中华金叶榆叶色性状相关的srap分子标记方法及应用的制作方法
【专利摘要】中华金叶榆叶色性状相关的SRAP分子标记方法及应用，涉及一种SRAP分子标记方法及应用。本发明的目的在于提供一种中华金叶榆叶色性状相关的SRAP分子标记方法及应用。方法：一、中华金叶榆不同叶色叶片采集和叶色标定；二、分别提取每株中华金叶榆植株上金色叶片和森林绿色叶片的总RNA；三、RNA浓度检测；四、cDNA-SRAP扩增差异片段；五、差异片段的回收、测序和分析。本发明具有操作简单、结果准确、直观实用等特点。本发明方法用于中华金叶榆叶色差异基因研究。
【专利说明】中华金叶榆叶色性状相关的SRAP分子标记方法及应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种SRAP分子标记方法及应用。
【背景技术】
[0002]在园林绿化中，彩叶树种具有色彩鲜艳、观赏期长、易于形成大色块景观的特点，其丰富的园林景观层次，弥补了城市色彩单调、缺乏季相变化的缺憾。各国对于彩叶植物在园林上的应用倍加重视。近百年来，国外发达国家在彩叶植物品种的选育和栽培方面做了大量工作。在德国，应用于城市园林中的常色叶树种共有64种，分属于17种，35亚种或杂交种，且色彩斑斓，配置得当，营造出优美的园林景观效果。国内在彩叶植物育种引种方面的工作开始较晚，尚处于起步阶段。目前我国大部分彩叶树种都引自国外，如金叶女贞、红叶石楠等。我国北方地区以北京、大连引入和应用的彩叶植物种类较多。但在辽宁以北的地区，可应用的彩叶木本植物种类则迅速减少。中华金叶榆是由河北省林业科学研究院、石家庄市绿缘达园林工程有限公司培育的彩叶植物新品种。于2004年6月26日通过了河北省科技成果鉴定。成果总体水平为国际先进，2004年11月通过了河北省林木良种认定。中华金叶榆是乔灌皆宜的优良彩叶树种，具有叶片金黄艳丽，树冠丰满，高度抗寒冷、干旱等特点，是我国自主培育成功的彩叶植物新品种。中华金叶榆生长迅速，枝条密集，耐强度修剪，造型丰富，既可培育为乔木，作为园林风景树，又可培育成灌木，广泛应用于绿篱、色带。中华金叶榆根系发达，耐贫瘠，水土保持能力强，除用于城市绿化外，还可大量应用于山体景观绿化中，营造景观生态林和水土保持林。中华金叶榆是我国乡土树种白榆的变种，对寒冷、干旱气候具有极强的适应性。在我国广大的东北、西北地区生长良好，同时有较强的抗盐碱性，在沿海地区可广泛应用。其生长区域北至黑龙江、内蒙古，东至长江以北的江淮平原，西至甘肃、青海、新疆，南至江苏、湖北等省，在我国园林中应用范围较广。
[0003]在金叶榆应用过程中，我们发现其树冠内部和下部叶色偏绿，背光面叶色鲜黄度差，车行道旁的金叶榆整个树冠叶色不均匀，有些环境中其叶片呈现出不同程度的“返祖现象”，从而降低了其观赏价值。产生这些现象的机理目前还不清楚，应采取如何措施、其品种的遗传稳定性及其叶色对环境因素的响应机制等有待进一步的研究。
[0004]cDNA-SRAP是2001年Li和Quiros提出的一种基于PCR的新型分子标记相关序列扩增多态性(sequence-related amplified polymorphism, SRAP)技术，研究还表明 SRAP 也能应用于cDNA差异表达分析。
[0005]cDNA-SRAP的关键技术在其引物的设计。研究表面外显子处于GC含量较高的区域，内含子和其它调控序列处于AT含量较高的区域，根据该基因组基因分布特点，Li和Quiros开发出SRAP标记方法,该标记方法使用两条基于GC含量闻的外显子区域和AT含量高的内含子及调控区域的随机引物对基因组进行扩增，从而产生基于序列变异和基于内含子长度变化的显性和共显性标记，值得一提的是，SRAP产生的共显性标记的效率远大于其它标记技术(例如AFLP)，而共显性标记有助于分子标记辅助育种。另外一个显著特点是cDNA-SRAP产生的差异片段大多和性状有关，可以看成是潜在的功能基因。cDNA-SRAP是一种无需任何序列信息即可进行差异表达研究的新技术，该技术使用一条结合在外显子区的固定引物和一条结合在内含子、调控区及间隔区对模板cDNA进行扩增，研究表明一般外显子处于富含GC的区域染色体中，这样用CCGG序列就有可能特异扩增出包含这些组分的序列。
