一种大豆小RNA基因gma-miR1510a及在盐碱调控中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种大豆小RNA基因gma-miR1510a及前体基因，它来自于大豆品种吉育72，将前体基因插入经改造的pCAMBIA1301载体中，获得pCAMBIA-bar-miR1510a载体质粒，将载体质粒转入农杆菌EHA105中，转染拟南芥中，实验结果表明，转基因拟南芥提高了植物的耐盐碱胁迫能力。
【专利说明】—种大豆小RNA基因gma-m i R151 Oa及在盐碱调控中的应用
【技术领域】
[0001]本发明属生物【技术领域】，具体地说是大豆中一个小RNA基因gma_miR1510a及在盐碱调控中的应用。
【背景技术】
[0002]植物生长、发育及环境应答是一个复杂的生理过程，是一系列基因表达调控的结果。microRNA (miRNA)作为一类内源、非编码小分子单链RNA，广泛参与了拟南芥、水稻、玉米等植物的生长、发育等生理调控过程。甚至植物在逆境胁迫条件下，microRNA通过自身基因表达水平的变化实现对靶基因的剪切或翻译抑制，从而响应逆境胁迫。
[0003]大豆(Glycine max)是世界上重要的粮食作物和油料作物。大豆含油量可达18%至23 %左右。自然环境是限制农业生产的主要制约因素，盐碱、干旱等环境因素严重威胁了大豆的生长发育及产量。目前已经发现miR398等数个microRNA基因参与植物的抗逆调控机制。在植物逆境胁迫应答中，miRNA在转录后水平上与mRNA形成RISC复合体后，可实现对靶基因的降解或表达抑制。在拟南芥、水稻、玉米、杨树中已克隆到参与盐碱胁迫、磷硫缺乏、氧化、热等物理化学胁迫调控过程的miRNA基因，gma-miR394a、gma_miR482、gma-miR1512、gma-miR1515等基因均发现与逆境胁迫调控有关。miRNA作为靶基因的负调因子响应植物的逆境胁迫过程。[0004]大豆受逆境胁迫的miRNA表达变化及调控机制研究是增强大豆耐逆境胁迫的新研究热点。通过研究miRNA在大豆中盐碱、干旱等逆境调控的生理生化作用，观察逆境胁迫条件下特定microRNA的表达及作用机制，挖掘耐逆境胁迫基因资源，对培育抗逆境胁迫新品系大豆，提高农作物产量具有重要的社会价值及经济价值。因而借助基因表达分析筛选并挖掘抗逆相关miRNA基因，进行相关的表达调控及应用研究，为提培育优良性状农作物奠定基础。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种大豆小RNA基因gma_miR1510a及其前体基因。
[0006]个小RNA基因gma_miR1510a如体基因，其喊基序列如序列表SEQ ID N0.1所不。
[0007]一个小RNA基因gma-miR1510a,其碱基序列如序列表SEQ ID N0.2所示。
[0008]一种小RNA基因gma_miR1510a的表达载体pCAMBIA-bar_miR1507a,它是由下述方法制备:
1)人工合成序列表SEQID N0.3所不的bar基因序列；
2)用XhoI 酶切 bar 基因序列和 pCAMBIA1301，将 bar 插入 pCAMBIA1301 (购自 pcambia公司)的两个XhoI酶切位点间，替换潮霉素抗性基因；
3)用HindIII和BstE II分步酶切质粒，Taq酶补平末端后，用T4连接酶连接平末端；最后，将克隆的两端带有EcoRI的35S启动子基因与EcoRI单酶切后的质粒连接，获得质粒pCAMBIA-bar ；4)目的基因和pCAMBIA-bar用BanMi和历idIII双酶切，连接，得pCAMBIA-bar-miR1510a。
[0009]本发明又一个目的是一个小RNA基因gma_miR1510a在培育耐盐碱植物品种中的应用。
[0010]一种培育耐盐碱植物品种的方法，它包括:
1)将pCAMBIA-bar-miR1510a载体质粒转入到农杆菌EHA105感受态细胞中；
2)农杆菌转化至植物中。 [0011 ] 本发明提供了一种大豆中一个小RNA基因gma_miR1510a及前体基因，它来自于大豆品种吉育72，将前体基因插入经改造的pCAMBIA1301载体中，获得pCAMBIA-bar-miR1510a载体质粒，将载体质粒转入农杆菌EHA105中，转染拟南芥中，实验结果表明，转基因拟南芥提高了植物的耐盐碱胁迫能力。
【专利附图】
