用于检测食品和饲料中貉成分的引物和探针的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于检测食品和饲料中貉成分的引物和探针，属于食品和饲料中动物源性成分的定性检测技术，本发明选取貉的线粒体细胞色素C氧化还原酶Ｉ亚单位基因序列，设计一组特异性引物和探针，使用该引物和探针，采用实时荧光PCR技术，可快速、灵敏、特异地检测食品和饲料中的貉成分。该引物和探针也可以试剂盒的形式和其他试剂一起提供，用于核酸扩增反应。该法操作简便、重复性好。
【专利说明】用于检测食品和饲料中貉成分的引物和探针
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种利用核酸扩增技术进行动物源性成分快速检测的方法，具体是一种貉成分的实时荧光PCR检测用的引物和探针序列。
【背景技术】
[0002]貉，别名称狸，在动物学分类上属哺乳纲，食肉目，犬科(Canidae)，貉属(.Nyctereutes)0主要分布于前苏联各国、中国、朝鲜、日本、蒙古、芬兰等国家，在我国几乎各省区均有分布。貉是一种珍贵的毛皮动物，貉皮属大毛细皮、具有坚韧耐磨、轻便柔软、美观保温等优点，是制作大衣、皮领、帽子和皮褥等裘皮制品的优质原料。貉的针毛和尾毛可用于制作高级化妆用毛刷、胡刷和毛笔等。貉可入药，其胆、睾丸是名贵中药材，貉油具有烫伤药用价值，也是开发化妆品的上等原料。貉经济价值高，且适应性较强，易于驯养繁殖，饲养管理较为简单，因此养貉业发展十分迅速，其养殖业已成分现代畜牧业的一个重要组成部分。目前人工养殖的貉，以黑龙江省的乌苏里貉为最多。
[0003]貉主要作为一种皮毛经济动物，养殖过程中有时需要添加激素类饲料，并且要定期注射一些抗生素药品，因此体内常残留超标的激素和抗生素，故貉肉不作为人类常用肉类供人食用。近年来，一些不法商贩，受利益驱动，低价收购未经检验检疫的貉肉，加工后冒充狗肉、羊肉，甚至制成肉卷、肉串、香肠等谋取暴利。这种制售假冒制品的行为，不仅可能危害人类健康，还涉及到宗教信仰问题，严重损害了消费者的利益。随着疯牛病和禽流感等疾病的流行和食品贸易的全球化，消费者迫切地要求知晓食品的确切成分，世界各国都制定了相应的标签制度，要求在食品标签中明确动物源性制品的种类和来源。此外，饲料安全也直接关乎食品安全， 包括我国在内的欧盟、美国等很多国家先后颁布多个法规，规定禁止在反刍动物饲料中使用、添加以哺乳类动物为原料的动物性饲料产品，以有效防止哺乳动物的病原体从动物传染到别的动物和人类。鉴于此，尽快建立可靠有效的貉成分检测方法，对于确保食品和饲料标签真实准确，加强食品和饲料标识管理，改进食品安全，保护消费者利益具有重要意义。
[0004]食品和饲料中动物源性成分检测，常采用DNA检测的方法。以DNA为测试对象的方法与以蛋白为测试对象的方法相比，在成分复杂的情况下，目标DNA可以有效提取，受基质的影响较小；此外，DNA比较稳定，不象蛋白质组成那样容易受到外界环境因素和加工工艺的影响。当前，基于DNA的检测方法中，实时荧光PCR法以其操作简便、灵敏、特异、快速、重复性好、定量准确、全封闭反应等优点，得到研究者的普遍认可，成为检测的重要工具。
【发明内容】
