一种与小型猪2型糖尿病有关的snp标记、其检测方法和用途
【专利摘要】本发明公开了一种与小型猪2型糖尿病有关的SNP标记、其检测方法和用途，本发明的SNP标记是位于Leptin基因的1号外显子325bp处的G/A多态，有该SNP标记的Leptin基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:1所示，其检测方法为：提取小型猪的基因组DNA为模板，使用核苷酸序列如SEQ?ID?NO:2和SEQ?ID?NO:3所示的引物来进行PCR扩增，将PCR扩增产物测序，分析测序结果，判读在1号外显子325bp处的G/A多态。本发明提供的SNP标记与小型猪对2型糖尿病的易感性相关，因此，可以通过鉴定该SNP标记来筛选对2型糖尿病易感或抵抗的小型猪品系。
【专利说明】一种与小型猪2型糖尿病有关的SNP标记、其检测方法和用途
【技术领域】
[0001]本发明属于分子生物学【技术领域】，涉及一种与小型猪2型糖尿病有关的SNP标记、其检测方法和用途。
【背景技术】
[0002]糖尿病(diabetes mellitus, DM)是一种慢性内分泌代谢性疾病,严重的威害人类的健康，其主要标志是高血糖。近年来，全球糖尿病患病率呈迅速上升的趋势，2011年世界卫生组织统计数据表明，全球的糖尿病患者已经达到3.66亿人，预计至2030年全球发病率将达4.39亿人。我国18岁及以上居民糖尿病患病率为9.7%，60岁以上老年人患病率高达19.6%，全国约有 成年糖尿病患者9700万人，糖尿病已经成为影响我国人口健康尤其是老年人身体健康的主要疾病，极大增加了社会养老的成本，这个问题在今后我国老年人口比率增加的趋势下显得日益尖锐。根据发病机制的不同，糖尿病可分为I型、2型、特异型和妊娠糖尿病4类。其中，2型糖尿病(Type 2 Diabetes mellitus, T2DM)患者占糖尿病人总数的90%以上，不断探索2型糖尿病治疗新方法及开发新药物具有非常重要的临床意义和社会价值。
[0003]普遍认为2型糖尿病是由遗传、行为、环境等多种危险因素共同参与和相互作用所引起的多因子疾病，2型糖尿病的发病机制仍然不够清楚，治疗效果不理想。在2型糖尿病发病机制、药物开发和干预治疗的研究中，2型糖尿病动物模型的构建和使用有着非常重要的意义。动物模型在糖尿病研究中已经得到广泛的应用，早期胰腺在糖代谢平衡中的中心作用在胰腺切除犬实验得到了证实，并发现和纯化了胰岛素。链脲佐菌素(streptozotocin, STZ)和四氧嘧唳(alloxan)是对胰岛具有选择性的毒素,能引发多种动物的高血糖症，最常用于I型糖尿病模型的建立。通过遗传选育，可培育出I型糖尿病、2型糖尿病的相关表型的品系，如胰岛素抵抗和肥胖的理想动物模型。近年来，大量的糖尿病相关基因研究的动物模型已通过分子生物学等技术建立，其中包括广义基因剔除、基因替换和组织特异性基因剔除小鼠。小型猪在解剖学、生理学、营养代谢和疾病特征等方面都与人有较大的相似性。小型猪具有生命周期长、性成熟早、繁殖快、易于饲养等特点，在生物医学研究领域中具有重要的应用价值。相比于大小鼠，小型猪与人类更加接近，型猪的脏器系数更近于人类；另一方面猪的胰岛素与人类的胰岛素只差一个氨基酸，对糖的吸收、转运和利用等方面与人类更为相似；相比于非人灵长类动物，小型猪没有苛刻的伦理道德和动物保护方面的要求，加上饲养和试验成本较低，小型猪成为制作2型糖尿病模型的理想动物。但建立大动物2型糖尿病模型的方法具有很大的难度，获得自发性糖尿病小型猪的几率非常稀少，因此，目前急需筛选培育出小型猪2型糖尿病易感或抵抗品系。
[0004]2型糖尿病是同时由遗传因素和环境因素互相作用而引发的代谢异常性疾病，大量的研究表明，许多基因的单核苷酸多态性多态性(single nucleotidepolymorphism,SNP)与2型糖尿病的发生存在着不可忽视的关系。L印tin基因属于分泌型蛋白类激素，主要是脂肪组织合成，以单体形式存在于血液中，最早被用克隆定位的方法从小鼠中成功克隆出来。Leptin的主要功能是增加能量的消耗，降低食物的摄入以及减轻体重，所以又被成为瘦素。最近的研究发现，Leptin不仅和集体的能量代谢有关，还参与生殖系统的发育、机体的生长、还与人类的肥胖和糖尿病有关联。和其他一些蛋白一样，L印tin的生理功能也需要通过与相应受体的结合来体现。人L印tin受体基因位于I号染色体，长度大于70kbp，包含有20个外显子，是L印tin高亲和力因子，又称作糖尿病基因。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种与小型猪2型糖尿病易感性相关的SNP标记。