【附图说明】
[0012]图1不同胁迫条件下,大豆叶片中gma_miR1510a在不同时间段的表达分析；
图2 T1代转基因拟南芥PCR检测结果；
图3 T2代转基因拟南芥PCR检测结果；
图4盐碱条件下转基因拟南芥发芽率统计；A:200 mM NaCl处理；B:5 mM NaHCO3处理；C:5 mM NaHCO3+100 mM NaCl 处理；
图5盐碱条件下转基因拟南芥耐逆境胁迫表型分析；A:空白对照组；B:200 mM NaCl处理；C:5 mM NaHCO3 处理；D:5 mM NaHCO3 +100 mM NaCl 处理。
[0013]【具体实施方式】:
实施例1 gma-miR1510a基因的表达分析
(I)gma-1510基因的逆境胁迫下表达分析
吉育72品种(吉林省长春市新城大街2888号，吉林农业大学王振民老师提供)大豆置于I X Hoagland营养液中，暗培养2天后，置于组培室中光照(10 h/d)培养，每三天换一次营养液。等到大豆幼苗长出第二对叶片时，分别移入添加120 mM NaCl,50 mM NaHCO3^70 mMNaCl+50 mM NaHCO3>2 % PEG8000 的 I XHoagland 培养液中胁迫处理，分别采集 O h、l h、3h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h大豆叶片，液氮速冻后，置于-80 °C冰箱中保存备用。
[0014](2)总 RNA 提取
5种条件胁迫处理后，收集8个时间段的大豆叶片材料，使用TRizol分别提取大豆叶片组织总RNA，提取总RNA步骤如下:
1.取植物材料100mg,在液氮中研磨后加I ml Trizol,剧烈震荡混匀；
2.15-30 °C条件下放置5 min ；
3.每Iml Trizol里加入0.2 ml氯仿,剧烈振荡15 s后，室温放3 min ；
4.于12000 rpm, 4 V，离心15 min,取上层水相；
5.每Iml Trizol加0.5 ml异丙醇,轻轻混匀，室温静置10 min ；
6.于12000 rpm, 4 °C ,离心10 min,弃掉上清,保留沉淀；
7.加Iml 75 %乙醇，洗涤沉淀；
8.于7 500 rpm, 4 °C ,离心 5 min,弃上清；9.自然晾干5-10min ；
10.加入适量的DEPC水溶解样品。
[0015](3)总RNA的反转录
对提取好的Total RNA进行反转录，反转录试剂盒购置于百泰克生物技术公司(BioTeke super RT Kit),总反转录成cDNA步骤如下:
1.按下表配制反转录反应液1:
【权利要求】
1.1v小RNA某因gma_miR1510a如体基因，其喊基序列如序列表SEQ ID N0.1所不。
2.一个小RNA基因gma-miR1510a，其碱基序列如序列表SEQ ID N0.2所示。
3.一种小RNA基因gma_miR1510a的表达载体pCAMBIA-bar_miR1507a,它是由下述方法制备: .1)人工合成序列表SEQID N0.3所不的bar基因序列； .2)用XhoI 酶切 bar 基因序列和 pCAMBIA1301，将 bar 插入 pCAMBIA1301 (购自 pcambia公司)的两个XhoI酶切位点间，替换潮霉素抗性基因； .3)用HindIII和BstE II分步酶切质粒，Taq酶补平末端后，用T4连接酶连接平末端；最后，将克隆的两端带有EcoRI的35S启动子基因与EcoRI单酶切后的质粒连接，获得质粒pCAMBIA-bar ； .4)目的基因和pCAMBIA-bar用Bamm和历/?dIII双酶切，连接，得pCAMBIA-bar-miR1510a。
4.权利要求1或2所述的一个小RNA基因gma-miR1510a在培育耐盐碱植物品种中的应用。
5.一种培育耐盐碱植物品种的方法，它包括: .1)将pCAMBIA-bar-miR1510a载体质粒转入到农杆菌EHA105感受态细胞中； .2)农杆菌转化至植物 中。
【文档编号】C12N15/84GK103740725SQ201410020733
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2014年1月17日 优先权日:2013年9月27日
【发明者】李海燕, 董园园, 蔡佳轩, 刘伟灿, 王法微, 陈欢, 王南, 周颖, 尹海龙, 赵利旦, 周永刚 申请人:吉林农业大学