，因而取材定位于此；在分离培养方面，先前学者要么是用组织块培养法要么是单一的酶消化法，而本发明则是通过胰蛋白酶和胶原酶两步消化分离培养绵羊多核绒毛膜滋养层细胞。
[0003]通过胰蛋白酶和胶原酶的配合使用，建立了可以分离培养绵羊多核绒毛膜滋养层细胞的两步消化法。胰蛋白酶能选择性地消化溶解变性蛋白质，对未变性的蛋白质无作用，因此，对活细胞的蛋白质以及有活性的消化酶不起作用。胰蛋白酶可以使细胞间的蛋白质水解从而将细胞离散。胶原酶仅对细胞间质有消化作用，而对上皮细胞影响不大。因此适于消化分离纤维性组织、上皮组织，可使上皮细胞与胶原成分分离而不受损害。该组织内含部分结缔组织或胶原成分，用胰蛋白酶单独解离细胞的实际效果较差，又因为绒毛膜滋养层细胞存在贴壁生长接触抑制的特点，所以可采用胰蛋白酶和胶原蛋白酶共同处理，使其细胞分散开来，利于其分裂生长。在此方法的指导下，获得了较高纯度的具有生物学活性的多核绵羊绒毛膜滋养层细胞。
[0004]绵羊绒毛膜滋养层细胞是构成胎盘屏障的主要组织结构，而胎盘是妊娠期间具有物质交换与代谢，分泌激素和防御等功能的重要器官。滋养层细胞在胚胎的植入过程中扮演重要角色，其增殖和功能调节异常与多种胎盘发育相关疾病的发生发展有着密切关系。绵羊胎盘绒毛膜滋养层细胞可分细胞滋养层细胞和合体滋养层细胞，多核滋养层细胞均存在于合体滋养层，而合体滋养层细胞位于母胎界面，大部分位于胎盘子叶中其功能主要是转运营养物质、进行气体交换、分泌多`种激素，并保护胎儿免受母体免疫系统的损伤。因此多核滋养层细胞的培养是进行这些相关实验的基础，也将为推动妊娠滋养细胞疾病的诊断和治疗提供良好的实验基础。
[0005]组织和细胞离体后独立生存在人工的培养环境中，虽然模拟体内环境，仍有很大差异。因而利用培养细胞做实验时，不应视为体内细胞完全相同，把实验结果推测体内，轻易做出与体内等同的结论。
[0006]基于以上实验技术的缺点，本发明目的是寻求和建立一种可行的体外培养多核绵羊绒毛膜滋养层细胞的方法，可为体内实验做铺垫。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是为了实现绵羊多核滋养层细胞的培养，提供的一种比较容易和使用体外培养方法。[0008]为了实现上述目的，本发明的技术方案如下。
[0009]一种绵羊多核绒毛膜滋养层细胞的培养技术，具体包括以下步骤:
[0010](I)进行多核滋养层细胞原代培养，具体过程为:
[0011](Ia)将新鲜的妊娠中期的绵羊胎盘用自来水冲洗一次，再用75%的酒精清洗3~5次，然后将其拿到经过消毒杀菌的操作间，而后取材。
[0012](Ib)使用高压过的手术器械，用手术剪将子宫壁剪开并将其打开，注意不要将羊膜与绒毛膜弄破。由于绵羊的胎盘属于子叶型胎盘且属于母包子型，所以绒毛膜滋养层所在部位为绒毛膜相嵌在肉阜内的部位，即为子叶。 [0013](Ic)使用另一套手术器械，将子叶小心地放在已经配好的含有高浓度双抗(PS)的PBS中，反复洗2~3次。
[0014](Id)另外取5子叶用4%的多聚甲醛和2.5%的戊二醛固定，以备后面做石蜡切片和透射电镜标本。
[0015](If)倾去PBS，用高压好的眼科剪将子叶快速的剪成糊状，准备培养细胞。
[0016](Ig)用0.25%的胰蛋白酶37°C恒浴消化糊状组织30min，消化期间每隔5min振荡混匀一次，将上层不含组织的悬液转移至一个无菌的15ml离心管中。
[0017](Ih)用胶原酶IV37°C恒浴消化组织30min，消化期间每隔5min振荡混匀一次。
[0018](Ii)两次消化下来的细胞经过100目细胞筛子过滤，滤液细胞1200rpm离心5min。