[0005]本发明要解决的技术问题是针对貉线粒体细胞色素C氧化还原酶I亚单位基因，设计一组特异性引物和探针，进而建立一种高灵敏度高特异性快速检测貉DNA方法，以克服基于蛋白的检测方法在某些食品和饲料检测中的局限性，为貉成分检测提供有效工具，从而确保食品和饲料标签的一致性，保护消费者利益。[0006]本发明的主要原理为:针对保守序列设计一组引物(上游引物:5’ -AATCTTGCCTGGGTTTGGAA -3’ 和下游引物:5’_ CAGTAAATATGTGGTGGGCTCACA _3’)和一条Taqman-MGB探针(序列为:5’- CATACTACTCCGGGAAAA -3’)。进行核酸检测时，模板DNA经加热至94-95°C—定时间后，DNA双链解离，引物及Taqman探针与模板特异性结合。探针的5端标记有报告荧光集团，3端有淬灭荧光集团。当探针完整的时候，报告集团所发射的荧光能量被淬灭集团吸收，仪器检测不到信号。随着PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中，遇到与模板结合的探针时，其3’ 一5’外切核酸酶活性就会将探针切断，报告集团远离淬灭集团，其能量不能被吸收，即产生荧光信号。随着PCR循环的增加，目的片段成指数增长，荧光信号也同步增强，荧光信号的强弱直接反映模板数量。
[0007]本发明涉及的貉成分实时荧光PCR检测用的引物和探针，其序列如下:
(1)上游引物:5’_AATCTTGCCTGGGTTTGGAA -3’ ；
(2)下游引物:5’-CAGTAAATATGTGGTGGGCTCACA -3’ ；
(3)TaqMan-MGB 探针:5’- CATACTACTCCGGGAAAA -3’ ；
在应用中，上游引物、下游引物、TaqMan探针的体积比为:1:1:1 ；
使用上述试剂盒检测食品中貉成分的方法，依次包括下列步骤(1) - (3):
(I)待检样品DNA的提取
DNA提取可采用普通酚 -氯仿抽提法或使用DNA提取试剂盒。
[0008](2)貉成分的实时荧光PCR扩增
A.在反应管中加入2XPCRMaster Mix 12.5 μ?，上游引物和下游引物各0.5-1 μ?,Taqman-MGB探针0.5-1 μ?, 100 ng/^L待测样品的DNA 1-2 μ?，补充双蒸水至25 μ?，混匀；
B.将PCR反应管放入荧光定量PCR仪，按下述反应条件完成PCR扩增:
94 - 950C 5 min, I个循环，预变性；
94 - 950C 10 - 20 sec ；60°C 40 — 60 sec, 40 个循环，PCR 扩增。
[0009]扩增时，应设立三个对照:阳性对照(取貉肉提取的基因组DNA)、阴性对照(非貉基因组DNA)、空白对照(不含DNA模板，可以水代替)。
[0010](3)应用荧光定量PCR仪随机软件，分析扩增结果。
[0011]如待测样品出现扩增曲线，且Ct值小于或等于36，阴性对照、阳性对照和空白对照结果都成立(即阳性样品出现典型阳性扩增曲线，阴性样品和空白对照无扩增)，则可判定该样品检出貉成分。
[0012]如待测样品未出现扩增曲线，无Ct值，阴性对照、阳性对照和空白对照都成立，则可判定该样品未检出貉成分。
[0013]如待测样品Ct值在36-40之间，应重作实时荧光PCR扩增。再次扩增后的结果Ct值仍小于40，且阴性对照、阳性对照和空白对照结果都成立，则可判定该样品检出貉成分；再次扩增后的结果为无扩增曲线无Ct值，且阴性对照、阳性对照和空白对照结果都成立，则可判定该样品未检出貉成分。
[0014]本发明根据貉线粒体细胞色素C氧化还原酶I亚单位基因的保守序列，设计了一组特异性引物和一条特异性Taqman-MGB探针。使用该引物和探针，采用实时荧光PCR技术，可检测含量低至0.00001%的貉DNA，绝对检测限为21 fg ;该组引物和探针特异性也很高，与包括同属犬科的貉属、狐属、犬属动物在内的其他近缘物种及非近缘物种没有交叉反应，特别适用于一些成分复杂的加工食品和饲料中貉成分的检测。
【专利附图】
【附图说明】
[0015]图1为用实时荧光PCR技术检测蓝狐、赤狐、银黑狐、十字狐、貉、水貂、贵妃犬、金毛猪犬、博美犬、京八犬、西施犬、雪纳瑞犬、可卡犬、泰迪犬、猫、牛、羊、猪、鸡、太平洋鳕鱼、驴、兔、鹿、玉米、大豆、大米DNA，上述样品的扩增图谱。