[0006]cDNA-SRAP技术开发以来，目前已经在水稻、甘蓝、甜瓜等植物上得到应用。Li等利用SRAP技术对花椰菜与花茎甘蓝的杂交双二倍体的mRNA进行反转录后进行扩增，用48对引物组合标记88个cDNA样品，得到281个多态性条带。卢泳全等应用SRAP技术对大米草的耐盐性状进行差异显示研究，鉴定出一个与水稻的β -1,3-葡聚糖酶基因有30%相似性的差异片段。马爱芬等选用培育7年的重组自交系群体(RILs)，利用cDNA-SRAP法进行了差异显示研究，996对SRAP引物组合扩增出2100条带，2次扩增重复率为65.2%，其中在黄黑籽材料之间重复稳定出现的差异片段有12条，发现2个片段分别与拟南芥的NAD+ADP核糖转移酶及小肽转移蛋白3具有很高的同源性。但还没有cDNA-SRAP技术在筛选分析在叶色差异表达基因方面应用。
【发明内容】
[0007]本发明的目的在于提供一种中华金叶榆叶色性状相关的SRAP分子标记方法及应用。
[0008]本发明中华金叶榆叶色性状相关的SRAP分子标记方法，按以下步骤进行:
[0009]一、中华金叶榆不同叶色叶片采集和叶色标定:
[0010]选择10株树龄相同且健康的中华金叶榆植株，分别标号为I~10，叶色标定采用国际色彩标准色板比对，选取相同色值的健康幼嫩叶片，从每株上采集#FFD700金色叶片和#228B22森林绿色叶片，立即密封低温保存；
[0011]二、分别提取每株中华金叶榆植株上#FFD700金色叶片和#228B22森林绿色叶片的总RNA ；
[0012]三、RNA浓度检测:
[0013]采用微量核酸蛋白检测仪检测RNA浓度，用无RNase的ddH20平衡样本间的RNA使其浓度相同，均为50ng/l.! 1，取等量的I~10株的#FFD700金色叶片的RNA构建金色叶片RNA混合池，取等量的I~10株的#228B22森林绿色叶片的RNA构建绿色叶片RNA混合池；
[0014]四、cDNA-SRAP扩增差异片段:
[0015]a、第一链cDNA的合成:采用M-MLV逆转录酶，分别将金色叶片RNA混合池和绿色叶片RNA混合池中的RNA反转录成cDNA，产物用无菌ddH20稀释5倍，于一 20°C保存备用；
[0016]b、cDNA的SRAP扩增、PCR产物电泳及检测:
[0017]用25个上游引物和25个下游引物进行随机组合，对2个cDNA混合池进行PCR扩增； [0018]PCR 反应体系:10 X buffer 1.2 μ L, Mg2ISnmoir1I μ L，上游引物 Snmoir1I μ L，下游引物 Snmoir1I μ L, dNTP2nmolL_12 μ L, Taq DNA 聚合酶 0.5U0.5 μ L，第一链 cDNA 稀释产物I μ L，加水至12yL;
[0019]PCR 扩增条件为:94°C 预变性 5min，94°C lmin-35 °C lmin-72 °C lmin5 个循环，94°C lmin-50°C lmin-72°C lmin35 个循环，72°C延伸 lOmin，4°C终止反应。
[0020]从随机组合的100对引物的PCR反应结果选择差异条带进行克隆；
[0021]五、差异片段的回收、测序和分析。
[0022]利用上述SRAP分子标记方法进行中华金叶榆叶色差异基因研究。
[0023]本发明的有益效果:
[0024](I)本发明利用国际色彩标准色板比对金叶榆叶色，能有有效避免误差，实现色彩的标准化，为筛选出来的叶色相关基因更有说服力。
[0025](2)采用本发明采用一套植物材料的不同颜色叶片构建成同一色系的混合池，该混合池除了叶色颜色性状不同，其余性状完全相同，能够有效的排出其他性状差异干扰，保证结果的准确性。
[0026](3)本发明具有操作简单、结果准确、直观实用等特点，可以促进cDNA-SRAP技术在叶色相关性状分析上准确、快速、简便地应用，同时应用该筛选方法，对分析叶色相关基因，发现新基因具有重要意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0027]图1为实施例2中华金叶榆两种叶色的扩增结果【具体实施方式】 [0028]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0029]实施例1:中华金叶榆叶色性状相关SRAP分子标记引物筛选
[0030]本实施例所用的中华金叶榆为商业途径购买得到。
[0031]一、中华金叶榆不同叶色叶片采集和叶色标定:
[0032]选择10株树龄相同且健康的中华金叶榆植株，分别标号为I~10，叶色标定采用国际色彩标准色板比对，选取相同色值的健康幼嫩叶片，从每株上采集#FFD700金色叶片和#228B22森林绿色叶片，立即密封低温保存；
[0033]二、分别提取每株中华金叶榆植株上#FFD700金色叶片和#228B22森林绿色叶片的总RNA，总RNA的提取方法采用改良Trizol法，具体方法如下:
[0034]A、取0.2g中华金叶榆叶片，去掉叶柄和中脉，在液氮中研磨，加入1ml Trizol后匀浆；
[0035]B、匀衆后室温静置5min,于12000转/min、4°C离心5min ；
[0036]C、将上清液转移至1.5ml离心管中，加入氯仿，氯仿的体积为上清液体积的1/5，震荡混匀，室温静置15min ；
[0037]D、于12000转/min、4°C离心15min，将上清转移至另一离心管中，加入等体积的异丙醇，室温静置IOmin ；
[0038]E、于12000转/min、4°C离心10min，向沉淀中加入1ml的体积浓度75%的乙醇溶液洗漆沉淀，于12000转/min、4°C离心5min ；
[0039]F、弃上清，保留沉淀，干燥，溶解于30~50 μ I的DEPC处理水中；
[0040]三、RNA浓度检测:
[0041]采用微量核酸蛋白检测仪检测RNA浓度，用无RNase的ddH20平衡样本间的RNA使其浓度相同，均为50ng/l.! 1，取等量的I~10株的#FFD700金色叶片的RNA构建金色叶片RNA混合池，取等量的I~10株的#228B22森林绿色叶片的RNA构建绿色叶片RNA混合池；
[0042]四、cDNA-SRAP扩增差异片段:
[0043]1、第一链cDNA的合成:采用M-MLV逆转录酶(按照M-MLV逆转录酶说明书进行操作)，分别将金色叶片RNA混合池和绿色叶片RNA混合池中的RNA反转录成cDNA，产物用无菌ddH20稀释5倍，于一 20°C保存备用；
[0044]2、cDNA的SRAP扩增、PCR产物电泳及检测:
[0045]用表1中的25个上游引物和25个下游引物进行随机组合，对2个cDNA混合池进行PCR扩增。
[0046]PCR 反应体系:10 X buffer 1.2 μ L, Mg2ISnmoir1I μ L，上游引物 Snmoir1I μ L，下游引物 Snmoir1I μ L, dNTP2nmolL_12 μ L, Taq DNA 聚合酶 0.5U0.5 μ L，第一链 cDNA 稀释产物I μ L，加水至12yL;