[0019](Ij)弃去上清液，将细胞用含20%胎牛血清的DMEM完全培养基吹打起来，在涡旋振荡器上振荡混匀，注意振荡不要太剧烈，以免破环细胞。
[0020](Ik)将细胞接种在25cm2的培养瓶中，每瓶加3ml完全培养基，放入CO2孵化箱中，控制条件温度37°C，CO2浓度5.0%。
[0021](11)每3d换一次完全培养液，当原代细胞贴壁为培养瓶壁的90%左右时(约需9d),进行传代。
[0022](2)进行多核滋养层细胞的传代培养，具体步骤为:
[0023](2a)首次传代吸去瓶中的培养液，用PBS溶液洗培养瓶3次，弃去PBS。
[0024](2b)加入0.25%胰蛋白酶消化细胞，放在37°C培养箱中消化2min，轻轻敲细胞培养瓶，显微镜下观察贴壁细胞是否脱落。
[0025](2c)贴壁细胞是有90%以上脱壁时，用含血清的培养基终止消化1200rpm离心5min,弃上清。
[0026](2d)加入Iml完全培养基制成单细胞悬液，将细胞悬液按1: 2进行传代并做标记Pl代，放入CO2孵化箱中培养，控制条件温度37°C，CO2浓度5.0%。
[0027](2e)待细胞再次长满培养瓶时进行二次传代，方法与首次传代一样，以此做法待细胞传代三次后，制作滋养层细胞爬片，以备鉴定。
[0028](3)针对上述制备细胞进行检测分析，具体为:
[0029](3a) H.E染色，具体包括:
[0030]①胎盘子叶组织切片H -E染色:将固定好的子叶经过自来水洗、梯度酒精脱水、二甲苯透明、浸蜡、石蜡包埋。切片4 μ m，脱蜡、水化，HE染色。染色完成后中性树胶封片，显微观察并照相。染色时需注意把握好盐酸酒精的分化时间，过长与过短细胞核都难以区分。[0031]②滋养层细胞爬片H.E染色:待传代2次的滋养层细胞长满经多聚赖氨酸处理过的盖玻片时，将玻片用PBS液洗3次。950mL/L的乙醇固定20min后，PBS洗2次，每次Imin0苏木素染色15min,自来水洗2min,盐酸酒精分化4s,伊红染色I~2min。然后经脱水、透明后中性树胶封片，显微观察并照相。[0032](3b)免疫组织化学，包括:
[0033]①胎盘子叶免疫组织化学检测:石蜡切片经自来水洗、二甲苯脱蜡和梯度酒精水化到蒸馏水后，PBS洗2次，每次5min ;滴加30mL/L的H2O2,消除其内源性过氧化物酶的活性。PBS洗2次，每次5min，进行抗原修复，在煮沸后的柠檬酸钠抗原修复液中高热微博修复15min,自然冷却至室温。PBS洗2次,每次5min,滴加适当比例(I: 300)稀释的一抗(CK7)，4°C孵育过夜。然后将切片放在37°C温箱内孵育lh，PBS洗2次，每次5min，滴加即用型MaxVisionTM试剂，室温下孵育20min。PBS洗2次，每次5min，滴加新鲜配制的DAB溶液，显微镜下观察3~5min。最后核复染，中性树胶封片，显微镜下观察并拍照。阴性对照试验用PBS代替一抗染色步骤同上。
[0034]②滋养层细胞爬片免疫组织化学检测:取对数生长期的滋养层细胞，消化制成单细胞悬液，接种于预先放置有盖玻片的培养液中待细胞接近长成单层后，取出盖玻片PBS液漂洗3次，4%多聚甲醛固定15min。PBS液冲洗3次，每张滴加50 μ 13% H2O2，室温下孵育lOmin，以阻断其内源性过氧化物酶的活性。冲洗3次，除去PBS液，每张滴加50 μ I鼠抗羊CK7，4°C过夜。PBS液冲洗3次，除去PBS液，每张滴加50 μ I即用型MaxVisionTM试剂室温下孵育15min。PBS液冲洗3次，除去PBS液，每张滴加100 μ I新配制DAB溶液，显微镜下观察3-5min。自来水冲洗，经过梯度乙醇脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封固，显微镜下观察并拍照。阴性对照试验用代替一抗染色步骤同上。