[0016]图2为空白对照(水)的扩增图谱。
[0017]图3为阳性对照(貉DNA )扩增图谱。
[0018]图4为用实时荧光PCR技术检测不同含量貉成分DNA溶液的扩增图谱。
[0019]图5为不同含量貉成分DNA溶液实时荧光PCR扩增的标准曲线。
[0020]图6为用实时荧光PCR技术检测某待测肉卷样品DNA，样品的扩增图谱。
[0021 ] 图7为阴性对照(狐狸DNA)的扩增图谱。
[0022]图8为空白对照(水)的扩增图谱。
[0023]图9为阳性对照(貉DNA )扩增图谱。
[0024]图10为用实时荧光PCR技术检测某待测饲料样品DNA，样品的扩增图谱。
[0025]图11为阴性对照(狐狸DNA)的扩增图谱。
[0026]图12为空白对照(水)的扩增图谱。
[0027]图13为阳性对照(貉DNA `)扩增图谱。
【具体实施方式】
[0028]下面结合实施例对本发明做进一步说明。
[0029]实施例1
(I)非貉样品DNA的提取
A.称取0.1 g样品，加至2 mL离心管中。加入600 μ?预热的CTAB裂解缓冲液和40μ L蛋白酶K，轻轻混匀后，65°C水浴保温90 min ；
B.2 000 g离心5 min，取上清于另一干净的2 mL离心管中，加入等体积的酚、三氯甲烷和异戊醇的混合液(25:24:1)，震荡混匀；
C.12 000 g离心10 min，取上清至干净的2 mL离心管中，加入等体积异丙醇，颠倒混
匀；
D.12 000 g离心10 min，弃去上清液，用预热至65°C的TE缓冲液溶解沉淀；
E.加入5 μ L RNA 酶溶液，37 °C 30 min ；
F.加入200μ L三氯甲烷:异戊醇(24:1 )，强烈振荡；
G.12 000 g离心10 min，取上清至干净的2 mL离心管中，加入等体积异丙醇，颠倒混
匀；
H.12 000 g离心10 min,弃去上清液，用4°C预冷的70%乙醇500 μ L，涡旋清洗沉淀；
1.12 000 g离心10 min，弃去上清液，倒置晾干后加100 μ? TE缓冲液溶解沉淀，-20°C保存备用。
[0030](2)非貉样品DNA的实时荧光PCR扩增:
A.在PCR反应管中加入如权利要求1所述的2XPCR Master Mix 12.5 μ?，上游引物和下游引物各0.5 μ?, Taqman探针0.5 μ?, 100 ng/^L非貉样品的DNA 2 μ?，补充双蒸水至25 μ?,混匀；
B.将PCR反应管放入荧光定量PCR仪，按下述反应条件完成PCR扩增:
95°C 2 min, I个循环，预变性；
950C 15 sec ；60°C 40 sec，40 个循环，PCR 扩增。
[0031](3)应用荧光定量PCR仪随机软件，分析扩增结果。
[0032]蓝狐、赤狐、银黑狐、十字狐、貉、水貂、贵妃犬、金毛猪犬、博美犬、京八犬、西施犬、雪纳瑞犬、可卡犬、泰迪犬、猫、牛、羊、猪、鸡、太平洋鳕鱼、驴、兔、鹿、玉米、大豆、大米均未出现阳性扩增曲线，上述物种的扩增线平直，在基线下聚集成团，见图1 ;空白对照(水)无扩增，见图2 ;阳性对照(貉DNA)产生典型阳性扩增曲线，见图3。 [0033]该组引物和探针，经在线BLAST的结果证实，具有很高的特异性，不会与其他物种发生交叉反应。貉为犬科动物，因此在特异性实验中特别选择同属犬科的狐狸、狗以及其他可能作为食品和饲料原料的牛、羊、大豆、大米等进行实验。经验证，除貉的基因组DNA出现阳性扩增曲线外，其他物种均无扩增，与预期相符，表明该组引物和探针有良好的特异性，与上述物种没有交叉反应。
[0034]实施例2
(O不同含量貉样品DNA的提取
