一种大豆小RNA基因gma-miR1507a及在盐碱调控中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种大豆小RNA基因gma-miR1507a及前体基因，它来自于大豆品种吉育72，将前体基因插入经改造的pCAMBIA1301载体中，获得pCAMBIA-bar-miR1507a载体质粒，将载体质粒转入农杆菌EHA105中，转染拟南芥中，实验结果表明，转基因拟南芥提高了植物的耐盐碱胁迫能力。
【专利说明】—种大豆小RNA基因gma-m i R1507a及在盐碱调控中的应用
【技术领域】
[0001]本发明属分子生物学领域，具体为大豆中一个小RNA基因gma_miR1507a及在盐碱调控中的应用。
【背景技术】
[0002]microRNA是目前广泛研究的一类内源性非编码小RNA分子，长度范围在19-29nt，平均长22nt，miRNA的转录调控参与真核生物发育的各个时期及过程，靶向调控动植物的多个代谢调控机制。miRNA的转录后调控与植物抗逆调控的关联十分密切，近年来研究发现，miRNA在逆境胁迫下可发生表达变化，通过miRNA的升高或降低表达，响应外界环境刺激。拟南芥中miR393，miR319及miR397，水稻miR393在干旱胁迫下发现表达水平上调。拟南芥的 miR396, miR167, miR319, miR159, miR394, miR156, miR171, miR158 和 miR393 在盐胁迫条件下表达上调。毛果杨中的miR1446、miR1444、miR1447、miR145等基因在水缺乏的条件下表达下调。另外毛果杨miR1446、miR1445、miR1447、miR530的在盐碱胁迫下表达下调。
[0003]很多保守miRNA在植物的生长发育中有重要作用，该作用主要通过对靶基因的调控实现。例如 miR156，miR159, miR164, miR165/166, miR167, miR169, miR171, miR172,miR319 及 miR396 的靶基因分别为转录因子 SPLs，ARFs, MYBs, TCPs, NACs, HD-ZIPs, NFYA,AP2-like factors, SCLs及GRFs等，转录因子作为植物发育的调控因子直接参与植物生长及抗逆应答等过程。根据Genevestigator数据库显示:在植物逆境应答过程中,某些保守的miRNA表达产生变化，靶基因表达水平也呈相关调整。在植物对逆境的胁迫应答过程中，miRNA通过对靶基因的调控，增强或改善植物对环境的适应性。
`[0004]大豆(Glycine max)作为世界上重要的粮食作物和油料作物。逆境胁迫严重危害大豆产量，通过大豆逆境胁迫下基因表达水平变化，挖掘大豆耐盐碱基因资源，通过基因工程手段培育耐盐碱作物，对提高大豆产量有现实意义。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种大豆中一个小RNA基因gma_miR1507a及其前体基因。
[0006]个小RNA基因gma_miR1507a如体基因，其喊基序列如序列表SEQ ID N0.1所不。
[0007]一个小RNA基因gma-miR1507a,其碱基序列如序列表SEQ ID N0.2所示。
[0008]一种小RNA基因gma_miR1507a的表达载体pCAMBIA-bar_miR1507a,它是由下述方法制备:
1)人工合成序列表SEQID N0.3所不的bar基因序列；
2)用XhoI 酶切 bar 基因序列和 pCAMBIA1301，将 bar 插入 pCAMBIA1301 (购自 pcambia公司)的两个XhoI酶切位点间，替换潮霉素抗性基因；
3)用HindIII和BstE II分步酶切质粒，Taq酶补平末端后，用T4连接酶连接平末端；最后，将克隆的两端带有EcoRI的35S启动子基因与EcoRI单酶切后的质粒连接，获得质粒pCAMBIA-bar ；
4)目的基因和pCAMBIA-bar用Bamm和历/?dIII双酶切，连接，得pCAMBIA-bar-miR1507a。
[0009]本发明又一个目的是一个小RNA基因gma_miR1507a在培育耐盐碱植物品种中的应用。
