病毒诱导的花叶滇山茶的叶色调控方法
【专利摘要】本发明公开了一种病毒诱导的花叶滇山茶的叶色调控方法，属于观赏作物栽培【技术领域】。具体步骤为：（1）剪取病毒诱导的不同花叶滇山茶植株的叶片放入研钵中，加少量0.01M磷酸盐缓冲液，研碎成汁液。然后用医用注射器取少量汁液，注射接种至‘宝珠茶’滇山茶的叶片主脉中；最后根据接种后的叶片性状，筛选携带病毒的温和毒株和弱毒株的滇山茶植株；（2）将温和毒株接种至滇山茶的普通植株，诱导花叶产生，增强观赏性；或将弱毒株接种至滇山茶的普通植株，利用交叉保护原理，使其免受强毒株和温和毒株的侵染而保持普通叶色。该方法操作简单，可根据种植者的喜好，将普通滇山茶的叶色调控为花叶或维持普通叶色。
【专利说明】病毒诱导的花叶滇山茶的叶色调控方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种病毒诱导的花叶滇山茶的叶色调控方法，属于观赏作物栽培【技术领域】。
【背景技术】
[0002]彩叶植物因其具有叶色艳丽、观赏期长、容易造景等优势而一直倍受人们喜爱，花叶植物是其重要组成部分。近年来，病毒诱导的花叶观赏植物日益增多，然而，对于病毒诱导的花叶调控研究还十分薄弱，不利于病毒诱导的花叶观赏植物的科学栽培与繁育。
[0003]滇山茶{Camellia reticulata Lindl.)属山茶科常绿乔木,另ll名“云南山茶花”、“大茶花”，是中国特有种、国家二级重点保护植物、云南省八大名花之首、昆明市市花。至今，滇山茶已有1500多年的栽培历史，先后被引种到世界各国，以树体高大、花大繁茂、寿命长而驰名中外，素有“云南山茶甲天下”的美誉。滇山茶的栽培品种约123个，但彩叶品种并不多见。[0004]调查发现，滇山茶的部分名贵品种为病毒诱导的花叶品种，如‘一品红’、‘昆明春’、‘大叶桂’、‘早桃红’、‘花叶宝珠’、‘大玛瑙’、‘张家茶’、‘玛瑙紫袍’、‘银粉牡丹’、‘狮
子头’、‘紫袍’、‘节节高’等。病毒诱导的花叶是病毒入侵和寄主防御形成的一种平衡关系。一些观赏价值较高的花叶植物正是由于病毒诱导所致，如‘Aureo-reticulata’金银HLonicera忍冬黄脉花叶病毒(HVCMV)诱导)、‘Tompsonii’ 苘麻
iAeopArasii，芒麻花叶病毒(AbMV)诱导)、‘洒金’桃叶珊瑚japonica)、‘花叶’扶秦{Hibiscus rosa-sinensis)等。可见，病毒诱导的花叶植物可以被人们科学利用。
[0005]多年来，昆明、大理等地的普通种植者将病毒诱导的花叶滇山茶视为名贵品种，并在嫁接繁殖中，作为砧木或者接穗，不断繁殖。但是，人们并不清楚花叶的产生是由于病毒诱导所致，更不清楚花叶的科学调控方法，从而可能带来以下问题:(I)普通植株感染病毒弱毒株之后，可能不表现出任何花叶性状，若将其视为普通植株，以携带病毒温和毒株的花叶滇山茶植株作为砧木或者接穗进行嫁接繁殖，由于交叉保护(植物系统地感染某一病毒的株系后，可以免受同种病毒其它株系侵染的现象)的原因，将不能诱导花叶性状的产生。
(2)若将携带病毒强毒株的花叶滇山茶植株作为砧木或者接穗进行嫁接繁殖，会使普通植株感染强病毒，可能使其生长发育受到较大影响，甚至引起病害。嫁接繁殖的感染率是比较高的:a将病毒诱导的品种用作砧木，而接穗是健康的枝条，砧木中的病毒很有可能传播至健康的接穗中，从而使接穗出现花叶症状，若病毒特性对接穗来说是强毒株，则会表现出病害症状；b将病毒诱导的品种用作接穗，一般而言，是在接穗的花叶性状表现稳定且具有较高的视觉吸引力的前提下，以繁殖更多的花叶品种，不会引起病害。但若在繁殖过程中，接穗死亡，而在死亡之前，病毒已传播至健康的砧木，此后砧木又发育出新的枝条，新枝条由于病毒的存在而呈现花叶性状。若这种现象中，病毒特性对砧木来说是强毒株，则会表现出病害症状。