[0047]PCR 扩增条件为:94°C 预变性 5min，94°C lmin-35 °C lmin-72 °C lmin5 个循环，94°C lmin-50°C lmin-72°C lmin35 个循环，72°C延伸 lOmin，4°C终止反应。
[0048]从随机组合的100对引物的PCR反应结果选择差异条带进行克隆。
[0049]表1
[0050]
【权利要求】
1.中华金叶榆叶色性状相关的SRAP分子标记方法，其特征在于该方法按以下步骤进行: 一、中华金叶榆不同叶色叶片采集和叶色标定: 选择10株树龄相同且健康的中华金叶榆植株，分别标号为1~10，叶色标定采用国际色彩标准色板比对，选取相同色值的健康幼嫩叶片，从每株上采集#FFD700金色叶片和#228B22森林绿色叶片，立即密封低温保存； 二、分别提取每株中华金叶榆植株上#FFD700金色叶片和#228B22森林绿色叶片的总RNA ； 三、RNA浓度检测: 采用微量核酸蛋白检测仪检测RNA浓度，用无RNase的ddH20平衡样本间的RNA使其浓度相同，均为50ng/y 1，取等量的I~10株的#FFD700金色叶片的RNA构建金色叶片RNA混合池，取等量的1~10株的#228B22森林绿色叶片的RNA构建绿色叶片RNA混合池； 四、cDNA-SRAP扩增差异片段: a、第一链cDNA的合成:采用M-MLV逆转录酶，分别将金色叶片RNA混合池和绿色叶片RNA混合池中的RNA反转录成cDNA，产物用无菌ddH20稀释5倍，于一 20°C保存备用； b、cDNA的SRAP扩增、PCR产物电泳及检测: 用25个上游引物和25个下游引物进行随机组合，对2个cDNA混合池进行PCR扩增；PCR 反应体系:10 X buffer 1.2 μ L, Mg2Mnmoir1I μ L,上游引物 Snmoir1I μ L，下游引物 Snmoir1I μ L, dNTP2nmolL_12 μ L, Taq DNA 聚合酶 0.5U0.5 μ L，第一链 cDNA 稀释产物1 μ L,加水至12 μ L ; PCR 扩增条件为:94 V 预变性 5min，94 V lmin-35 V lmin-72 V lmin5 个循环，94°C lmin-50°C lmin-72°C lmin35 个循环，72°C延伸 lOmin，4°C终止反应。 从随机组合的100对引物的PCR反应结果选择差异条带进行克隆； 五、差异片段的回收、测序和分析； 步骤四所述25个上游引物和25个下游引物序列如下:
2.根据权利要求1所述的中华金叶榆叶色性状相关的SRAP分子标记方法，其特征在于步骤二中总RNA的提取方法采用改良Trizol法，具体方法如下:A、取0.2g中华金叶榆叶片,去掉叶柄和中脉,在液氮中研磨,加入1ml Trizol后匀衆； B、匀浆后室温静置5min，于12000转/min、4°C离心5min； C、将上清液转移至1.5ml离心管中，加入氯仿，氯仿的体积为上清液体积的1/5，震荡混匀，室温静置15min ； D、于12000转/min、4°C离心15min,将上清转移至另一离心管中，加入等体积的异丙醇，室温静置IOmin ；E、于12000转/min、4°C离心10min，向沉淀中加入1ml的体积浓度75%的乙醇溶液洗漆沉淀，于12000转/min、4°C离心5min ； F、弃上清，保留沉淀，干燥，溶解于30~50 μ I的DEPC处理水中。
3.利用权利要求1所述SRAP分子标记方法进行中华金叶榆叶色差异基因研究。
【文档编号】C12Q1/68GK103993098SQ201410261198
【公开日】2014年8月20日 申请日期:2014年6月13日 优先权日:2014年6月13日
【发明者】王云云, 张兴, 高宇, 孙力, 肖宇, 关向军 申请人:黑龙江省科学院大庆分院