[0035](3c)透射电镜法检测:
[0036]将传代3次的长满细胞培养瓶壁的滋养层细胞用细胞刮子刮下来，用PBS液洗2次，把细胞收集到15ml离心管中，2000g/min，离心lOmin，将细胞离心成团。弃上清，用
2.5%的戊二醛固定液预固定Ih以上，将预固定的的细胞2000g/min，离心lOmin。弃上清，用PBS液洗2次，离心2次，每次1600rpm离心5min。将配好的2 %的琼脂水溶液保持在50~55°C之间，并将上述离心细胞温浴至50°C。用热吸管吸取热琼脂2ml到细胞团中，迅速吹打均匀，立即4000rpm，离心5min。待琼脂凝固后取出，放入2.5%的戊二醛固定液中静置，放入4°C冰箱中备用。将经过2.5%戊二醛固定液固定好的绵羊子叶组织块，修成适合制作电镜标本比例大小的组织块。然后用10mg/L四氧化锇再固定，丙酮逐级脱水，Epon812包埋，超薄切片光学定位并切片，醋酸铀及枸橼酸双重染色，透射电镜观察滋养层细胞超微结构并照相。
[0037]该发明的有益效果在于:本发明技术能够成功培养多核的绵羊绒毛膜滋养层细胞细胞，细胞形态明显，大多是双核、多核细胞，且细胞核大而圆。该发明中的滋养层细胞能为类似关于该领域体外细胞的实验提供细胞基础，可以为推动妊娠滋养细胞疾病的诊断和治疗提供良好的实验基础。
【专利附图】
【附图说明】
[0038]图1是本发明实施例中滋养层细胞爬片图。[0039]图2是本发明实施例中第二代滋养层细胞爬片图。
[0040]图3是本发明实施例中胎盘子叶石蜡切片经HE染色后图。
[0041]图4是本发明实施例中滋养层细胞石蜡切片经HE染色后图。
[0042]图5是本发明实施例中滋养层细胞爬片I经H.E染色后图。
[0043]图6是本发明实施例中滋养层细胞爬片2经H.E染色后图。
[0044]图7是本发明实施例中胎盘子叶的免疫组织I化学染色图
[0045]图8是本发明实施例中胎盘子叶的免疫组织2化学染色图。
[0046]图9是本发明实施例中滋养层细胞爬片I的免疫组织化学染色图。
[0047]图10是本发明实施例中滋养层细胞爬片2的免疫组织化学染色图。
[0048]图11是本发明实施例中滋养层细胞爬片3的免疫组织化学染色图。
[0049]图12是本发明实施例中滋养层细胞I超微结构透射电镜图(7000倍)。
[0050]图13是本发明实施例中滋养层细胞I超微结构透射电镜图(4000倍)。[0051]图14是本发明实施例中滋养层细胞2超微结构透射电镜图(7000倍)。
[0052]图15是本发明实施例中滋养层细胞2超微结构透射电镜图(9000倍)。
【具体实施方式】
[0053]下面结合附图对本发明的【具体实施方式】进行描述，以便更好的理解本发明。
[0054]实施例
[0055]本发明为了实现绵羊多核滋养层细胞的培养，提供的一种比较容易和使用体外培养方法。具体实施例如下:
[0056]1、创建细胞培养所需要的试验环境，具体包括:
[0057](I)无菌实验室:实验室人员要按要求穿着清洁自身，严禁与实验无关人员入内；
(2)超净工作台:尽量使工作台里边的空间足够充分；(3)CO2恒温培养箱:实验前应检查培养箱确保培养箱各种指标正常且无菌；(4)高、低速离心机；(5)倒置荧光显微镜(配成像系统)；(6)小型数字型恒温水浴锅；(7)-20°C低温冰箱、_80°C超低温冰箱。