A.将貉肉和羊肉，加入液氮，研磨成粉末状后，各称取0.1 g，加至2 mL离心管中。各管中分别加入600μ?预热的CTAB裂解缓冲液和40 μ L蛋白酶K，轻轻混匀后，65°C水浴保温 90min ；
B.2 000 g离心5 min,取上清于另一干净的2 mL离心管中；
C.将貉肉和羊肉样品的DNA抽提缓冲液按比例(100%、10%，1%,0.1%, 0.01%, 0.001%,
0.0001%, 0.00001%)进行混合；
D.加入等体积的酚、三氯甲烷和异戊醇的混合液(25:24:1)，震荡混匀；
E.12 000 g离心10 min，取上清至干净的2 mL离心管中，加入等体积异丙醇，颠倒混
匀；
F.12 000 g离心10 min，弃去上清液，用预热至65°C的TE缓冲液溶解沉淀；
G.加入5 μ L RNA 酶溶液，37 °C 30 min ；
H.加入200μ L三氯甲烷:异戊醇(24:1 )，强烈振荡；
1.12 000 g离心10 min，取上清至干净的2 mL离心管中，加入等体积异丙醇，颠倒混
匀；
G.12 000 g离心10 min,弃去上清液，用4°C预冷的70%乙醇500 μ L，涡旋清洗沉淀；K.12 000 g离心10 min，弃去上清液，倒置晾干后加100 μ? TE缓冲液溶解沉淀，-20°C保存备用。
[0035](2)不同含量貉样品DNA的实时荧光PCR扩增:
A.在PCR反应管中加入如权利要求1所述的2XPCRMaster Mix 12.5 μ?，上游引物和下游引物各0.5 μ?, Taqman探针0.5 μ?, 100 ng/^L待测样品的DNA 2 μ?，补充双蒸水至25 μ?,混匀；
B.将PCR反应管放入荧光定量PCR仪，按下述反应条件完成PCR扩增:95°C 2 min, I个循环，预变性；
950C 15 sec ；60°C 40 sec，45 个循环，PCR 扩增。
[0036](3)应用荧光定量PCR仪随机软件，分析扩增结果。
[0037]含量为10%、1%、0.1%、0.01%、0.001%、0.0001% 和 0.00001% 貉成分的 DNA 样品均出
现典型的阳性扩增，见图4 ;在10%-0.00001%范围间荧光PCR有良好的线性关系，见图5。
[0038]貉肉样品取100 mg，提取得到的核酸浓度为107.6 ng/yL，检测中使用2 μ L，DNA总量为215.2 ng。据此可粗略估计当DNA抽提缓冲液中的貉成分含量为0.00001%，貉成分DNA总量为21.52 fg,即该方法的绝对检测限为21.52 fg。
[0039]实施例3
(I)待测肉卷样品DNA的提取
A.称取0.3 g肉卷样品，加至2 mL离心管中。加入600 PL预热的CTAB裂解缓冲液和40 μ L蛋白酶K，轻轻混匀后，65°C水浴保温90 min ；
B.2 000 g离心5 min，取上清于另一干净的2 mL离心管中，加入等体积的酚、三氯甲烷和异戊醇的混合液(25:24:1)，震荡混匀；
C.12 000 g离心10 min，取上清至干净的2 mL离心管中，加入等体积异丙醇，颠倒混
匀；
D.12 000 g离心10 min，弃去上清液，用预热至65°C的TE缓冲液溶解沉淀；
E.加入5 μ L RNA 酶溶液，37 °C 30 min ；
F.加入200μ L三氯甲烷:异戊醇(24:1 )，强烈振荡；
G.12 000 g离心10 min，取上清至干净的2 mL离心管中，加入等体积异丙醇，颠倒混
匀；
H.12 000 g离心10 min,弃去上清液，用4°C预冷的70%乙醇500 μ L，涡旋清洗沉淀；
1.12 000 g离心10 min，弃去上清液，倒置晾干后加100 μ? TE缓冲液溶解沉淀，-20°C保存备用。
[0040](2 )待测肉卷样品DNA的实时荧光PCR扩增
