一种基于ssr与毛细管电泳技术鉴定甘蔗种质资源的方法
【专利摘要】本发明公开一种甘蔗种质资源鉴定的方法，该方法应用SSR分子标记与毛细管电泳技术相结合，使用12对引物建立出52个甘蔗品种的指纹图谱，将其用于甘蔗种质的鉴定、品种鉴别与保护。具体方法包括提取不同甘蔗品种的基因组DNA，经PCR扩增后，用毛细管电泳检测扩增结果，根据DNA条带大小的不同建立不同甘蔗种质的指纹图谱，并用于种质资源的鉴定。本发明的优点在于与常规的种质资源鉴定和生化检验相比，不受作物生长环境和季节的影响，分辨率高、结果准确可靠、操作简单并且快速直接，特别适用于大批量、多批次的实验数据整合。
【专利说明】一种基于SSR与毛细管电泳技术鉴定甘蔗种质资源的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，涉及一种利用SSR和毛细管电泳技术鉴定甘蔗种质资源的高通量检测方法。
【背景技术】
[0002]我国是世界上古老的甘蔗种植国家之一，历代甘蔗栽培品种类型很多。近年来，中国又引进、选育了适应于各种生态类型蔗区推广的甘蔗品种120多个。但当前甘蔗栽培品种遗传基础狭窄，品种的形态、农艺性状等生物学特性差异不大，如何鉴定甘蔗栽培品种及其杂交后代已成为当今甘鹿科研工作的重难点之一。
[0003]在DNA分子技术方法广泛应用之前，人们主要是借助形态和农艺性状、细胞核型分析、同工酶标记、染色体分析技术等实验方法，对甘蔗栽培品种进行鉴定，但这些方法受环境、有限的标记数量等因素制约，不能得到广泛推广。DNA分子标记技术是DNA水平上遗传多样性的直接反映，具有数量多、稳定好、无表型效应，不受环境影响等优点。
[0004]DNA指纹技术是指能够反映生物个体或种群间基因组中DNA位点差异的一种分子生物学技术。目前DNA分子标记已广泛应用于甘蔗栽培品种指纹图谱构建、遗传分析、基因定位和分子标记辅助选择等方面。与其它分子标记相比，SSR分子标记技术具有多态性丰富、共显性遗传方式、分析方法简单、重复性好等优点。目前，对SSR标记技术的PCR产物检测方法主要有荧光标记引物测序法、同位素标记引物的聚丙烯酰胺电泳法，以及银染聚丙烯酰胺PAGE (polyacrylamide gel electrophoresis)方法。PAGE是目前最常用的检测方法，但其因需要银染，使得检测过程变得复杂，且不能准确读出片段大小，只能粗略的估计。
[0005]毛细管电泳(capillary electrophoresis, CE)也叫高效毛细管电泳(HPCE)。是20世纪80年代后期在全球范围内迅速崛起的一种分离分析技术。毛细管凝胶电泳和普通电泳相比，具有高灵敏度、高分辨率、高速度、样品少等优点；因此，CE被逐步应用于检测分子标记技术的PCR扩增产物。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是解决甘蔗种质资源鉴定难的问题，提供一种高通量、操作简单、结果准确可靠的甘蔗种子资源的鉴定方法。而将毛细管电泳技术与SSR分子标记技术结合，能够为甘蔗亲属关系的鉴定、品种鉴定、种子真实性鉴定以及种子纯度鉴定提供有力的支持。
[0007]本发明提供的甘蔗种质资源鉴定方法，其步骤为:提取甘蔗新鲜嫩叶DNA，利用12对SSR荧光引物与毛细管电泳技术相结合构建52个在中国广泛种植的甘蔗品种DNA指纹数据库，将待测品种或品系DNA指纹数据与已构建的甘蔗DNA指纹数据库中的数据进行对比分析，判断待测品种或品系的种类名称。
[0008]作为本发明的进一步限定，所述12对SSR荧光引物为筛选得到的核心引物，其引物信息如下表:
【权利要求】
1.一种高通量SSR甘蔗种质资源鉴定方法，其特征在于提取甘蔗新鲜嫩叶DNA后利用12对SSR荧光引物进行PCR扩增，然后将PCR产物经过毛细管电泳分析，构建出52个在中国广泛种植的甘蔗品种DNA指纹数据库，将待测品种或品系DNA指纹数据与已构建的甘蔗DNA指纹数据库中的数据进行对比分析，判断待测品种或品系的种类名称。
2.根据权利要求1所述的高通量SSR甘蔗种质资源鉴定方法方法，其特征在于，所述12对SSR荧光引物为筛选得到的核心引物，其中正向引物5’端以CY5磷荧光染料标记，合成荧光引物，并避光保存；引物信息如下: 引物名称:SMC7CUQ，条带大小:158-171Bp，引物退火温度:60°C，引物序列:
正向:5’ -GCCAAAGCAAGGGTCACT AGA-3，
反向:5’ -AGCTCTATCAGTTGAAACCGA-3’ ； 引物名称:SMC18SA，条带大小:130-165Bp，引物退火温度:62°C，引物序列: 正向:5’ -ATTCGGCTCGAC CTCGGGAT-3’
反向:5’ -AGTCGAAAGGTAGCGTGGTGTTAC-3’ ； 引物名称:SMC22DUQ，条带大小:140-163Bp，引物退火温度:62°C，引物序列:
正向:5’ -CCA TTC GAC GAA AGC GTC CT-3’
反向:5’ -CAA GCG TTG TGC TGC CGA GT-3’ ； 引物名称:SMC24DUQ，条带大小:121-142Bp，引物退火温度:64°C，引物序列:
正向:5’ -CGCAACGACATATACACTTCGG-3’
反向:5’ -CGACATCACGGAGCA ATC AGT-3’ ； 引物名称:SMC31CUQ，条带大小:138-185Bp，引物退火温度:62°C，引物序列:
正向:5’ -CATGCCAACTTCCAATACAGACT-3’
反向:5’ -AGTGCCAATCCA TCT CAG AGA-3’ ； 引物名称:SMC36BUQ，条带大小:104-254Bp，引物退火温度:64°C，引物序列:
正向:5’ -GGGTTTCAT CTC TAG CCT ACC-3’
反向:5’ -TCAGTAGCAGAGTCAGACGCTT-3’ ； 引物名称:SMC119CG，条带大小:105-131Bp，引物退火温度:58°C，引物序列:
正向:5’ -TTCATCTCT AGC CTA CCC CAA-3’
反向:5’ -AGC AGC CAT TTA CCC AGG A-3’ ； 引物名称:SMC278CS，条带大小:140-182Bp,引物退火温度:64°C，引物序列:
正向:5’ -TTCTAGTGCCAATCCATCTCAGA-3’
反向:5’ -CATGCCAACTTCCAAACAGACT-3’ ； 引物名称:SMC334BS，条带大小:132-165Bp,引物退火温度:60°C，引物序列: 正向:5’ -CAATTCTGACCG TGCAAAGAT-3’
反向:5’ -CGATGAGCTTGA TTG CGA ATG-3’ ； 引物名称:SMC336BS，条带大小:141-185Bp,引物退火温度:62°C，引物序列:
正向:5’ -ATTCTAGTGCCAATCCATCTC A-3’ 反向:5’ -CATGCCAACTTCCAAACAGAC-3’ ； 引物名称:SMC486CG，条带大小:224-245Bp，引物退火温度:58°C，引物序列:
正向:5’ -GAA ATT GCC TCC CAG GAT TA-3’反向:5’ -CCAACTTGAGAATTGAGATTCG-3’ ； 引物名称:SMC597CS，条带大小:144-179Bp,引物退火温度:64°C，引物序列:
正向:5’ -GCACACCACTCGAATAACGGAT-3’ 反向:5，-AGTATATCGTCCCTGGCATTCA-3，。
3.根据权利要求1所述的高通量SSR甘蔗种质资源鉴定方法方法，其特征在于，所述DNA提取包括以下步骤:将甘蔗嫩叶于液氮研磨成粉末状，加入1.2 ml 65°C预热的SDS提取液，摇匀，65°C水浴45 min ;加入200 μ I KAc，混匀后，冰浴15 min ；4°C, 10000 rpm离心15min,取I ml上清液,加入等体积氯仿混匀；4°C, 12000 rpm离心7 min,取上清液,加1/10体积的NaAc和2倍体积的预冷无水乙醇,冰浴20 min ；4°C, 10000 rpm离心10 min,弃上清,用70%酒精洗涤2次，晾干沉淀；加入200 μ I已灭菌的TE溶液，溶解沉淀，即得DNA溶液，置于-20°C保存备用。
4.根据权利要求1所述的高通量SSR甘蔗种质资源鉴定方法方法，其特征在于，所述的PCR扩增程序为:首先95°C预变性5 min ;随后的30个循环为:94°C变性30 sec，退火30sec, 72°C延伸 30 sec ;最后 72°C下延伸 2 min。
5.根据权利要求1所述的高通量SSR甘蔗种质资源鉴定方法，其特征在于:所述的毛细管电泳分析方法为将所得到的PCR产物稀释100倍后，在遗传分析系统仪上利用毛细管电泳法检测，每个 CE样品中含有I μL PCR产物、0.2 μL Genescan-400分子量标准品和20μL SLS溶液；在毛细管凝胶电泳过程中，PCR产物与Genescan-400分子量标准品的荧光信号均由基因分析仪自动保存。
6.根据权利要求1所述的高通量SSR甘蔗种质资源鉴定方法方法，其特征在于:所述指纹数据库的构建为在所有引物的扩增产物中只统计多态性较高的SSR标记片段，参试材料中，若含有这这些特异SSR标记片段则记为“A”，若无扩展出记为“C”;对于某一甘蔗栽培品种，有无这些特异SSR标记的组合即为此甘蔗栽培品种的指纹，不同甘蔗种质资源的SSR标记片段构成了指纹图谱数据库。
【文档编号】C12Q1/68GK104017859SQ201410090829
【公开日】2014年9月3日 申请日期:2014年3月13日 优先权日:2014年3月13日
【发明者】梁俊, 刘守廷, 甘志勇, 莫璋红, 宋雪萍, 甘国勇 申请人:南宁泰格瑞农业科技有限公司