[0058]2、准备细胞培养所需要的试剂及液体:⑴磷酸盐缓冲液(PhosphateBuffered Saline, PBS) (2)胎牛血清(Fetal Bovine Serum, FBS) ； (3)高糖培养基(DMEM/HIGH GLUCOSE) ；(4)0.25 % 胰蛋白酶(trypsin-EDTA, TE) ; (5)4 型胶原酶(Type IV Collagenase) ； (6)青链霉素混合液(Penicillin-Streptomycin),简称双抗:[+] 10000Units/ml Penicillin, [+] 10000 μ g/ml Streptomycin ; (7) 4 % 多聚甲醒(4 %Paraformaldehyde) ； (8)迈新柠檬酸钠抗体稀释液；(9) 一抗:细胞角蛋白7 (CK7) ,二抗:迈新即用型MaxVisionTM试剂；(10)细胞完全培养基:含20 %的胎牛血清FBS，80 %高糖DMEM，1%双抗，混合均匀；(11)细胞冻存液:胎牛血清FBS、完全培养基、二甲基亚砜DMSO按5: 4:1比例混合均匀。
[0059]3、进行多核滋养层细胞原代培养，具体过程为:
[0060](3a)将新鲜的妊娠中期的绵羊胎盘用自来水冲洗一次，再用75%的酒精清洗3~5次，然后将其拿到经过消毒杀菌的操作间，而后取材。
[0061](3b)使用高压过的手术器械，用手术剪将子宫壁剪开并将其打开，注意不要将羊膜与绒毛膜弄破。由于绵羊的胎盘属于子叶型胎盘且属于母包子型，所以绒毛膜滋养层所在部位为绒毛膜相嵌在肉阜内的部位，即为子叶。
[0062](3c)使用另一套手术器械，将子叶小心地放在已经配好的含有高浓度双抗(PS)的PBS中，反复洗2~3次。
[0063](3d)另外取5子叶用4%的多聚甲醛和2.5%的戊二醛固定，以备后面做石蜡切片和透射电镜标本。
[0064](3f)倾去PBS，用高压好的眼科剪将子叶快速的剪成糊状，准备培养细胞。
[0065](3g)用0.25%的胰蛋白酶37°C恒浴消化糊状组织30min，消化期间每隔5min振荡混匀一次，将上层不含组织的悬液转移至一个无菌的15ml离心管中。
[0066](3h)用胶原酶IV37°C恒浴消化组织30min，消化期间每隔5min振荡混匀一次。
[0067](3i)两次消化下来的细胞经过100目细胞筛子过滤，滤液细胞1200rpm离心5min。
[0068](3j)弃去上清液，将细胞用含20%胎牛血清的DMEM完全培养基吹打起来，在涡旋振荡器上振荡混匀，注意振荡不要太剧烈，以免破环细胞。
[0069](3k)将细胞接种在25cm2的培养瓶中，每瓶加3ml完全培养基，放入CO2孵化箱中，控制条件温度37°C，CO2浓度5.0%。
[0070](31)每3d换一次完全培养液，当原代细胞贴壁为培养瓶壁的90%左右时(约需9d),进行传代。
[0071]4、进行多核滋养层细胞的传代培养，具体步骤包括:
[0072](4a)首次传代吸去瓶中的培养`液，用PBS溶液洗培养瓶3次，弃去PBS。
[0073](4b)加入0.25%胰蛋白酶消化细胞，放在37°C培养箱中消化2min，轻轻敲细胞培养瓶，显微镜下观察贴壁细胞是否脱落。
[0074](4c)贴壁细胞是有90%以上脱壁时，用含血清的培养基终止消化1200rpm离心5min,弃上清。
[0075](4d)加入Iml完全培养基制成单细胞悬液，将细胞悬液按1: 2进行传代并做标记Pl代，放入CO2孵化箱中培养，控制条件温度37°C，CO2浓度5.0%。
[0076](4e)待细胞再次长满培养瓶时进行二次传代，方法与首次传代一样，以此做法待细胞传代三次后，制作滋养层细胞爬片，以备鉴定。
