铁皮石斛优质种苗自然光培养一次成苗快速繁殖方法与流程

本发明属于通过组织培养技术的植物再生技术，具体涉及一种铁皮石斛优质种苗自然光培养一次成苗快速繁殖方法，以及所采用的一次成苗培养基。

背景技术：

铁皮石斛是兰科石斛属附生植物，自古以来就是公认的名贵中草药。野生铁皮石斛生长发育所需的环境条件极为苛刻，生长缓慢，繁殖率极低，而人为掠夺性采挖已导至野生铁皮石斛资源近于枯竭。目前的繁殖方法主要分两类，一类是组织快繁。组培苗栽培前应先进行14～21天的炼苗，具体措施是将组培苗移至炼苗房，使其在开放变化的环境中逐渐适应自然环境，待组培苗叶色浓绿时即可出瓶种植。出瓶前先将瓶盖打开，让瓶苗在室外空气中放置2～3天，让其适应自然温湿度。然后进行洗苗，洗苗时将带有培养基的幼苗轻轻取出，置于盆中清洗，污染苗和裸根苗或少根苗应分开放置。组培苗先用自来水清洗，主要是应洗掉琼脂，以免琼脂发霉引起烂根，而后再用清水漂洗一下。洗苗时最好根据苗的大小和优劣同步进行分级，以便栽培、管理，提高组培苗的成活率并使其生长整齐。另一类是分株扦插，主要原理是分株时选择1年生或2年生、色泽嫩绿、健壮、萌发多、根系发达及无病虫害的植株作种株，剪去枯枝、断枝、老枝及过长的须根，将株丛切开，分成小丛，每丛带有叶的茎株5～7根，即可种植。

组培繁育铁皮石斛种苗的技术虽然已经获得成功，但铁皮石斛种苗普遍存在培养周期长、污染率高、操作复杂、生产成本较高的等问题，从而制约着铁皮石斛产业的快速发展。如公开号为CN101564008A、名称为“一种铁皮石斛无菌苗的无激素培养及快速繁殖方法”的国内发明专利公开了一种铁皮石斛无菌苗的无激素培养及快速繁殖方法，内容包括铁皮石斛种子的无菌萌发，原球茎及幼苗的形成与保存，无菌苗的生根、增殖和壮苗培养，无菌苗的练苗和移栽等过程。但该技术存在的缺点是原球茎及幼苗的诱导过程涉及红光、绿光、无光、黄光和蓝光的使用，因此过程非常复杂，而且诱导的过程很难控制，不利于于大规模工业化生产应用

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是铁皮石斛种苗普遍存在的培养周期长、污染率高、操作复杂、生产成本较高的问题等问题，本发明通过利用高萌发率的种子、营养丰富的培养基、全自然光培养室实现铁皮石斛种苗一次成苗大规模生产，具有低成本，高效率的特点，是种苗的规模化生产的高新生物技术，可促进铁皮石斛产业的可持续发展。

为解决上述问题，本发明提出的技术方案是一种铁皮石斛优质种苗自然光培养一次成苗快速繁殖方法，包含以下步骤：

(1)准备铁皮石斛材料；

(2)建造全自然光培养室

使用透光材料，并配备遮阳系统、降温设备和培养架，通过遮阳系统确保培养室内顶层培养架的光照强度为3000～5000Lux，光照强度随着培养架的层数下移而降低，底层培养架的光照强度为100～1000Lux，降温设备可将玻璃培养室的温度控制在20～30℃，培养架长度可根据培养室的大小而定；

(3)制作种子悬浮液

于铁皮石斛种质圃中，选取生长健壮、萌芽率高、抗逆性、抗病虫害强的健康株系，于开花季节进行人工授粉并套袋，选取一定范围果龄的蒴果为外植体，进行消毒、清洗和除水，接着用无菌手术刀切开蒴果，将蒴果内的种子全部洗脱至一装有无菌水的瓶中，每个蒴果的种子对应洗脱至一个瓶，制成种子悬浮液，对每个蒴果种子悬浮液进行种子密度的检测，根据每瓶悬浮液种子浓度用无菌水进一步稀释成种子浓度为10-15粒/毫升的接种用的种子悬浮液；