[0006]为了克服病毒诱导的花叶滇山茶在今后的繁育中可能出现的以上问题，本发明提出了一套系统而科学的关于病毒诱导的花叶滇山茶的叶色调控方法。
【发明内容】
[0007]本发明提供一种关于病毒诱导的花叶滇山茶的叶色调控方法，可根据种植者的喜好，将普通滇山茶的叶色调控为花叶或维持普通绿叶，具体步骤如下:
1、根据病毒诱导的花叶滇山茶植株的病毒汁液注射接种至普通绿叶滇山茶后的生物学性状，筛选携带病毒温和毒株和弱毒株的滇山茶植株；
首先剪取病毒诱导的花叶滇山茶的1-5片花叶叶片放入研钵中，加5-15mL的0.01 M磷酸盐缓冲液，研碎成汁液，静置10-30分钟，然后用医用注射器取l_5mL上清液，注射接种至普通绿叶滇山茶的叶片主脉中；
携带病毒温和毒株和弱毒株的滇山茶植株筛选，是在接种后的20-60天，出现花叶性状且花叶的比例低于植株叶片总数的20%,且在之后持续一年的观测中，花叶性状具有良好的视觉吸引力(观赏性)、具有良好的稳定性(遇到霜冻、干旱等现象之后，绿叶保持正常的前提下，花叶也表现正常，未出叶片枯萎等症状)的视为携带病毒温和毒株的滇山茶植株；若在接种后的20-60天，出现的花叶性状在之后持续一年的观测中，视觉吸引力(观赏性)较差，或者不够稳定(如遇到霜冻、干旱等现象之后，绿叶保持正常的前提下，花叶表现出叶片枯萎等症状)，则认为病毒的毒性较强，打破了病毒与植株之间的平衡，视为强毒株，应及时销毁，以免造成植物病害的人为传播。60天后不出现明显的花叶现象的视为携带病毒弱毒株的滇山茶植株。
[0008]2、若种植者希望`得到花叶滇山茶，可将携带温和毒株的滇山茶花叶叶片汁液注射接种至滇山茶的普通植株叶片主脉中，诱导花叶产生；或者采用贴皮法；
3、若种植者希望普通滇山茶保持普通叶色，可将携带弱毒株的滇山茶叶片汁液注射接种至滇山茶的普通植株叶片主脉中，或者采用贴皮法；利用交叉保护原理，使其免受强毒株和温和毒株的侵染，保持普通叶色。
[0009]贴皮法的具体操作如下:从普通滇山茶植株枝条离端部3-5 cm处剥掉宽度3_5mm、长度为10-15 mm的树皮,然后从携带温和毒株的滇山茶植株(或者携带弱毒株的滇山茶植株)的花叶枝条上端处剥取宽度3-5 mm、长度为10-15 mm的树皮，最后将从携带温和毒株的滇山茶植株(或者携带弱毒株的滇山茶植株)的花叶枝条剥取的树皮贴合到普通滇山茶植株枝条的树皮剥离处，树皮贴合的方向和剥取时的方向一致，并用嫁接塑料条包扎，普通滇山茶植株上部枝条出现花叶性状后，去除包扎，诱导花叶产生(或者利用交叉保护原理，使其免受强毒株和温和毒株的侵染，保持普通叶色)。
[0010]本发明方法中，病毒诱导的花叶滇山茶的叶片识别性状为:枝条端部的部分叶片(不超过叶片植株叶片总数的40%)为花斑叶(图1-A)或黄化叶(图1-B)，其中花斑叶呈现出大小及形状不规则的浅黄色斑驳，斑驳中还有不同程度的深绿、浅绿或黄绿色绿岛组织，黄化叶则呈现出比较均一的浅黄色。目前，昆明、大理等滇山茶主要栽培区的常见病毒诱导的花叶品种有‘一品红’、‘昆明春’、‘大叶桂’ ‘早桃红’、‘花叶宝珠’、‘大玛瑙’、‘张家茶’、‘玛瑙紫袍’、‘银粉牡丹’、‘狮子头’、‘紫袍’、‘节节高’。