[0010]一种培育耐盐碱植物品种的方法，它包括:
1)将pCAMBIA-bar-miR1507a载体质粒转入到农杆菌EHA105感受态细胞中；
2)农杆菌转化至植物中。
[0011 ] 本发明提供了一种大豆中一个小RNA基因gma_miR1507a及前体基因，它来自于大豆品种吉育72，将前体基因插入经改造的pCAMBIA1301载体中，获得pCAMBIA-bar-miR1507a载体质粒，将载体质粒转入农杆菌EHA105中，转染拟南芥中，实验结果表明，转基因拟南芥提高了植物的耐盐碱胁迫能力。
【专利附图】
【附图说明】
[0012]图1吉育72大豆品种gma_miR1507a在逆境胁迫下基因表达分析图；
图2为gma-miR1507a前体基因克隆产物电泳图；
图3为pMD19-T simple-miRNA1507a质粒进行双酶切电泳图；
图4转miR1507a基因的拟南芥PCR鉴定图`；
图5转miR1507a基因拟南芥的高表达株系筛选；
图6为转基因拟南芥在各协迫条件下的发芽率照片，其中:A.空白对照；B.1OOmM NaCl胁迫条件下转基因拟南芥生长状况；C.7.5mM NaHCO3胁迫条件下转基因拟南芥生长状况；D.90mM NaCl+5mM NaHCO3胁迫条件下转基因拟南芥生长状况；E.7%PEG胁迫条件下转基因拟南芥生长状况；
图7为转基因拟南芥在各协迫条件下的发芽率柱状图；
图8转基因拟南芥4片叶龄时，各协迫条件下长势照片。
【具体实施方式】
[0013]实施例1 gma_miR1507a基因及其前体基因的获得
选吉育72(本验室保存)大豆品种，通过I X Hoagland培养液水培获得大豆幼苗，3天更换一次培养液，待幼苗长出两叶一心时，使用含有20mM NaCl的培养基胁迫处理。24小时后采集叶片，液氮中固定半小时后放入_80°C冰箱中保存。提取叶片总RNA，反转录为cDNA。
[0014]以反转录的cDNA 为模板，使用引物 gma-miR1507aF-2，gma_miR1507aR-2，扩增两端带有汉3ΜΠ和酶切位点的gma-miR1507a前体基因序列(见图2)。将含有gma_miR1507a前体序列构建重组质粒pMD19_T simple-miR1507a并进行测序验证。用限制性内切酶汉.ΗΙ和历/7dIII按照下列体系对pMD19-T simple-miR1507a进行双酶切，然后回收目的基因(见图3)。如体基因喊基序列如序列表SEQ ID N0.1所不。
【权利要求】
1.1v小RNA某因gmaniR1507a如体基因，其喊基序列如序列表SEQ ID N0.1所不。
2.一个小RNA基因gma-miR1507a，其碱基序列如序列表SEQ ID N0.2所示。
3.一种小RNA基因gma-miR1507a的表达载体pCAMBIA-bar_miR1507a，它是由下述方法制备: 1)人工合成序列表SEQID N0.3所不的bar基因序列； 2)用XhoI 酶切 bar 基因序列和 pCAMBIA1301，将 bar 插入 pCAMBIA1301 (购自 pcambia公司)的两个XhoI酶切位点间，替换潮霉素抗性基因； 3)用HindIII和BstE II分步酶切质粒，Taq酶补平末端后，用T4连接酶连接平末端；将克隆的两端带有EcoRI的35S启动子基因与EcoRI单酶切后的质粒连接，获得质粒pCAMBIA-bar ； 4)序列表SEQID N0.1所示的基因和pCAMBIA-bar用汉.ΗΙ和历双酶切，连接，得 pCAMBIA-bar-miR1507a。
4.权利要求1或2所述的一个小RNA基因gma-miR1507a在培育耐盐碱植物品种中的应用。
5.一种培育耐盐碱植物品种的方法，它包括: 1)将权利要求3所述的pCAMBIA-bar-miR1507a载体质粒转入到农杆菌EHA105感受态细胞中； 2)农杆菌转化至植物中。
【文档编号】C12N15/11GK103757016SQ201410020732
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2014年1月17日 优先权日:2013年9月27日
【发明者】李海燕, 董园园, 敬缓缓, 刘伟灿, 王南, 陈欢, 王法微, 周颖, 尹海龙, 周永刚, 赵利旦 申请人:吉林农业大学