(4)无菌播种

无菌条件下用移液枪吸取接种用的种子悬浮液2毫升至装有150毫升的一次成苗固体培养基的兰花培养瓶中，每瓶铁皮石斛的种子数量20-30粒；

(5)一次成苗培养

原球茎诱导培养：将种子悬浮液均匀分布培养基表面上，将此培养瓶放置全自然光培养室中的培养架上，保持其光照强度在100～1000Lux，保持培养室温度在(26±2)℃，此条件下培养60～90天，种子萌发形成原球茎，原球茎长出根和叶片；

小苗培养：将小苗移动至培养架的合适层，加强其自然光照培养，促进小苗生长，此时期培养时间为90天，培养温度为(26±2)℃，小苗长成大苗，苗高3～5cm，3～5片～叶片，3～5条根须，根长1～3厘米；大苗基部萌发出1-2个新苗，形成丛生苗；

大苗培养：将大苗移动至培养架的顶层，在高自然光光强下进行培养，既可以促进大苗的生长，又可以达到炼苗的效果，此时期培养60天，培养温度为(26±2)℃，此时铁皮石斛苗每丛2－5苗，苗高5～8cm，有4-6节，4片以上叶片，3条以上根，茎粗2.0mm以上，达到出苗的标准；

(6)试管苗的移栽

移栽时，从培养瓶中取出生根苗，洗净附着的培养基后，用千分之一的高锰酸钾溶液浸泡5min，然后将生根苗晾干至根变白，种植基质采用已经消毒处理的树皮，注意保持适宜湿度和温度，置于阴凉通风处栽培，30天左右成活后的植株能产生新的根系，此时可移入大棚进行正常水、肥、药管理。

进一步，步骤(2)中，假设培养架为四层结构，则顶层往下的第二、三层培养架光照强度为1000～3000Lux。

作为优选，步骤(3)中所述一定范围果龄为120天。

进一步，步骤(3)中所述消毒、清洗和除水具体过程为：在70％酒精中浸泡30秒，再用0.1％升汞溶液消毒15～20分钟，无菌水冲洗4～5次，于超净工作台上无菌条件下用无菌滤纸吸干蒴果表面的水分。

进一步，上述步骤(3)中所述种子密度的检测是指对每个蒴果种子悬浮液进行种子密度的检测，具体过程为在摇匀情况下用无菌移液枪吸取20微升于生物显微镜下计算其种子数量，每瓶种子悬浮液重复取10次计算其平均每毫升种子数。

另外，本发明还提供一种上述铁皮石斛优质种苗自然光培养一次成苗快速繁殖方法中使用的一次成苗培养基，其包含以下成分：每升含花宝1号1～2g，花宝2号1～2g，蛋白胨0.5～2g，土豆泥40～80g，香蕉泥50～100g，苹果泥10～20g，活性碳500～1000mg，肌醇80～120mg，甘氨酸1.5～2.5mg，盐酸硫胺素(VB1)0.05～0.2mg，盐酸吡哆醇(VB6)0.4～0.8mg，烟酸0.4～0.8mg，6-苄基嘌呤0.05～0.1毫克，萘乙酸(NAA)0.2～2mg，蔗糖15～30g，琼脂6～7g，pH 5.4-5.6。

与现有技术相比，本发明的优势在于：

1，可以一次成苗，不需转接人工，加上采用全自然光培养室，根据不同生长阶段对光的需求不同而移动培养的位置，生产出来的种苗健壮易成活，移栽前不需要经过专门的炼苗处理，可直接出瓶移栽，显著降低了生产成本。

2，利用高萌发率的种子、营养丰富的培养基、全自然光培养室进行铁皮石斛种苗一次成苗大规模生产，试管苗无病虫生长健壮，种苗具有品质好、抗性强、生长迅速、便于生产管理和降低生产成本等优势，可以实现定时、定质、定量提供规格划一、整齐一致的优质铁皮石斛试管苗以满足市场需求。

附图说明

图1为本发明的流程图。

具体实施方式

现结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。

本发明的流程图如图1所示，主要由6个步骤组成。依次为准备铁皮石斛材料，建造全自然光培养室，制作种子悬浮液，无菌播种，一次成苗培养和试管苗的移栽。其中一次成苗培养又进一步分为原球茎诱导培养，小苗培养和大苗培养三个阶段。

