一种半乳糖苷酶和编码这种酶的多核苷酸的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一个克隆自大理洱源65℃热泉宏基因组的β-半乳糖苷酶(β-D-半乳糖苷酶，EC3.2.1.23)和编码这种酶的核苷酸，该半乳糖苷酶在37-55℃具有较高的催化活性，可作为乳糖降解和双糖合成催化剂，并有水解生物体内储存的多糖和半乳糖残基，另外该酶还具有转糖苷作用，能生成一些功能性的低聚糖，如低聚半乳糖。低聚糖几乎不被小肠消化，是一种低分子量的、不粘稠的水溶性膳食纤维；低聚半乳糖作为肠道内双歧杆菌的增值因子，只能被双歧杆菌所利用，增殖的双歧杆菌竞争性地拮抗腐败菌的生长，减少毒素和酶的产生，有整肠效果。
【专利说明】一种半乳糖苷酶和编码这种酶的多核苷酸
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，具体涉及一种克隆于大理洱源热泉宏基因组的β-半乳糖苷酶，以及编码此酶的多核苷酸和经DNA重组技术产生这种酶的方法和应用。
【背景技术】
[0002]猪的乳汁中含有约3飞％的乳糖，当乳猪仔小肠粘膜绒毛β -半乳糖苷酶基因缺陷或后天不足时会发生乳糖消化不良，未分解吸收的乳糖进入结肠后，被肠道存在的细菌发酵成为小分子的有机酸如醋酸、丙酸、丁酸等，并产生一些气体如甲烷、H2, CO2等，这些产物大部分可被结肠重吸收，而未被吸收者或仍未被分解的乳糖可引起肠鸣、腹胀、腹痛、排气、腹泻等症状，长期如此并会严重影响乳猪仔的生长。
[0003]豆柏是畜禽饲料中常用的植物蛋白原料，而豆柏中含有较高的乳糖，饲料中的乳糖消化不良同样会引起腹胀和腹泻等症状。β -半乳糖苷酶(β -D-半乳糖苷酶，EC.3.2.1.23)又名乳糖酶，是一种把乳糖分解成葡萄糖和半乳糖的酶，可作为乳糖降解和双糖合成的催化剂，并有水解生物体内储存的多糖和半乳糖残基，具有治疗乳猪仔腹泻和提高饲料利用效率的作用。早在50年代初Aronson和Pazur就报道了此酶的转糖苷活性，乳糖酶转糖苷作用生成低聚半乳糖等功能糖。这种转移反应的产物是双糖、三糖和分子再大一些的低聚糖，是有多重组分构成的混合体系。我们所说的低聚半乳糖是以高浓度乳糖作为β_半乳糖苷酶的底物而生成的，是在乳糖分子的半乳糖残基上以β键接上1~4个半乳糖而形成的杂低聚糖。低聚糖几乎不被小肠消化，是一种低分子量的、不粘稠的水溶性膳食纤维，只能被双歧 杆菌所利用，双歧杆菌是肠内最有代表性的有益菌，它能调节和恢复肠道内微生态菌群的平衡、抑制肠内有害菌及病原菌的繁殖、促进肠蠕动、防治便秘及下痢、增进矿物的吸收和维生素的合成、提高机体抗病免疫功能等。功能糖是双歧杆菌、乳酸杆菌最直接、最有效的养料，它能排除消化系干扰，选择性地进入到双歧杆菌、乳酸杆菌最适宜生长的大肠，促使双歧杆菌快速生长和大量繁殖，增强机体免疫力的作用。由于微生物的快速生长和高效代谢的生物学特性，使其成为工业化酶制剂的主要来源。
【发明内容】
[0004]本发明旨在提供一种高温β-半乳糖苷酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，本半乳糖苷酶来源于大理洱源热泉宏基因组。
[0005]本发明的另一个目的是提供含有编码β_半乳糖苷酶的多核苷酸，其核苷酸序列如 SEQ ID NO:2 所示。
[0006]本发明还提供一种重组载体，其含有编码β_半乳糖苷酶的多核苷酸，且其是由多核苷酸与质粒、病毒或运载体表达载体构建而成。
[0007]本发明的有益效果如下:
本发明获得的β -半乳糖苷酶，该半乳糖苷酶在37-55 °C具有较高的催化活性，可作为乳糖降解和双糖合成催化剂，并有水解生物体内储存的多糖和半乳糖残基，能有效治疗乳猪小肠粘膜绒毛β-半乳糖苷酶基因缺陷或后天不足发生乳糖消化不良引起的腹泻，具有治疗乳猪仔腹泻和提高饲料利用效率的作用；另外该酶还具有转糖苷作用，在高浓度的乳糖作为底物时，该酶的转糖苷作用能催化一种功能低聚糖---低聚半乳糖的生成，低聚半乳糖作为肠道内双歧杆菌的增值因子，只能被双歧杆菌所利用，增殖的双歧杆菌竞争性地拮抗腐败菌(入产气荚膜梭菌)的生长，减少毒素和酶的产生，有整肠效果。
【专利附图】
【附图说明】
[0008]图1为本发明β -半乳糖苷酶基因的克隆片段；
图2为本发明β-半乳糖苷酶基因保守结构域分析示意图；