[0077]图1中，滋养层细胞为贴壁细胞，呈上皮样生长，细胞形态呈多角形，核大呈卵圆形。图2中，当滋养层细胞传到第2代时，细胞间相互融合形成双核滋养层细胞、多核合胞体。如图1、图2所示，在倒置相差显微镜下，滋养层细胞为典型的上皮样细胞且呈铺展状，箭头所指为双核及多核滋养层细胞.。
[0078]5、针对上述制备细胞进行检测分析,具体包括:
[0079](5a) H.E染色，具体包括:
[0080]①胎盘子叶组织切片H -E染色:将固定好的子叶经过自来水洗、梯度酒精脱水、二甲苯透明、浸蜡、石蜡包埋。切片4 μ m，脱蜡、水化，HE染色。染色完成后中性树胶封片，显微观察并照相。染色时需注意把握好盐酸酒精的分化时间，过长与过短细胞核都难以区分。
[0081]②滋养层细胞爬片H.E染色:待传代2次的滋养层细胞长满经多聚赖氨酸处理过的盖玻片时，将玻片用PBS液洗3次。950mL/L的乙醇固定20min后，PBS洗2次，每次Imin0苏木素染色15min,自来水洗2min,盐酸酒精分化4s,伊红染色I~2min。然后经脱水、透明后中性树胶封片，显微观察并照相。
[0082]图3中，胎盘子叶石蜡切片经HE染色后，可看到绒毛膜合胞体滋养层；图4中，滋养层细胞大多是双核、多核细胞，且细胞核大而圆。图5、图6中，滋养层细胞爬片经H.Ε染色后清晰的看到双核及多核细胞，细胞呈平铺状且为多边形。
[0083](5b)免疫组织化学，包括:
[0084]①胎盘子叶免疫组织化学检测:石蜡切片经自来水洗、二甲苯脱蜡和梯度酒精水化到蒸馏水后，PBS洗2次，每次5min ;滴加30mL/L的H2O2,消除其内源性过氧化物酶的活性。PBS洗2次，每次5min，进行抗原修复，在煮沸后的柠檬酸钠抗原修复液中高热微博修复15min,自然冷却至室温。PBS洗2次,每次5min,滴加适当比例(I: 300)稀释的一抗(CK7)，4°C孵育过夜。然后将切片放在37°C温箱内孵育lh，PBS洗2次，每次5min，滴加即用型MaxVisionTM试剂，室温下孵育20min。PBS洗2次，每次5min，滴加新鲜配制的DAB溶液，显微镜下观察3~5min。最后核复染，中性树胶封片，显微镜下观察并拍照。阴性对照试验用PBS代替一抗染色步骤同上。
[0085]②滋养层细胞爬片免疫组织化学检测:取对数生长期的滋养层细胞，消化制成单细胞悬液，接种于预先放置有盖玻片的培养液中待细胞接近长成单层后，取出盖玻片PBS液漂洗3次，4%多聚甲醛固定15min。PBS液冲洗3次，每张滴加50 μ 13% H2O2，室温下孵育lOmin，以阻断其内源性过氧化物酶的活性。冲洗3次，除去PBS液，每张滴加50 μ I鼠抗羊CK7，4°C过夜。PBS液冲洗3次，除去PBS液，每张滴加50 μ I即用型MaxVisionTM试剂室温下孵育15min。PBS液冲洗3次，除去PBS液，每张滴加100 μ I新配制DAB溶液，显微镜下观察3-5min。自来水冲洗，经过梯度乙醇脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封固，显微镜下观察并拍照。阴性对照试验用代替一抗染色步骤同上。
[0086]由于培养的滋养层细胞是从胎盘子叶分离得到的，结合胎盘子叶组织与培养的滋养层细胞的细胞爬片免疫组织化学染色结果正好证明滋养层细胞的确来源于胎盘子叶。图
7、图8为胎盘子叶的免疫组织化学染色；图9、图10、图11为滋养层细胞爬片的免疫组织化学染色；深色区域为阳性信号区域，箭头所示为被染色的双核及多核细胞滋养层细胞.[0087](5c)透射电镜法检测:
[0088]将传代3次的长满细胞培养瓶壁的滋养层细胞用细胞刮子刮下来，用PBS液洗2次，把细胞收集到15ml离心管中，2000g/min，离心lOmin，将细胞离心成团。弃上清，用