为使得本领域的普通技术人员可以更好地理解本发明，现提供一个具体的实施例，如下：

1.准备铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)材料。

2.全自然光培养室建造：使用钢化玻璃建成透光的培养室，配备遮阳系统、降温设备、培养架。遮阳系统包括内外遮阳网，通过调控内外遮阳网使培养室内顶层培养架的光照强度为3000～5000Lux，顶层往下的第二、三层培养架光照强度为1000～3000Lux，底层即顶层下第四层光照强度100～1000Lux。降温设备采用冷暖两用空调，可将玻璃培养室的温度控制在20～30℃。培养架宽为60厘米，高为200厘米，离地面10厘米为第四层，层距60厘米，共四层，培养架长度可根据培养室的大小而定。

3.种子悬浮液的制作：于铁皮石斛种质圃中，选取生长健壮、萌芽率高、抗逆性、抗病虫害强的健康株系，于开花季节进行人工授粉并套袋，选取果龄为120天的蒴果为外植体，在70％酒精中浸泡30秒，再用0.1％升汞溶液消毒15～20分钟，无菌水冲洗4～5次，于超净工作台上无菌条件下用无菌滤纸吸干蒴果表面的水分。接着用无菌手术刀切开蒴果，将蒴果内的种子全部洗脱至一装有200毫升无菌水的三角瓶中，每个蒴果的种子对应洗脱至一瓶装有200毫升无菌水的三角瓶，制成种子悬浮液。对每个蒴果种子悬浮液进行种子密度的检测，在摇匀情况下用无菌移液枪吸取20微升于生物显微镜下计算其种子数量，每瓶种子悬浮液重复取10次计算其平均每毫升种子数。根据每瓶悬浮液种子浓度用无菌水进一步稀释成种子浓度为10-15粒/毫升的接种用的种子悬浮液。

4.无菌播种：无菌条件下用移液枪吸取接种用的种子悬浮液2毫升至装有150毫升的一次成苗固体培养基的兰花培养瓶中，每瓶铁皮石斛的种子数量20-30粒。一次成苗培养基：每升含花宝1号1.5g，花宝2号1.5g，蛋白胨2g，土豆泥40g，香蕉泥80g，苹果泥10g，活性碳500～1000mg，肌醇100mg，甘氨酸2.0mg，盐酸硫胺素(VB1)0.2mg，盐酸吡哆醇(VB6)0.5mg，烟酸0.5mg，6-苄基嘌呤0.05毫克，萘乙酸(NAA)0.5mg，蔗糖20g，琼脂6g，pH 5.4-5.6。

5.一次成苗培养：

原球茎诱导培养：将种子悬浮液均匀分布培养基表面上，将此培养瓶放置全自然光培养室中的第四层培养架上，保持其光照强度在100～1000Lux，保持培养室温度在(25±2)℃。此条件下培养60～90天，种子萌发形成原球茎，原球茎长出根和叶片，培养温度为(26±2)℃。

小苗培养：将小苗移动至培养架的第二或第三层，加强其自然光照培养，促进小苗生长，此时期培养时间为90天，小苗长成大苗，苗高3～5cm，3～5片～叶片，3～5条根须，根长1～3厘米；大苗基部萌发出1-2个新苗，形成丛生苗，培养温度为(26±2)℃。

大苗培养：将大苗移动至培养架的第一层，在高自然光光强下进行培养，既可以促进大苗的生长，又可以达到炼苗的效果。此时期培养60天，此时铁皮石斛苗每丛2－5苗，苗高5～8cm，有4-6节，4片以上叶片，3条以上根，茎粗2.0mm以上，达到出苗的标准，培养温度为(26±2)℃。

6.试管苗的移栽：移栽时，从培养瓶中取出生根苗，洗净附着的培养基后，用千分之一的高锰酸钾溶液浸泡5min，然后将生根苗晾干至根变白，种植基质采用已经消毒处理的树皮，注意保持适宜湿度和温度，置于阴凉通风处栽培，成活率可达98％以上。30天左右成活后的植株能产生新的根系，此时可移入大棚进行正常水、肥、药管理。

以上所述仅为本发明的一个具体实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。