[0011]本发明方法中，为了证明注射处理之后叶片中病毒的存在，进而解释温和毒株诱导的花叶产生或弱毒株交叉保护对绿叶的保持，可采用超薄切片观测进行验证:取花叶症状明显的滇山茶的新鲜叶片，切成0.5cm X Icm的小块，用体积百分比浓度为3.5%戊二醛溶液前固定，质量百分比浓度为1%锇酸溶液后固定，经酒精、丙酮逐级梯度脱水，再用环氧树脂618渗透、包埋，之后半薄切片，光镜定位，修块，使用Leica-R型超薄切片机进行切片，经柠檬酸铅-醋酸铀双染色后，在JEM-1Ol I透射电镜下进行观察，本发明中，常见的花叶品种中的病毒为粒体结构，直径为30-50nm，因此，若能在注射处理后滇山茶中利用超薄切片法观测到上述形态的病毒，则可证实病毒的存在对温和毒株诱导的花叶产生或弱毒株交叉保护对绿叶的保持。
[0012]本发明的优势在于:(I)有助于人们认识到曾经被忽视的病毒诱导的花叶滇山茶的花叶现象，诱导花叶性状产生的植物病毒存在强毒株、温和毒株和弱毒株之分；(2)在技术上，本发明可以通过比较直观的方法，将病毒的强毒株、温和毒株和弱毒株区分开来；
(3)带来的有益效果是:将携带强毒株的植株销毁，避免不必要的人为扩散，从而引起更大的病害发生；将温和毒株用来侵染正常植株，诱导花叶性状稳定、观赏性增加的花叶植株；将弱毒株用来保护正常植株，使绿叶植株不受温和毒株和强毒株的侵染，从而保持绿叶状态。该发明操作简单，可根据种植者的喜好，将普通滇山茶的叶色调控为花叶或维持普通绿叶，对于病毒诱导的花叶滇山茶的科学栽培与繁育来说，极为适用。
【专利附图】
【附图说明】
[0013]图1是花叶滇山茶的花斑叶和黄花叶示意图；图中A是花斑叶；B是黄化叶；
图2是本发明中‘花叶宝珠’滇山茶的病毒形态电镜图；
图3是本发明中注射处理后‘花叶宝珠’滇山茶的病毒形态电镜图；
图4是本发明中‘一品红’滇山茶的病毒形态电镜图；
图5是本发明中‘宝珠茶’滇山茶感染病毒强毒株的病毒形态电镜图；
图6是本发明中‘早桃红’滇山茶的病毒形态电镜图。
【具体实施方式】
[0014]下面通过实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明的保护范围不局限于所述内容，实施例中使用试剂如无特殊说明，均为常规市售或按常规方法配制的试剂。
[0015]实施例1:
剪取病毒诱导的花叶滇山茶品种‘花叶宝珠’的3片花叶叶片放入研钵中，加IOmL的
0.01 M磷酸盐缓冲液，研碎成汁液，静置20分钟，然后用医用注射器取3mL上清液，注射接种至‘宝珠茶’滇山茶的叶片主脉中。36天后，经注射接种的‘宝珠茶’滇山茶上部枝条出现花叶性状，花叶的比例低于植株叶片总数的20%,且在之后持续一年的观测中，花叶性状具有较高的视觉吸引力，且遇到霜冻和干旱时表现正常，则最初使用的病毒诱导的花叶滇山茶品种‘花叶宝珠’被视为携带温和毒株的滇山茶植株。
[0016]因种植者甲更喜欢花叶滇山茶，所以将携带温和毒株的‘花叶宝珠’叶片汁液注射接种至普通滇山茶一‘宝珠茶’叶片主脉中，48天后，诱导花叶产生(B卩‘花叶宝珠’)，从而增强观赏性。
[0017]本实施例中，通过超薄切片法，利用透射电镜观测了携带温和毒株的‘花叶宝珠’滇山茶叶片中的病毒形态(图2)，结果显示:花叶中的病毒为粒体结构，直径为30-50nm，可能为雀麦花叶病毒科或黄症病毒科的病毒(ssRNA)。