2.5%的戊二醛固定液预固定Ih以上，将预固定的的细胞2000g/min，离心lOmin。弃上清，用PBS液洗2次，离心2次，每次1600rpm离心5min。将配好的2 %的琼脂水溶液保持在50~55°C之间，并将上述离心细胞温浴至50°C。用热吸管吸取热琼脂2ml到细胞团中，迅速吹打均匀，立即4000rpm，离心5min。待琼脂凝固后取出，放入2.5%的戊二醛固定液中静置，放入4°C冰箱中备用。将经过2.5%戊二醛固定液固定好的绵羊子叶组织块，修成适合制作电镜标本比例大小的组织块。然后用10mg/L四氧化锇再固定，丙酮逐级脱水，Epon812包埋，超薄切片光学定位并切片，醋酸铀及枸橼酸双重染色，透射电镜观察滋养层细胞超微结构并照相，不同倍数照片见图12、图13、图14、图15，从中可以看出，以单个或多个双核滋养层细胞为主。
[0089]以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本【技术领域】的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。`
【权利要求】
1.一种绵羊多核绒毛膜滋养层细胞的培养技术，其特征在于:具体包括以下步骤: (1)进行多核滋养层细胞原代培养，具体过程为: (Ia)将新鲜的妊娠中期的绵羊胎盘用自来水冲洗一次，再用75%的酒精清洗3~5次，然后将其拿到经过消毒杀菌的操作间取材； (Ib)使用高压过的手术器械，用手术剪将子宫壁剪开并将其打开，绵羊的胎盘属于子叶型胎盘且属于母包子型，绒毛膜滋养层所在部位为绒毛膜相嵌在肉阜内的部位，即为子叶； (Ic)使用另一套手术器械，将子叶小心地放在已经配好的含有高浓度双抗(PS)的PBS中，反复洗2~3次； (Id)另外取5子叶用4%的多聚甲醛和2.5%的戊二醛固定，以备后面做石蜡切片和透射电镜标本； (If)倾去PBS，用高压好的眼科剪将子叶快速的剪成糊状，准备培养细胞； (Ig)用0.25%的胰蛋白酶37°C恒浴消化糊状组织30min，消化期间每隔5min振荡混匀一次，将上层不含组织的悬液转移至一个无菌的15ml离心管中； (Ih)用胶原酶IV37°C恒 浴消化组织30min，消化期间每隔5min振荡混匀一次； (Ii)两次消化下来的细胞经过100目细胞筛子过滤,滤液细胞1200rpm离心5min ；(Ij)弃去上清液，将细胞用含20%胎牛血清的DMEM完全培养基吹打起来，在涡旋振荡器上振荡混匀； (Ik)将细胞接种在25cm2的培养瓶中，每瓶加3ml完全培养基，放入CO2孵化箱中，控制条件温度37°C，CO2浓度5.0% ; (11)每3d换一次完全培养液，当原代细胞贴壁为培养瓶壁的90%左右时，进行传代； (2)进行多核滋养层细胞的传代培养，具体步骤为: (2a)首次传代吸去瓶中的培养液，用PBS溶液洗培养瓶3次，弃去PBS ； (2b)加入0.25%胰蛋白酶消化细胞，放在37°C培养箱中消化2min，轻轻敲细胞培养瓶，显微镜下观察贴壁细胞是否脱落； (2c)贴壁细胞是有90%以上脱壁时，用含血清的培养基终止消化1200rpm离心5min，弃上清； (2d)加入Iml完全培养基制成单细胞悬液，将细胞悬液按1: 2进行传代并做标记Pl代，放入CO2孵化箱中培养，控制条件温度37°C，CO2浓度5.0% ; (2e)待细胞再次长满培养瓶时进行二次传代，方法与首次传代一样，以此做法待细胞传代三次后，制作滋养层细胞爬片，以备鉴定； (3)针对上述制备细胞进行检测分析，具体为: (3a)H*E染色，具体为: ①胎盘子叶组织切片H.