[0006]本发明的另一个目的在于提供用于检测上述SNP标记的引物和检测方法。
[0007]本发明的另一个目的在于提供上述SNP标记的用途。
[0008]本发明所述的与小型猪2型糖尿病易感性相关的SNP标记，是在小型猪L印tin基因的I号外显子325bp处的(G/A)多态，具有该SNP标记的L印tin基因的I号外显子核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0009]检测上述SNP标记所用的引物的核苷酸序列如SEQIDN0:2和SEQ ID NO:3所示。
[0010]在小型猪中检测所述与小型猪2型糖尿病易感性相关的SNP标记的方法，包括以下步骤:
[0011](I)提取小型猪的基因组DNA ;
[0012](2)用提取的小型猪基因组DNA为模板，使用核苷酸序列如SEQ ID NO: 2和SEQ IDNO: 3所示的引物来进行PCR扩增；
[0013](3)将PCR扩增产物测序，分析测序结果，判读在I号外显子325bp处的(G/A)多态。
[0014]优选地，步骤(3)中，将PCR产物先经琼脂糖凝胶电泳检测，回收目的片段后再进行测序。
[0015]优选地，步骤(2)所述的PCR扩增反应体系为:DNA模板3yL、SEQ ID NO: 2和SEQID NO: 3所示的引物各2 μ L.PCRMix试剂25 μ L、双蒸水18 μ L ;其中，所述DNA模板浓度为SOng/yL，所述引物的浓度为25 μ mol/L，所述PCR Mix试剂为北京康为世纪生物科技有限公司的CW0716型号试剂。
[0016]优选地，PCR扩增的反应程序为:预变性94°C 5min ;变性98°C 10s，退火61°C 30s，延伸72°C 30~60s，35个循环；延伸72°C 7~lOmin。
[0017]本发明所述的与小型猪2型糖尿病易感性相关的SNP标记，可用于筛选对2型糖尿病易感或抵抗的小型猪品系。
[0018]本发明提供的SNP标记与小型猪对2型糖尿病的易感性相关，因此，可以通过鉴定该SNP标记来筛选对2型糖尿病易感或抵抗的小型猪品系,所得的对2型糖尿病易感或抵抗的小型猪品系可用于研究、筛选治疗2型糖尿病的药物，具有广泛的应用前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0019] 图1为使用本发明的引物扩增目的基因的电泳图。【具体实施方式】
[0020]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和本质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
[0021]下述实施例中使用的动物、仪器、试剂、试剂盒均可由市售得到；
[0022]预备例建立小型猪糖尿病模型
[0023]1.实验动物来源:广西大学巴马小型猪繁育场封闭群。从86头猪中选取120~150d日龄，体重相近(25~30公斤左右)实验猪46头(公22头，母24头)，管理上公母分开饲养，每栏4~6头；
[0024]2.饲喂方法:[0025]实验日粮配方:60%全价饲料(饲料公司提供的试验专用配合全价料，12.95MJ/kg消化能，17%粗蛋白质)，30%蔗糖，10%猪油。
[0026]为避免因日粮改变而造成的采食量下降，实验开始阶段，实验猪的饲喂要求由常规饲料缓慢过渡到实验日粮。一般每顿之间，蔗糖增量为饲喂量的1.5%，猪油增量为饲喂量的0.5%，最后直至达到实验日粮的要求。
[0027]要求饲喂量为体重的3%，每天早晚两次定时、定点饲喂，自由饮水。建模期7个月(210d)。
[0028]3.在高脂高糖饲喂条件下，每隔I个月测量空腹血糖值，当小型猪空腹血糖值大于6.3mmol/L为血糖异常。连续两次空腹血糖值大于6.3mmol/L则确诊为糖尿病。如果只有一次空腹血糖值大于6.3mmol/L，则进行静脉注射葡萄糖耐量试验，如果静脉注射葡萄糖耐量60min血糖值大于6.3mmol/L,也确诊为糖尿病。
[0029]4.建模结果:
[0030]实验前的空腹血糖指标有少数几头出现血糖异常(>6.3mmol/L)，但并不稳定，没有重复性。连续两次都出现空腹血糖异常的个体从120d就开始出现。至实验结束，在全部的46头个体中，共有10头出现连续两次空腹血糖异常，，连续两个月中，有一个月血糖值超过6.3mmol/L的个体中，经过静脉注射葡萄糖耐量试验,60min的血糖值几乎都比Omin的高，且19头个体中有13头个体高于6.3mmol/L,即由静脉注射葡萄糖耐量确定的2型糖尿病个体有13头。至实验结束时共有20头猪确诊为2型糖尿病，本实验的建模成功率为43.5%。