[0018]本实施例中，为了证明注射处理之后花叶的产生是由病毒诱导所致，采用超薄切片利用透射电镜观测了注射处理之后获得的‘花叶宝珠’滇山茶叶片中的病毒形态(图3)，结果显示:花叶中的病毒为粒体结构，直径为30-50nm，与携带温和毒株的‘花叶宝珠’滇山茶叶片中的病毒形态一致，证实了本实施例中的花叶发生由通过注射传播的病毒诱导所致。
[0019]实施例2:
剪取病毒诱导的花叶滇山茶品种‘一品红’的3片花叶叶片放入研钵中，加12mL的0.01M磷酸盐缓冲液，研碎成汁液，静置25分钟，然后用医用注射器取3mL上清液，注射接种至‘宝珠茶’滇山茶的叶片主脉中。45天后，经注射接种‘宝珠茶’滇山茶出现的花叶性状在之后持续一年的观测中，视觉吸引力(观赏性)较差，且遇霜冻、干旱时，绿叶保持正常的前提下，花叶表现出叶片枯萎等症状，则病毒诱导的花叶滇山茶品种‘一品红’所携带的病毒的毒性较强，对‘宝珠茶’滇山茶来说属于强毒株，不能形成植株与病毒之间的平衡，则应及时销毁，避免不必要的人为扩散，从而引起更大的病害发生。
[0020]本实施例中，通过超薄切片法，利用透射电镜观测了携带强毒株的‘一品红’滇山茶叶片中的病毒形态(图4)，结果显示:花叶中的病毒为粒体结构，直径40-50nm，且单位视野中的病毒数较多。
[0021]本实施例中，为了证明注射‘宝珠茶’滇山茶后，花叶产生并有枯萎表现是由强病毒感染所致，采用超薄切片利用透射电镜观测了注射处理之后获得的花叶中的病毒形态(图5)，结果显示:花叶中的病毒为粒体结构，直径为40-50nm，且单位视野中的病毒数较多，与携带强毒株的‘一品红’滇山茶叶片中的病毒形态一致，证实了本实施例中的花叶发生由通过注射传播的强毒株感染所致。
`[0022]实施例3:
剪取病毒诱导的花叶滇山茶品种‘早桃红’的5片花叶叶片放入研钵中，加IOmL的0.01M磷酸盐缓冲液，研碎成汁液，静置30分钟，然后用医用注射器取5mL上清液，注射接种至‘宝珠茶’滇山茶的叶片主脉中。55天后，经注射接种‘宝珠茶’滇山茶未出现明显的花叶性状，且在之后持续一年的观测中，花叶性状具有较高的视觉吸引力，且遇到霜冻和干旱时表现正常，则病毒诱导的花叶滇山茶品种‘早桃红’被视为携带弱毒株的滇山茶植株。
[0023]因种植者丙更喜欢普通滇山茶维持普通绿叶，所以将携带弱毒株的‘早桃红’叶片汁液注射接种至普通滇山茶一‘大桃红’叶片主脉中，利用交叉保护原理，使其免受强毒株和温和毒株的侵染而保持普通叶色。
[0024]在注射处理后一年的观测中，‘大桃红’的叶片始终保持绿色，且通过注射实施例1中‘花叶宝珠’滇山茶携带的温和毒株和实施例2中‘一品红’携带的强毒株后，大桃红’的叶片仍然保持绿色，说明本实施例中弱毒株交叉保护获得成功。
[0025]本实施例中，通过超薄切片法，利用透射电镜观测了携带弱毒株的‘早桃红’滇山茶叶片中的病毒形态，但由于病毒的浓度较低，暂未观测到病毒。
[0026]本实施例中，为了证明注射处理之后，‘大桃红’叶片中有病毒弱毒株的存在,采用超薄切片利用透射电镜观测了注射处理之后获得的‘大桃红’滇山茶叶片中的病毒形态(图6)，结果显示:花叶中的病毒为粒体结构，直径为50-100nm，单位视野观测到的病毒数较少，说明病毒的浓度较低。
[0027]实施例4:
剪取病毒诱导的花叶滇山茶品种‘玛瑙紫袍’的I片花叶叶片放入研钵中，加5mL的
0.01 M磷酸盐缓冲液，研碎成汁液，静置15分钟，然后用医用注射器取3mL上清液，注射接种至‘宝珠茶’滇山茶的叶片主脉中。48天后，经注射接种的‘宝珠茶’滇山茶上部枝条出现花叶性状，花叶的比例低于植株叶片总数的20%，且在之后持续一年的观测中，花叶性状具有较高的视觉吸引力，且遇到霜冻和干旱时表现正常，则最初使用的病毒诱导的花叶滇山茶品种‘玛瑙紫袍’被视为携带温和毒株的滇山茶植株。