Ε染色:将固定好的子叶经过自来水洗、梯度酒精脱水、二甲苯透明、浸蜡、石蜡包埋，切片4 μ m,脱蜡、水化，HE染色；染色完成后中性树胶封片，显微观察并照相； ②滋养层细胞爬片H.Ε染色:待传代2次的滋养层细胞长满经多聚赖氨酸处理过的盖玻片时，将玻片用PBS液洗3次，950mL/L的乙醇固定20min后，PBS洗2次，每次Imin ;苏木素染色15min,自来水洗2min,盐酸酒精分化4s,伊红染色I~2min ;然后经脱水、透明后中性树胶封片，显微观察并照相； (3b)免疫组织化学，包括: ①胎盘子叶免疫组织化学检测:石蜡切片经自来水洗、二甲苯脱蜡和梯度酒精水化到蒸馏水后，PBS洗2次，每次5min ;滴加30mL/L的H2O2,消除其内源性过氧化物酶的活性；PBS洗2次，每次5min，进行抗原修复，在煮沸后的柠檬酸钠抗原修复液中高热微博修复15min,自然冷却至室温；PBS洗2次,每次5min,滴加适当比例(I: 300)稀释的一抗(CK7)，4°C孵育过夜；然后将切片放在37°C温箱内孵育lh，PBS洗2次，每次5min，滴加即用型MaxVisionTM试剂，室温下孵育20min ；PBS洗2次，每次5min，滴加新鲜配制的DAB溶液，显微镜下观察3~5min ;最后核复染，中性树胶封片，显微镜下观察并拍照；阴性对照试验用PBS代替一抗染色步骤同上； ②滋养层细胞爬片免疫组织化学检测:取对数生长期的滋养层细胞，消化制成单细胞悬液，接种于预先放置有盖玻片的培养液中待细胞接近长成单层后，取出盖玻片PBS液漂洗3次，4%多聚甲醛固定15min ；PBS液冲洗3次，每张滴加50 μ 13% H2O2,室温下孵育IOmin,以阻断其内源性过氧化物酶的活性；冲洗3次，除去PBS液，每张滴加50 μ I鼠抗羊CK7，4°C过夜；PBS液冲洗3次，除去PBS液，每张滴加50 μ I即用型MaxVisionTM试剂室温下孵育15min ；PBS液冲洗3次，除去PBS液，每张滴加100 μ I新配制DAB溶液，显微镜下观察3-5min ;自来水冲洗，经过梯度乙醇脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封固，显微镜下观察并拍照；阴性对照试验用代替一抗染色步骤同上； (3c)透射电镜法检测: 将传代3次的长满细胞培养瓶壁的滋养层细胞用细胞刮子刮下来，用PBS液洗2次，把细胞收集到15ml离心管中，2000g/min,离心IOmin,将细胞离心成团；弃上清,用2.5%的戍二醛固定液预固定Ih以上，将预固定的细胞2000g/min，离心IOmin ;弃上清，用PBS液洗2次，离心2次，每次1600rpm离心5min ;将配好的2%的琼脂水溶液保持在50~55°C之间，并将上述离心细胞温浴至50°C ;用热吸管吸取热琼脂2ml到细胞团中，迅速吹打均匀，立即4000rpm，离心5min ;待琼脂凝固后取出，放入2.5 %的戊二醛固定液中静置，放入4°C冰箱中备用；将经过2.5%戊二醛固定液固定好的绵羊子叶组织块，修成适合制作电镜标本比例大小的组织块；然后用10mg/L四氧化锇再固定，丙酮逐级脱水，Epon812包埋，超薄切片光学定位并切片，醋酸铀及枸橼酸双重染色，透射电镜观察滋养层细胞超微结构并照相。
【文档编号】C12N5/073GK103740638SQ201410020722
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2014年1月17日 优先权日:2014年1月17日
【发明者】刘淑英, 王专家, 张宇飞, 刘慧
申请人:内蒙古农业大学