图3为本发明β-半乳糖苷酶基因与表达质粒连接菌落PCR检测，图中:Μ为Marker，泳道广8皆为转化后挑取的8个转化子；
图4为本发明构建成功的重组质粒双酶切图谱，图中:M为marker，泳道f 3为三个构建好的重组质粒；
图5为本发明β -半乳糖苷酶基因表达蛋白的SDS-PAGE分析检测电泳图，其分子量约为92000道尔顿，图中:Μ为Protein Marker，泳道I为pET32a_GAL/Rosetta诱导前破碎上清，泳道2为pET32a-GAL/Rosetta诱导后破碎上清，泳道3为pET32a_GAL/Rosetta诱导后破碎上清过柱透过液，泳道4为30mM咪唑缓冲液过柱第二管，泳道5为50mM咪唑缓冲液过柱第二管，泳道6为80mM咪唑缓冲液过柱第二管，泳道7为150mM咪唑缓冲液过柱第一管，泳道8为300mM咪唑缓冲液过柱第一管； 图6为本发明温度对β-半乳糖苷酶活性的影响结果示意图；
图7为本发明β-半乳糖苷酶对温度的稳定性结果示意图；
图8为本发明pH对β -半乳糖苷酶活性的影响结果示意图；
图9为本发明β -半乳糖苷酶对pH的稳定性结果示意图。
【具体实施方式】
[0009]下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容，实施例中使用的试剂和方法，如无特殊说明，均采用常规试剂和使用常规方法。
[0010]实施例1: β -半乳糖苷酶的克隆和表达 一、半乳糖苷酶的克隆表达
1、样品宏基因组DNA提取
(I)样品预处理
将65°C温泉的泥水样充分振荡,是泥水混合均匀,取30 ml样品于500g离心5min,使样品中的大部分泥沙沉淀，去除沉淀的泥沙，再次将剩余的溶液于1000g离心10min,弃沉淀，目的在于进一步去除样品中携带的较为细小的杂质，最后将含有菌体的悬液于5000g离心IOmin,弃上清并收集沉淀的菌体。
[0011](2)宏基因组DNA提取:采用Qiaamp dna mini kit试剂盒提取DNA,方法参照试剂盒说明进行；
①用适量的 TE buffer (20 mM Tris-HCl,2 mM EDTA、pH7.6)和 ATL 缓冲液悬浮菌体，使菌悬液总体积约180 μ L，再加入20 μ L浓度为20 mg/ml的Lysozyme溶液，37 °C孵育至少30 min ；
②加入20μ L proteinase K和200 μ I缓冲液AL，漩涡震荡混匀，56 °C孵育30 min,70 °C 孵育 10 min ；
③加入200μ L无水乙醇(96-100%)到样品中，轻摇混合15秒。混合后，短暂离心；(缓冲液AL，和乙醇充分混合，以得到均匀的溶液)。
[0012]④加入无水乙醇后，可能出现白色沉淀，将沉淀和液体全加入QIAamp吸附柱中，再将QIAamp吸附柱放入干净的2ml收集管中，8000rpm离心Imin,，弃收集管中的滤液；
⑤向QIAamp吸附柱中加入500μ LAffl缓冲液(尽量不要沾到管壁)，8000 rpm离心Imin，弃滤液；
⑥向QIAamp吸附柱中加入500μ LAW2缓冲液，14000 rpm离心3 min ；
⑦将QIAamp吸附柱放入EP管，14000rpm离心I min,充分去除AW2缓冲液；
⑧将QIAamp吸附柱放入新的EP管中，加入100~150μ L AE缓冲液，在室温静置2min, 8000 rpm离心I min收集总DNA ;基因组DNA冻存于-80 °C。
[0013]2、半乳糖苷酶基因的扩增(以宏基因组DNA为模板)
(O半乳糖苷酶基因的扩增所用引物序列如下:
正向引物:5 ’ -CGCGGATCCATGGGCAAGCAAGATTGGTA-3 ’
反向引物:5 ’ -CCGGAATTCGTGCATAATATAAGATATA-3，
(2)扩增体系如下:
表1:扩增反应体系组分
【权利要求】
1.一种半乳糖苷酶，其特征在于:其氨基酸序列如SEQ ID N0:1所示。
2.一种编码权利要求1所述半乳糖苷酶的多核苷酸，其特征在于:其核苷酸序列如SEQID NO:2 所示。
【文档编号】C12N15/63GK103937767SQ201410137767
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2014年4月8日 优先权日:2014年4月8日
【发明者】林连兵, 梁丛丛, 郑健, 魏云林, 季秀玲, 张琦, 邓先余 申请人:昆明理工大学