[0028]因种植者甲喜欢花叶滇山茶，采用贴皮法诱导花叶，用经高压灭菌(温度120°C，压强=0.2 MPa，时间20 min)处理过的手术刀从普通滇山茶品种‘大银红’植株上部枝条离端部5cm处剥掉宽度5_ (方向与枝条方向垂直)、长度为15_ (方向与枝条方向一致)的树皮；用经高压灭菌处理过的手术刀和镊子从携带温和毒株的‘玛瑙紫袍’植株上部花叶枝条剥取树皮，树皮的大小规格与从普通滇山茶植株上部枝条剥掉的树皮大小规格完全相同、方向一致；用经高压灭菌处理的镊子夹取从携带温和毒株的‘玛瑙紫袍’植株上部花叶枝条剥取树皮，保持上下方向不变，贴合到‘大银红’滇山茶植株上部枝条的树皮剥离处，然后，用嫁接塑料条将贴合的树皮包扎好；贴皮处理后第28天，‘大银红’滇山茶植株上部枝条出现花叶现象，诱导花叶产生(即‘花叶大银红’)，从而增强观赏性，树皮贴合处愈合，拆掉嫁接塑料条的包 扎。
【权利要求】
1.一种病毒诱导的花叶滇山茶的叶色调控方法，其特征在于按如下步骤进行: (1)剪取病毒诱导的花叶滇山茶的1-5片花叶叶片放入研钵中，加5-15mL的0.01 M磷酸盐缓冲液，研碎成汁液，静置10-30分钟，然后用医用注射器取l_5mL上清液，注射接种至普通绿叶滇山茶的叶片主脉中； (2)在接种后的20-60天，普通绿叶滇山茶出现花叶的比例低于植株叶片总数的20%，且花叶性状在之后持续一年的观测中表现出较高的视觉吸引力和性状稳定性，则视最初使用的病毒诱导的花叶滇山茶为携带病毒温和毒株的滇山茶植株，60天后不出现明显的花叶现象的，则视最初使用的病毒诱导的花叶滇山茶为携带病毒弱毒株的滇山茶植株； (3)若种植者要培育花叶滇山茶，将携带温和毒株的滇山茶植株的温和毒株接种至普通滇山茶植株中，诱导花叶产生；若种植者要保持普通滇山茶的普通叶色，将携带弱毒株的滇山茶植株的弱毒株接种至普通滇山茶植株中，利用交叉保护原理，使其免受强毒株和温和毒株的侵染，保持普通叶色。
2.根据权利要求1所述病毒诱导的花叶滇山茶的叶色调控方法，其特征在于:步骤(3)中温和毒株或弱毒株接种至普通滇山茶植株中是指将携带温和毒株的滇山茶植株的花叶叶片汁液或将携带弱毒株的滇山茶植株的花叶叶片汁液注射接种至普通滇山茶的植株叶片主脉中，诱导花叶产生或保持普通叶色。
3.根据权利要求1所述病毒诱导的花叶滇山茶的叶色调控方法，其特征在于:步骤(3)中温和毒株或弱毒株接种至普通滇山茶植株中是采用贴皮法，具体操作为若种植者要诱导花叶滇山茶，从普通滇山茶植株枝条离端部3-5 cm处剥掉宽度3-5 _、长度为10-15 mm的树皮，然后从携带温和毒株的滇山茶植株的花叶枝条上端处剥取宽度3-5 mm、长度为10-15mm的树皮，最后将从携带温和毒株的滇山茶植株的花叶枝条剥取的树皮贴合到普通滇山茶植株枝条的 树皮剥离处，树皮贴合的方向和剥取时的方向一致，并用嫁接塑料条包扎，普通滇山茶植株上部枝条出现花叶性状后，去除包扎，诱导花叶产生；若种植者要保持普通滇山茶的普通叶色，使用上述贴皮方法，利用交叉保护原理，使其免受强毒株和温和毒株的侵染，保持普通叶色。
【文档编号】A01G1/06GK103828613SQ201410096858
【公开日】2014年6月4日 申请日期:2014年3月17日 优先权日:2014年3月17日
【发明者】郑伟, 徐晓丹, 常青 申请人:昆明理工大学