[0031]实施例
[0032]1.提取小型组基因组DNA
[0033]用前腔静脉采血的方法，采集预备例中46头实验猪的血液，每例取3ml，放入枸橼酸钠抗凝剂采血管中，放置于_20°C冰箱保存待用；
[0034]按照北京天根生物技术有限公司的血液基因组DNA提取试剂盒操作方法，提取46头猪的基因组DNA。
[0035]2.目的片段PCR扩增与测序
[0036]用已提取的DNA为模板，根据所设计的引物，进行PCR扩增:取DNA模板3 μ L、SEQID NO: 2和SEQ ID NO: 3所示的引物各2 μ L、PCRMix试剂25 μ L、双蒸水18 μ L，设置PCR扩增体系:预变性94°C 5min ;变性98°C 10s，退火61 °C 30s，延伸72°C 60s，35个循环;然后延伸 72°C IOmin0
[0037]PCR产物在2%琼脂糖胶中电泳检测，扩增的目的片段大小为568bp，电泳图见图1，将回收的目的片段测序，测序结果用DNAstar软件与GenBank中猪的相关基因片段序列序列比对、分析，判读在Leptin基因I号外显子325bp处的(G/A)多态。
[0038]3.结果与分析
[0039]3.1测序结果与Hardy-Weinberg遗传平衡检验
[0040]测序结果表明，在L印tin基因I号外显子325bp处的(G/A)多态，对应参考序列猪Leptin基因序列(GenBank登录号NC_010460.3)中位置为881位点。对46头参与2型糖尿病建模试验的猪应的测序结果进行L印tin881G/A基因型辨别，结果发现881AA6头，881AG25头，881GG15头.H-W遗传平衡检验显示2型糖尿病组与正常组881G/A基因频率分布处于Hardy-Weinberg平衡。
[0041]表1 L印tin基因881G/A位点H-W遗传平衡检验
[0042]
【权利要求】
1.一种与小型猪2型糖尿病易感性相关的SNP标记，其特征在于，所述SNP标记是在小型猪L印tin基因的I号外显子325bp处的G/A多态，具有该SNP标记的L印tin基因的I号外显子核苷酸序列如SEQ ID NO:1所不。
2.检测权利要求1所述的SNP标记的方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)提取小型猪的基因组DNA; (2)用已提取的小型猪基因组DNA为模板，使用核苷酸序列如SEQID N0:2和SEQIDNO: 3所示的引物来进行PCR扩增； (3)将PCR扩增产物测序，分析测序结果，判读在I号外显子325bp处的G/A多态。
3.按照权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，将PCR产物先经琼脂糖凝胶电泳检测，回收目的片段后再进行测序。
4.按照权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述的PCR扩增反应体系为:DNA模板3yL、SEQ ID NO: 2和SEQ ID NO: 3所示的引物各2 μ L、PCR Mix试剂25 μ L、双蒸水18 μ L ;其中，所述DNA模板浓度为30ng/ μ L，所述引物的浓度为25 μ mol/L,所述PCRMix试剂为北京康为世纪生物科技有限公司的CW0716型号试剂。
5.按照权利要求4所 述的方法，其特征在于，PCR扩增的反应程序为:预变性940C 5min ;变性 98°C 10s，退火 61°C 30s，延伸 72°C 30 ~60s，35 个循环；延伸 72°C 7 ~1Omin0
6.检测权利要求1所述的SNP标记所用的引物，其特征在于:所述引物的核苷酸序列如 SEQ ID N0:2 和 SEQ ID N0:3 所示。
7.权利要求1所述的SNP标记在筛选对2型糖尿病易感或抵抗的小型猪品系中的用途。
【文档编号】C12N15/11GK103937787SQ201410137904
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2014年4月8日 优先权日:2014年4月8日
【发明者】郭亚芬, 兰干球, 蒋钦杨, 杨辉 申请人:广西大学