A.在PCR反应管中加入如权利要求1所述的2XPCRMaster Mix 12.5 μ?，上游引物和下游引物各0.5 μ?, Taqman探针0.5 μ?, 100 ng/^L待测样品的DNA I μ?，补充双蒸水至25 μ?,混匀；
B.将PCR反应管放入荧光定量PCR仪，按下述反应条件完成PCR扩增:
95°C 2 min, I个循环，预变性；
950C 15 sec ；60°C 40 sec，40 个循环，PCR 扩增。
[0041](3)应用荧光定量PCR仪随机软件，分析扩增结果。
[0042]样品出现阳性扩增曲线，Ct值为25.22，见图6 ;阴性对照(狐狸DNA)无扩增，见图7 ;空白对照(水)无扩增，见图8 ;阳性对照(貉DNA)产生典型阳性扩增曲线，见图9，据此可判定该样品检出貉成分。
[0043]实施例4
(I)待测饲料样品DNA的提取
A.称取0.3 g饲料样品，加至2 mL离心管中。加入600 PL预热的CTAB裂解缓冲液和40 μ L蛋白酶K，轻轻混匀后，65°C水浴保温90min ；B.2 OOO g离心5 min，取上清于另一干净的2 mL离心管中，加入等体积的酚、三氯甲烷和异戊醇的混合液(25:24:1)，震荡混匀；
C.12 000 g离心10 min，取上清至干净的2 mL离心管中，加入等体积异丙醇，颠倒混
匀；
D.12 000 g离心10 min，弃去上清液，用预热至65°C的TE缓冲液溶解沉淀；
E.加入5 μ L RNA 酶溶液，37 °C 30 min ；
F.加入200μ L三氯甲烷:异戊醇(24:1 )，强烈振荡；
G.12 000 g离心10 min，取上清至干净的2 mL离心管中，加入等体积异丙醇，颠倒混
匀；
H.12 000 g离心10 min,弃去上清液，用4°C预冷的70%乙醇500 μ L，涡旋清洗沉淀；
1.12 000 g离心10 min，弃去上清液，倒置晾干后加100 μ? TE缓冲液溶解沉淀，-20°C保存备用。
[0044](2)待测饲料样品DNA的实时荧光PCR扩增
A.在PCR反应管中加入如权利要求1所述的2XPCRMaster Mix 12.5 μ?，上游引物和下游引物各0.5 μ?,Taqman探针0.5 μ?, lOOng/^L待测样品的DNA I μ?，补充双蒸水至25 μ?,混匀；
B.将PCR反应管放入荧光定量PCR仪，按下述反应条件完成PCR扩增:
95°C 2 min, 1个循环，预变性；
950C 15 sec ；60°C 40 sec，40 个循环，PCR 扩增。
[0045](3)应用荧光定量PCR仪随机软件，分析扩增结果
样品未出现阳性扩增曲线，见图10;阴性对照(狐狸DNA)无扩增，见图11 ;空白对照(水)无扩增，见图12 ;阳性对照(貉DNA)产生典型阳性扩增曲线，见图13，据此可判定该样品未检出貉成分。
【权利要求】
1.一种貉成分快速检测用的上游引物和下游引物，其特征在于:上游引物序列为:5’- AATCTTGCCTGGGTTTGGAA -3’ ；下游引物序列为:5’_ CAGTAAATATGTGGTGGGCTCACA -3’。
2.一种貉成分快速检测用的Taqman-MGB探针，其特征在于:序列为:5’_ CATACTACTCCGGGAAAA -3’。
【文档编号】C12Q1/68GK103757116SQ201410026930
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2014年1月20日 优先权日:2013年11月12日
【发明者】孙敏, 邓明俊, 吴兴海, 高宏伟 申请人:山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心