基于dCAPS技术对日本看麦娘抗药性相关突变的分子检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种基于dCAPS技术检测导致日本看麦娘对ACCase抑制剂类除草剂产生抗性的相关突变的分子检测方法，可用于对日本看麦娘抗性相关突变进行快速准确的检测，本发明属于生物【技术领域】。根据日本看麦娘与抗性相关的ACCase基因，针对不同突变分别设计引物，以日本看麦娘基因组DNA为模板进行PCR扩增并获得扩增片段；选择相应的限制性内切酶对上述的PCR扩增片段进行酶切；酶切后根据琼脂糖凝胶电泳可判断日本看麦娘是否具有抗性相关突变及其突变的基因型。相对于传统的突变检测方法，本发明的特异性强，准确度高，方法更加快速简单，并且大大降低了检测成本，为日本看麦娘抗性相关突变的检测提供了一种优良的分子检测方法。
【专利说明】基于dCAPS技术对日本看麦娘抗药性相关突变的分子检测方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，具体涉及一种基于衍生酶切扩增多态性(derivedcleaved amplified polymorphic sequence, dCAPS)方法来检测导致日本看麦娘对乙酸辅酶A羧化酶(Acetyl coenzyme A carboxylase, ACCase)抑制剂类除草剂产生抗性的相关突变的分子检测方法。可用于对日本看麦娘抗性相关突变进行快速准确的检测。
【背景技术】
[0002]日本看麦娘(Alopecurus japonicus Steud.)是我国油菜田和麦田的恶性禾本科杂草，因其与作物争肥、争水、争阳光、争空间，而对油菜和小麦的产量及品质造成严重危害。
[0003]ACCase抑制剂类除草剂是一类包括芳氧苯氧基丙酸酯类，环己烯酮类，新苯基吡唑啉类的具有杀草活性高、杀草谱广和选择性强等优点的除草剂。自70年代后期在我国油菜田和小麦田开始广泛使用，一直是油菜田和小麦田防除一年生禾本科杂草的主导药剂。但是近年来，日本看麦娘对此类除草剂的抗药性问题逐步显现，对我国油菜和小麦的粮食生产生了严重威胁。因此，对日本看麦娘的抗药性检测对于保障我国粮食生产安全至关重要。研究表明，在日本看麦娘中编码ACCase氨基酸的某些位点突变会导致其对ACCase抑制剂类除草剂产生抗药性，这些氨基酸突变为Ile-1781-Leu，Trp-1999-Cys，Trp-1999-Leu，Trp-2027-Cys, Ile-2041-Asn, Asp-2078-Gly。
[0004]对抗性相关突变的检测对于抗性日本看麦娘的监控及治理具有重要意义。dCAPS技术是一种通过等位基因快速准确检测SNP位点的技术。该技术通过在引物中导入错配碱基，使扩增的序列在一种基因型中产生酶切位点，而在另一种没有，PCR产物再经过相应的限制性内切酶酶切，通过限制性图谱分析可`知SNP位点是否存在，从而对突变位点进行快速准确的检测。该技术已经在其他抗性杂草的抗性突变检测中得到了应用，但是在我国恶性杂草日本看麦娘的抗性检测中尚无应用。
【发明内容】
[0005]为了对日本看麦娘抗ACCase抑制剂类除草剂的抗性相关突变进行检测，本发明建立了一套基于dCAPS技术对抗性相关突变进行快速准确检测的分子检测方法。为实现该方法，本发明针对不同突变设计了相应的引物，筛选了合适的限制性内切酶，并对PCR扩增条件、琼脂糖凝胶电泳条件进行了优化。
[0006]本发明所述分子检测方法通过以下技术方案实现:
[0007](I)根据日本看麦娘编码ACCase基因中与抗性相关的不同的突变位点，分别设计一对引物进行PCR扩增，使扩增产物在不同的基因型之间产生不同的酶切位点。
[0008]PCR扩增所用的引物为:
【权利要求】
1.一种快速准确检测抗ACCase抑制剂类除草剂的日本看麦娘、看麦娘、茼草等杂草中与抗性相关的突变位点(Ile-1781-Leu, Trp-1999-Cys，Trp-1999-Leu, Trp-2027-Cys,Ile-2041-Asn, Asp-2078-Gly)的分子检测方法，其特征是基于衍生酶切扩增多态性(dCAPS)技术对抗性相关突变的检测，该方法包括以下步骤: 步骤1:提取杂草DNA样本； 步骤2:进行PCR ； 步骤3:用限制性内切酶酶切PCR产物； 步骤4:琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物。
2.根据权利要求1所述的分子检测方法，其特征在于: (1)步骤2中所述的用于PCR反应中的引物具有特异性，所述的引物分别为:
3.根据权利要求1或2所述的分子检测方法，所述杂草可以是日本看麦娘、看麦娘、茼草、棒头草、硬草等禾本科杂草。
【文档编号】C12Q1/68GK103882121SQ201410066925
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2014年2月27日 优先权日:2014年2月27日
【发明者】董立尧, 徐洪乐, 李俊, 潘浪 申请人:南京农业大学